שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה
21 בפברואר 2021
אנו מציגים שני פרוטוקולי הכתמה שונים עבור NKG2D ליגנד (NKG2DL) זיהוי בלוקמיה מיאלואידית חריפה אנושית (AML) דגימות. הגישה הראשונה מבוססת על חלבון היתוך, המסוגל לזהות את כל הליבנדים הידועים ואולי עדיין לא ידועים, בעוד הפרוטוקול השני מסתמך על תוספת של נוגדנים מרובים נגד NKG2DL.
פרוטוקול זה מציג שתי דרכים נפרדות לזיהוי NKG2DLs על פני השטח של תאי AML. הטכניקה מספקת שיטת הכתמים מהירה וידידותית למשתמש כדי לזהות את כל NKG2DLs הידועים ואולי לא ידועים. שיטה זו מאפשרת הפרדה של תאי גזע לויקמיים מתאי AML בתפזורת, מה שמאפשר לאפיין תאים אלה עוד יותר.
התחל על ידי הפשרת ביוטין ואת צינורות חלבון היתוך NKG2D בטמפרטורת החדר. סובב במהירות את אבקת NKG2D FC, ולאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS כדי לשחזר את האבקה ולערבב ביסודיות באמצעות מיקרופיט P-1000. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חלבון ההיתוך NKG2DL לצינור ביוטין כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר, וערבבו את התמיסה ביסודיות עם מיקרופיפט P-100.
כדי להפשיר את תאי AML, להסיר את cryovial המכיל AML ראשוני מאחסון חנקן נוזלי, ומיד למקם אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מעבירים בעדינות את הצינור קדימה ואחורה במים, ומאפשרים לתוכן המצוין להפשיר עד שנותר רק גבישי קרח קטן. מעבירים מיד את התאים המופשרים לצינור הבינוני המכיל ושוטפים את הנקינה באמצעות מיליליטר אחד של בינוני.
צנטריפוגות התאים ב 300 פעמים G במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור. לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של RPMI בינוני המכיל 10%FCS ולחזור על צנטריפוגה. resuspend גלולה התא עם חוצץ כתמים לריכוז הסופי של 0.5 פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר.
לאחר מכן להעביר 100 microliters של השעיית התא לתרבות תא 96 היטב צלחת U-התחתון וצנטריפוגה הצלחת ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור. הכן תערובת ראשית של חלבון היתוך ביוטינילציה NKG2D כך שהתאים יתמכו מחדש בנפח סופי של 50 מיקרוליטרים לבאר עם ריכוז NKG2D סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לבאר.
מוסיפים את תערובת המאסטר המוכנה ומוסיפים מחדש את כדורי התא עם פיפטה של 200 מיקרוליטרים. דגירה וצנטריפוגות הלוח כמתואר בכתב היד של הטקסט. הכן תערובת מאסטר באמצעות Streptavidin PE, כך התאים הם resuspended בנפח סופי של 50 microliters.
מוסיפים את תערובת האב לתאים ומערבבים מחדש את הכדורים עם פיפטה רב-ערוצית של 300 מיקרוליטרים. לאחר צנטריפוגה של הצלחת והשלכת supernatant, להשתמש micropipette רב ערוצי 300 microliter כדי resuspend כדורי התא ב 200 microliters של חוצץ כתמים בתוספת 7-AAD. לאחר מכן נתח את התאים באמצעות התקן ציטומטריית זרימה.
דגימות AML שנותחו הן חיוביות עבור CD34 ו NKG2DL, אבל אוכלוסיות משנה שליליות קיימות גם, עם ארבע אוכלוסיות שונות בסך הכל. אסטרטגיית הגטינג הטיפוסית מתחילה בבחירת האוכלוסייה העיקרית של תאים באמצעות ה- FSC וה- SSC שלהם. מכפילים ותאים מתים אינם נכללים בניתוח במורד הזרם.
השערים מותאמים באמצעות פקדי FMO כדי להבטיח זיהוי נכון של תאים חיוביים. עוצמות הפלואורסצנטיות של תאים חיוביים עבור CD34 לעומת NKG2DL מודגשות כאן. תאי AML חיוביים עבור CD34 מציגים ביטוי משטח נמוך יותר של NKG2DL, המציין כי ביטוי NKG2DL משויך לחוסר גזענות.
שלוש דגימות AML עיקריות הדגימו 19.8, 49.8 ו-89.4% אירועים חיוביים עבור כתמי חלבון ההיתוך לעומת 20.4, 50.4 ו-90.6% עבור כתמי נוגדן NKG2DL. מצד שני, כתמי ליגנד יחיד הראו מגוון של אירועים חיוביים עד 92%עם האחוזים משתנים על בסיס ליגנד. כאשר מנסים שיטה זו, חשוב מאוד להיות מהיר בעת הפשרת תאי AML העיקריים, כי הם שבירים יכול למות בקלות במהלך שלב זה.
לאחר ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לבצע מיון תאים המבוסס על אות NKG2DL כדי להמשיך לחקור את האוכלוסיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שתי שיטות צביעה נפרדות לגילוי ליגנדים של NKG2D (NKG2DLs) בדגימות ראשוניות של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) בבני אדם. טכניקות אלו מאפשרות את הפרדת תאי הגזע הלוקמיים מתאי AML כלליים לצורך אפיון נוסף.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
רקע
- ליגנדים של NKG2D חשובים לזיהוי חיסוני בסרטן.
- לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מציבה אתגרים באפיון תאים.
- ייתכן ששיטות עכשוויות אינן מבדילות ביעילות בין תאי גזע לוקמיים.
- פרוטוקולי צביעה חדשים יכולים לשפר את יכולות הגילוי.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקולי צביעה יעילים לזיהוי NKG2DL.
- סבסוד הפרדת תאי גזע לוקמיים מתוך אוכלוסייה כללית של תאי AML.
- שיפור האפיון של דגימות AML.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בחלבון מאוחד לזיהוי NKG2DLs.
- יישום של מספר נוגדנים נגד NKG2DL.
- הפשרה ושחזור של ביוטין וחלבון מאוחד של NKG2D.
- ערבוב תמיסות להשגת הריכוזים הרצויים לצביעה.
תוצאות עיקריות
- שני הפרוטוקולים מזהים ביעילות NKG2DLs מוכרים ובלתי מוכרים.
- הושגה הפרדה של תאי גזע לוקמיים מתאי AML כוללים.
- השיטות נוחות לשימוש ומהירות.
- ניתן לבצע אפיון משופר של תאי AML.
מסקנות
- פרוטוקולי צביעה חדשים משפרים את הגילוי של NKG2DLs.
- שיטות אלו יכולות לסייע בהבנת הביולוגיה של AML.
- מחקרים עתידיים יכולים להתרחב על בסיס טכניקות אלו לצורך השגת תובנות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
הבחנה בין תאי גזע לוקמיים לבין אוכלוסיות AML כלליות נותרת אתגר קריטי בתיקוף מטרות ובפיתוח מודלים פרה-קליניים. היכולת לבודד תתי-אוכלוסיות שליליות ל-NKG2DL בעלות תכונות של תאי גזע מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות טיפוליות ותומכת בביטחון ניבוי בתהליכי גילוי מוקדמים. גישה זו מספקת מידע ישיר לתעדוף תיקי פיתוח באמצעות זיהוי מערכות רלוונטיות למחלה בעלות פוטנציאל תומורגני גבוה יותר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות בידוד תאי גזע לוקמיים על בסיס ביטוי של NKG2DL על פני השטח.
- ערך תפעולי: מספק שיטה מהירה וידידותית למשתמש להבחנה בין תתי-אוכלוסיות בעלות תכונות של תאי גזע לבין תאי AML מובחנים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף תפקודי של תכונות תאי גזע בחלקים שליליים ל-NKG2DL.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות של ציטומטריית זרימה להשוואת ביטוי NKG2DL בין גישות של צביעה ספציפית לליגנד לצביעה של כל הליגנדים (pan-ligand).
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולי צביעה סטנדרטיים וניתנים לשחזור, התואמים להכנה של סריקות בסריקה רחבה (high-throughput screening).
- ערך מדעי: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לבדיקות סריקת תרכובות ובדיקות מעורבות מטרה (target engagement) בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקדם התאמה של ביומארקרים תרגומיים על ידי קישור דיכוי של NKG2DL למכניזמי חמיקה חיסונית בתאי גזע לוקמיים (LSCs).
- ערך תפעולי: תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לאישוש פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבידוד של תאים יוזמי מחלה.
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי שימוש במצב NKG2DL לצורך סיווג של תתי-אוכלוסיות של AML עם פוטנציאל טומוריגני שונה.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי כך שהיא מאפשרת בידוד של תתי-אוכלוסיות המוגדרות מבחינה מכניסטית.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי הפרדה של LSCs שליליים ל-NKG2DL מתאי AML כלליים (bulk) חיוביים ל-NKG2DL.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות זיהוי פני שטח כמותי וסטנדרטי התואם לפלטפורמות סריקה מבוססות ציטומטריה של זרימה.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים (אחוז אירועים חיוביים, עוצמת פלואורסצנציה) המאפשרות השוואה בין שיטות צביעה ותדירות של תתי-אוכלוסיות.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לבידוד LSCs לצורך תיקוף תפקודי במודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת לשימוש חוזר להעשרה של תאי גזע, הישימה על דגימות AML שונות וניתנת להתאמה לסוגי סרטן אחרים עם מנגנוני חמיקה חיסוניים דומים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בהעשרה של תאי גזע, הפחתת עמימות מכניסטית בזיהוי LSC.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של זיהוי NKG2DL במספר דגימות AML.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go בתיקוף מטרות, יעילות הון באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת, הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על פוטנציאל העשרה של LSC ופנוטיפ של חמיקה חיסונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציטומטריה של זרימה, צביעת תאים וטיפול בדגימות ראשוניות של AML.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה, לציוד סנטריפוגה ולריאגנטים הכוללים biotin, חלבון היתוך של NKG2D, streptavidin PE ו-7-AAD.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של אסטרטגיות gating, בקרות FMO והגדרות פיצוי (compensation) לקבלת תוצאות עקביות.
- דורש שיקולי התאמה בעת יישום במערכות מודל שונות בשל שונות בדפוסי הביטוי של NKG2DL.
- מגבלות מעשיות כוללות את השבריות של תאי AML ראשוניים במהלך ההפשרה, מה שמחייב עיבוד מהיר לשמירה על החיות.
