Name: RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: חקור שיטה ליצירת מוטנטי מחיקה של RNA קטן שאינו מקודד ב-Salmonella enteritidis באמצעות מערכת רקומבינציה מבוססת λ-Red. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים ופיתוח חיסונים מוחלשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית הסינית למדע (מס '31972651 ו -31101826), קרן המדע להשכלה גבוהה ג'יאנגסו (No.14KJB230002), מעבדת מפתח המדינה לביוטכנולוגיה וטרינרית (No.SKLVBF201509), מענק קרן מדעי הטבע של יאנגז'ו (No.YZ2014019), פרויקט הממומן על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD).

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המועצה הלאומית למחקר. ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת יאנגג'ואו אישרה את כל הניסויים והנהלים המיושמים על בעלי החיים (SYXK2016-0020).
1. זני חיידקים, פלסמידים ותנאי תרבית
<ol><li>השתמשו בחיידקים ובפלסמידים המפורטים בטבלה 1.</li>
	<li>תרבית חיידקים במרק LB או על צלחות אגר LB ב 37 ° C, בנוכחות 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין (Amp) במידת הצורך.</li>
	<li>זני תרבית המכילים פלסמידים רגישים לטמפרטורה משמשים למחיקת בנייה מוטנטית ב -30 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. שיבוט גן micC של S. זן אנטריטידיס 50336
<ol><li>מבוסס על רצף במעלה ובמורד הזרם של הגן micC של S. זן Typhimurium SL1344, תכנון פריימרים vmicC-F ו- vmicC-R כדי להגביר מקטע המכיל גן micC על ידי PCR באמצעות SE50336 DNA גנומי כתבנית.</li>
	<li>ערבבו 5 μL של 10x מאגר תגובת PCR, 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 1 μL של פריימרים vmicC-F ו-vmicC-R, בהתאמה, 5 μL של תבנית, 1 μL של Taq DNA polymerase ו-35 μL של ddH2O יחד עבור PCR.</li>
	<li>השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 53°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.</li>
	<li>רצף את מוצר ה- PCR כדי לקבל את רצף הגן micC .</li>
</ol>3. בניית מוטציית מחיקת micC
הערה: המוטציה השלילית micC של זן Salmonella Enteritidis 50336 נבנתה באמצעות רקומבינציה בתיווך λ-Red כפי שתואר קודם13,14. הפריימרים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 2.
<ol><li>להגביר קלטת chloramphenicol המכילה קטעי הומולוגיה של הגן micC .<ol><li>תכננו פריימרים micC-F ו-micC-R כדי להגביר את קלטת הכלוראמפניקול (Cm) מפלסמיד pKD3, כולל הרחבות הומולוגיה של 50 bp מה-5' וה-3' של הגן micC .</li>
		<li>חלץ את פלסמיד pKD3 כתבנית PCR.</li>
		<li>ערבבו 5 μL של 10x מאגר תגובת PCR, 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 1 μL של פריימרים micC-F ו-micC-R, בהתאמה, 5 μL של תבנית, 1 μL של Taq DNA פולימראז ו-35 μL של ddH2O יחד כתערובת תגובת PCR</li>
		<li>הגבירו את קלטת ה-Cm עם תנאי תגובת ה-PCR הבאים: קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך דקה אחת, 52°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 10 מחזורים; 94°C למשך דקה אחת, 63°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25°, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.</li>
		<li>לזהות את הגודל של מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. לטהר ולשחזר מוצר PCR עם ערכת התאוששות ג'ל DNA, ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר. אזהרה: PCR חייב להתבצע פעמיים. מוצר ה-PCR הראשון דולל ביחס של 1:200 ושימש כתבנית ל-PCR המשני, כדי למנוע את ההפרעה של רקומבינציה נוספת על ידי פלסמיד pKD3.</li>
	</ol></li>
	<li>בניית זן רקומביננטי1 רחוב 50336ΔmicC::cat
	<ol><li>יש לערבב 100 μL של תאים מתאימים SE50336 עם 5 μL של פלסמיד pKD46 באופן אחיד ולדגור על קרח למשך 30 דקות. חממו בחום את התערובת הנ"ל ב-42°C למשך 90 שניות, והעבירו במהירות את התערובת לקרח למשך 2 דקות כדי להפוך את פלסמיד pKD46 ל-SE50336. מסך מושבות חיוביות על ידי תרבית לילה ב 30 ° C על צלחת עמידה אמפר (50 מיקרוגרם / מ"ל).</li>
		<li>הוסף 30 mM L-arabinose לתרבית נוזלית SE50336/pKD46, וגרם לביטוי רקומבינאז על ידי תרבית ניעור של 30 ° C למשך שעה אחת. לאחר מכן הכינו תאים מתאימים.</li>
		<li>יש לערבב 100 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר (שלב 3.1) ו-40 מיקרוליטר של תאים מתאימים SE50336/pKD46 לתוך הלם חשמלי (לדוגמה, Bio-Rad). לבצע טרנספורמציה הלם חשמלי עם הפרמטרים של מתח 1.8 kV, דופק 25 μF והתנגדות 200 Ω.</li>
		<li>לאחר אלקטרוטרנספורמציה, להעביר את התערובת 1 מ"ל של מדיום SOC תרבית רועד ב 150 סל"ד ו 30 ° C במשך 1 שעה. לאחר מכן מרחו את התערובת על צלחת LB עמידה ס"מ (34 מיקרוגרם/מ"ל) ותרבית בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה כדי לסנן מושבה חיובית.</li>
		<li>תרבית את המושבה החיובית לעיל ב 42 ° C במשך 2 שעות. סנן את המושבה הרגישה ל- Amp (50 מיקרוגרם / מ"ל) אך עמידה לס"מ (34 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 ° C למשך הלילה כדי לקבל את הזן הרקומביננטי הראשון ללא pKD46.</li>
	</ol></li>
	<li>זהה את הזן הרקומביננטי הראשון 50336ΔmicC::Cat.<ol><li>חלץ 50336ΔmicC::DNA גנומי של חתול כתבנית PCR. השתמש באותם רכיבי תגובת PCR כמו בשלב 2.1. בצע את תגובת ה- PCR באותם תנאים כמו בשלב 2.1.</li>
		<li>לזהות את הגודל של מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose ולרצף את מוצר PCR.</li>
	</ol></li>
	<li>בניית מוטנט מחיקה 50336ΔmicC.
	<ol><li>אלקטרופורטאט 100 ng של פלסמיד pCP20 לתוך 40 μL של 50336ΔmicC:: תאים מוכשרים Cat עם הפרמטרים של מתח 1.8 kV, פולס 25 μF והתנגדות 200 Ω, שנאים חיוביים המסך על צלחת עמידה Amp (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו ס"מ (34 מיקרוגרם / מ"ל) צלחת עמידה ב 30 ° C.</li>
		<li>מעבירים מעל טרנספורמטורים חיוביים ל-LB לא עמיד ומגדלים אותם למשך הלילה ב-42°C, ולאחר מכן מבודדים מושבות בודדות על צלחת LB ב-37°C. בחר את המושבה הרגישה הן ל- Amp והן ל- Cm. מוטציה זו היא מוטציית מחיקת micC SE50336Δ micC.</li>
		<li>אמת 50336ΔmicC באמצעות PCR.<ol><li>חלץ 50336ΔmicC DNA גנומי כתבנית PCR. ערבבו 5 μLof 10x PCR reaction buffer, 2 μL של dNTP Blend (2.5 mM), 1 μL של primer vmicC-F, 1 μL של primer vmicC-R, 5 μL של תבנית, 1 μL של Taq DNA polymerase ו-35 μL של ddH2O יחד עבור PCR.</li>
			<li>השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 53°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. בניית זן משלים של micC
<ol><li>עיצוב פריימרים pBR-micC-F ו-pBR-micC-R עם אתרי הגבלה NheI ו-SalI.<ol><li>הגבירו גן micC באורך מלא עם רצפי אגפים באמצעות תערובת תגובת PCR המכילה 5 μL של DNA גנומי SE50336 כתבנית, פריימרים 1 μL של pBR-micC-F ו-1 μL של pBR-micC-R כפריימרים, 5 μLof 10x מאגר תגובת PCR, 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM) ו-35 μL של ddH2O.</li>
		<li>השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים: קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 52°C למשך 50 שניות, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות. לטהר ולשחזר מוצר PCR.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לעכל מוצר PCR ופלסמיד pBR322 בהתאמה באמצעות אנזים הגבלה NheI ו-SalI, ולקשור אותם באמצעות ליגאז T4 ב-16°C למשך הלילה כדי לקבל את הפלסמיד pBR322-micC.</li>
	<li>הפוך את pBR322-micC לתאים המוסמכים SE50336ΔmicC, וסנן טרנספורמנט חיובי כדי לקבל את הזן המשלים SE50336ΔmicC/pmicC. לחלץ פלסמיד pBR322-micC מזן משלים ולאמת אותו על ידי הגבלת עיכול אנזים וריצוף.</li>
</ol>5. בידוד RNA ו-PCR כמותי בזמן אמת
<ol><li>תרבית SE50336, 50336ΔmicC ו-50336ΔmicC/pmicC ב-LB בינוני לילה ב-24°C עם טיפוח טלטול של 180 סל"ד ל-OD600 של 2.0. איסוף תרבית חיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות 13000 סל"ד למשך 2 דקות.</li>
	<li>חלץ RNA כולל באמצעות מגיב TRIzol. לדגור 50 μL של RNA מבודד עם 2 μL של DNaseI ו 6 μL של חיץ 10x ב 37 ° C במשך 30 דקות כדי להסיר DNA. קביעת כמות RNA על ידי פיפטציה של 1 μL של דגימת RNA למיקרו-ספקטרופוטומטר.</li>
	<li>סינתזה של cDNA<ol><li>השתמש ב-1 מיקרוגרם של סך כל הרנ"א לסינתזה של cDNA ב-20 מיקרוליטר של מערכת תגובת שעתוק לאחור (4 μL של 5x buffer, 1 μL של תערובת אנזימי RT, 1 μL של תערובת פריימר RT, 10 μL של RNA כולל ו-4 μL של ddH2O). יש לדגור מעל מערכת התגובה ב-37°C למשך 15 דקות ולאחר מכן ב-85°C למשך 5 שניות.</li>
	</ol></li>
	<li>תכנון פריימרים המבוססים על רצף גני המטרה ompA, ompC ו-ompD. בצע שעתוק לאחור-PCR באמצעות ערכת מגיב RT. רכיבי תגובת ה-PCR מכילים 2.5 μLof 10x PCR reaction buffer, 1 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 1 μL של פריימרים של גן מטרה (ompA, ompC או ompD), 2.5 μL של תבנית, 0.5 μL של Taq DNA polymerase ו-17.5 μL של ddH2O.<ol><li>השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 60°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע PCR בזמן אמת באמצעות ערכת RT-PCR ירוקה של SYBR במכשיר RT-PCT בטריפליקטים.<ol><li>השתמש ברכיבי תגובת ה-PCR הבאים: 10 μL של 2x SYBR buffer, 0.4 μLof פריימר קדמי ופריימר הפוך בהתאמה, 0.4 μL של RoxDye II, 2 μLof cDNA ו-6.8 μL של RNase free H2O.</li>
		<li>השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-95°C למשך דקה אחת למשך מחזור אחד; 95°C למשך 5 שניות, 60°C למשך 34 שניות למשך 40 מחזורים.</li>
		<li>לנרמל את כל הנתונים לגן הייחוס האנדוגני gyrA. השתמש בשיטת 2-Δ ΔCT לכימות נתונים15.</li>
	</ol></li>
</ol>6. מבחני אלימות
<ol><li>תרבית SE50336, 50336ΔmicC ו- 50336ΔmicC/pmicC בשלב נייח בינוני עד מוקדם של LB (OD600 של 2-3) ב- 24 ° C, קציר באמצעות צנטריפוגה, ומדולל ל- CFU mL-1 מתאים ב- PBS סטרילי.</li>
	<li>עבור זיהומים בעכברים, יש לדלל את הזנים בתרבית ל-10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL ו-103 CFU/200 μL מתלים הדרגתיים. קבוצות הדבקה של חמישה עכברי Balb/c בני 6-8 שבועות לכל זן בזריקה תת עורית. הזריקו לקבוצת הביקורת 200 מיקרוליטר של מי מלח פיזיולוגיים.</li>
	<li>עבור זיהומי עוף, יש לדלל מעל שלושה זנים ל-107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL ו-109 CFU/200 μL reuspensions הדרגתיים. קבוצות הדבקה של עשרים תרנגולות בנות יום לכל זן בזריקה תת עורית.</li>
	<li>עקוב אחר סימני מחלה ומוות של חיות ניסוי מדי יום. חשב את LD50 (מינון קטלני חציוני) 14 d לאחר ההדבקה כפי שתואר קודם16. עבד את הנתונים באמצעות תוכנה לניתוח נתונים.</li>
	<li>בקבוצות זיהום, אספו את הלב, הכבד, הטחול, הריאות והכליות של אפרוחים שזה עתה מתו. שוקלים 0.5 גרם מהרקמות הנ"ל בנפרד וטוחנים אותם בפעולה סטרילית. לדלל דגימות טחינה בהדרגה, להפיץ אותם על צלחת LB תרבית במשך 8-10 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. רשום את כמות זני הסלמונלה המאוכלסים ברקמות האפרוחים.</li>
</ol>

<ol><li>Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-mediated+control+in+bacteria%3A+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).</li>
<li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea%3A+who+they+are%2C+what+they+do%2C+and+how+they+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+In+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li>
<li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria%3A+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li>
<li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicC%2C+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li>
<li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li>
<li>Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).</li>
<li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li>
<li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li>
<li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin%2C+OmpD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li>
<li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li>
<li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals%3A+Epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Veterinary+Journal+La+Revue+Veterinaire+Canadienne%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).</li>
<li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Vaccin+Immunother%22%5BJournal%5D)">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li>
<li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li>
<li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li>
<li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).</li>
<li>Hébrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li>
<li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li>
<li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li>
<li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li>
<li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboregulation+in+Escherichia+coli%3A+DsrA+RNA+acts+by+RNA%3ARNA+interactions+at+multiple+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li>
<li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C%2FA-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li>
<li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li>
<li>Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ס. Enteritidis הוא פתוגן תוך-תאי חשוב שיכול להדביק תרנגולות צעירות ומייצר תסמינים מדלקת מעיים ועד זיהום מערכתי ומוות17,18. בנוסף, S. Enteritidis גורם לזיהומים סמויים בתרנגולות בוגרות ונשאים כרוניים מזהמים מוצרי עופות, וכתוצאה מכך זיהומים המועברים במזון בבני אדם19. המנגנון הפתוגני של S. Enteritidis נשאר לחקור עוד יותר. עד כה, כמה sRNA כגון IsrJ, SroA ו- IsrM נמצאו כמשפיעים על אלימות סלמונלה <sup class="xr...

RNA קטן שאינו מקודד (sRNAs) הוא באורך 40-400 נוקלאוטידים, אשר בדרך כלל אינם מקודדים חלבונים אך יכולים להיות משועתקים באופן עצמאי בכרומוזומי חיידקים 1,2,3. רוב ה-sRNAs מקודדים באזורים הבין-גניים (IGRs) בין אזורי קידוד גנים ומקיימים אינטראקציה עם mRNA מטרה באמצעות פעולות זיווג בסיסים, ומווסתים את ביטוי גני המטרה ברמהשלאחר השעתוק 4,5. הם ממלאים תפקידי ויסות חשובים במטבוליזם של חומרים, סינתזת חלבון בקרום החיצוני, חישת מניין וביטוי גנים אלימים5.
MicC הוא תעתיק RNA קטן של 109 נוקלאוטידים הקיים ב- Escherichia coli ו- Salmonella enterica serovar Typhimurium, אשר יכול לווסת ביטוי חלבון ממברנה חיצוני מרובים כגון OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ו- Omp36 6,7,8,9. MicC מווסת את הביטוי של OmpC על ידי עיכוב קשירת ריבוזום למוביל mRNA ompC במבחנה והוא דורש מלווה RNA Hfq עבור תפקודו ב- Escherichia coli6. בסלמונלה טיפימוריום, MicC משתיק mRNA ompD באמצעות דופלקס RNA של ≤12 bp בתוך רצף הקידוד (קודונים 23-26) ולאחר מכן מערער את היציבות של mRNA אנדונוקלאוליטי7. תהליך ויסות זה נעזר בחלבון מלווה Hfq10. ה-OmpC הוא חלבון מצוי בשפע בקרום החיצוני שנחשב חשוב בסביבות שבהן ריכוזי החומרים המזינים והרעלנים היו גבוהים, כמו במעי6. פורין OmpD הוא חלבון הממברנה החיצונית הנפוץ ביותר בסלמונלה טיפימוריום ומייצג כ -1% מכלל חלבון התא11. OmpD מעורב בהיצמדות למקרופאגים אנושיים ולתאי אפיתל מעיים12. MicC גם מדחיק את הביטוי של נקבוביות OmpC ו- OmpD. הוא חשב כי MicC עשוי לווסת אלימות. כדי לחקור גני מטרה חדשים המווסתים על ידי MicC ולחקור את פונקציית ויסות האלימות של micC, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis (SE) 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336ΔmicC ואת המוטציה המשלימה 50336ΔmicC/p micC. גני מטרה חדשים נבדקו על ידי qRT-PCR. האלימות של 50336ΔmicC זוהתה על ידי עכברים וזיהומי תרנגולות.

<table><tbody><tr><td>דקסטרוז</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A610219</td><td>להכנת מרק</td></tr><tr><td>ערכת טיהור DNA</td><td>TIANGEN</td><td>DP214</td><td>לטיהור DNA</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR01A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm מגיב כימי</td><td>10017608</td><td>להכנת מרק</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sinopharm מגיב כימי</td><td>20032116</td><td>להכנת מרק</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610071</td><td>&lambda;-רקומבינציה</td></tr><tr><td>אדומה ערכת מיני פלסמיד</td><td>TIANGEN</td><td>DP106</td><td>מיצוי פלסמיד</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm מגיב כימי</td><td>10019308</td><td>להכנת מרק</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sinopharm</td><td>10002917</td><td>להכנת מרק</td></tr><tr><td>PrimeScriptRRT ערכת ריאגנטים עם מחק gDNA&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR047</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBRR Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>קשירה</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;</td><td></td><td>בידוד RNA</td> <td>15596018 Invitrogen</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>להכנת מרק</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>להכנת מרק</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Electrophoresis</td></tr><tr><td>&nbsp; מערכת אלקטרופורציה</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td>לטרנספורמציה חיידקית</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>BioTek</td><td>Epoch</td><td>זיהוי ספיגה</td></tr><tr><td>מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500 מערכת</td><td>qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

rna קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

רנ"א קטן שאינו מקודד (sRNA) הוא גורם חדש המווסת ביטוי גנים ברמה שלאחר השעתוק. סוג של sRNA MicC, הידוע ב- Escherichia coli ו- Salmonella Typhimurium, יכול לדכא את הביטוי של חלבוני הממברנה החיצונית. כדי להמשיך לחקור את פונקציית הבקרה של micC בסלמונלה אנטריטידיס, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336Δ micC על ידי מערכת הרקומבינציה λ Red והמוטנט המשלים 50336Δ micC/p micC הנושא פלסמיד רקומביננטי pBR322 המבטא micC. תוצאות qRT-PCR הראו כי התמלול של ompD ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 1.3 מזה שבזן מסוג פראי, בעוד שהתעתוק של ompA ו- ompC ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 2.2 ופי 3 מאלה בזן מסוג פראי. אלה הצביעו על כך ש-micC מדחיק את הביטוי של ompA ו-ompC. במחקר הבא, הפתוגני של 50336ΔmicC זוהה הן על ידי הדבקת עכברים בני 6 שבועות Balb/c והן על ידי תרנגולות בנות יום אחד. התוצאות הראו כי LD 50 של זן פראי מסוג 50336, המוטנטים 50336Δ micC ו-50336Δ micC/pmicC עבור עכברי Balb/c בני 6 שבועות היו 12.59 CFU, 5.01 CFU, ו-19.95 CFU, בהתאמה. LD50 של זנים עבור תרנגולות בנות יום אחד היו 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, ו 2.54 x 108 CFU, בהתאמה. הוא הצביע על כך שמחיקת micC הגבירה את האלימות של S. Enteritidis בעכברים ותרנגולות על ידי ויסות ביטוי של חלבונים הממברנה החיצונית.

בניית המוטציה 50336Δ micC וזן משלים 50336Δ micC /p micC תוצאת שיבוט הגן micC הצביעה על כך שגן זה מורכב מ- 109 bp המראים 100% זהות עם זו של S. טיפימוריום. בהתבסס על נתוני הרצף, מוטנט המחיקה 50336ΔmicC והמוטנט המשלים 50336ΔmicC/pmicC נבנו בהצלחה. בפירוט, תוצאות הריצוף הראו כי קסטת התנגדות של 1.1 קילובייט ס"מ הוגברה ושימשה לבניית רקו...

מערכת רקומבינציה בתיווך λ-Red שימשה ליצירת מוטציית מחיקה של מיקרופון RNA קטן שאינו מקודד.

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

פרוטוקול זה יכול לשמש להשבתת גנים כרומוזומליים כדי לבודד מוטנטים לחקר תפקודי גנים וחיידקים. זה הופך את תהליך הרקומבינציה ההומולוגית לפשוט, מהיר ויעיל ביותר. באמצעות טכניקה זו, ניתן למחוק את הגנים הקשורים לאלימות של הפתוגן כדי להשיג את המוטציה המוחלשת אשר יכולה לשמש כמועמד לחיסון מוחלש.התחל על ידי הגברת קלטת chloramphenicol המכילה קטעי hemology של הגן micC. תכננו פריימרים קדימה ואחורה כדי להגביר את קסטת הכלוראמפניקול מפלסמיד PKD3, כולל 50 הרחבות הומולוגיה של זוג בסיסים מחמשת הקצוות הראשוניים ושלושת הקצוות הראשוניים של הגן micC. בצע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט באמצעות פלסמיד PKD3 כתבנית להגברת קלטת כלורמפניקול.לקבוע את הגודל של מוצר PCR עם אלקטרופורזה ג'ל agarose. לאחר מכן לטהר את המוצר עם ערכת התאוששות ג'ל DNA ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטריה. בצע תגובת PCR שנייה כדי למנוע את ההפרעה של רקומבינציה נוספת על ידי פלסמיד PKD3.לדלל את מוצר ה- PCR הראשון ביחס של 1 עד 200 ולהשתמש בו כתבנית עבור PCR משני. כדי לבנות את הזן הרקומביננטי הראשון 50336 delta micC dot cat, ערבבו 100 מיקרוליטר של תאים מוסמכים SE 50336 עם חמישה מיקרוליטרים של פלסמיד PKD 46 ודגרו על קרח במשך 30 דקות. מחממים את התערובת בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, ומעבירים אותה במהירות חזרה על קרח למשך שתי דקות כדי להפוך את הפלסמיד לתאים.מסך מושבות חיוביות על ידי תרבית התאים במשך הלילה ב 30 מעלות צלזיוס על צלחת עמידה אמפיצילין. למחרת, הוסיפו 30 מילי ליטר ארבינוז נוספים לתרבית הנוזלית SE 50336 PKD 46 וגרמו לביטוי רקומבינאז עם דגירה של שעה ב-30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידה. ערבבו 100 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר ו-40 מיקרוליטר של SE 50336 PKD 46 תאים מוסמכים בכוס הלם חשמלי.לאחר מכן לבצע טרנספורמציה הלם חשמלי. לאחר טרנספורמציה חשמלית, מעבירים את התערובת למיליליטר אחד של מדיום SOC ואינקובטור תרבית מטלטלת ב-150 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס למשך שעה. מורחים את התערובת על צלחת LB עמידה לכלוראמפניקול ותרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לסנן מושבות חיוביות.תרבית את המושבות החיוביות ב 42 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן בדקו את המושבה לרגישות לאמפיצילין ועמידות לכלורמפניקול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקבל את הזן הרקומביננטי הראשון ללא PKD 46. לאחר חילוץ הדנ"א הגנומי של החתול 50336 Delta micC dot באמצעות אלקטרופורזה של PCR וג'ל, אלקטרופלטה 100 ננוגרם של פלסמיד PCP 20 לתוך 40 מיקרוליטר של 50336 תאים מוסמכים של Delta micC dot cat.שנאי מסך חיוביים על לוחות עמידים בפני אמפיצילין וכלוראמפניקול בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. מעבירים את הטרנספורמטורים החיוביים למדיום נוזלי LB שאינו עמיד ומתרבתים אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן בודדו מושבות בודדות על צלחת LB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בחר את המושבה הרגישה הן אמפיצילין ו chloramphenicol. מוטנט זה הוא מוטנט מחיקת micC SE 50336 Delta micC. אמת 50336 Delta micC על ידי ביצוע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט.פרוטוקול זה שימש לבניית מוטנט המחיקה 50336 Delta micC במוטנט המחמאה 50336 Delta micC, pmicC. חתול הנקודות הרקומביננטי הראשון 50336 Delta micC דוט חתול אומת על ידי PCR עם גודל פס צפוי של כ -1200 זוגות בסיסים של מוצרי PCR עם החדרת כלוראמפניקול בהשוואה ל -279 זוגות בסיסים בזן מסוג פראי. ברקומבינציה השנייה, קלטת chloramphenicol בוטל על ידי PCP 20.תוצאות ה-PCR בשילוב עם ריצוף אישרו כי מוטציית micC איזוגנית נבנתה בהצלחה. ביטוי הגנים ompA, ompC ו-ompD בזנים 50336, 50336 Delta micC ו-50336 delta micC pmicC נותחו על ידי PCR כמותי בזמן אמת. התעתיק של ompA ו-ompC ו-50336 delta micC גדל בערך פי 2.2 ופי שלושה בהשוואה לזן מסוג Wild.בעוד תמלול של ompD רק גדל מעט. בדיקות LD 50 הראו כי לאחר שהדביקו עכברי BALB/c בני שישה עד שמונה שבועות בכל אחד משלושת הזנים, רוב העכברים שנדבקו במיקרופון דלתא 50336 הפגינו רפיון, חוסר יכולת או שלשול 48 שעות לאחר ההדבקה ומתו לאחר 96 שעות. העכברים שנדבקו בזן פראי וב-50336 delta micC pmicC הציגו את אותם תסמינים 72 שעות לאחר ההדבקה ומתו לאחר 120 שעות.ה-LD 50s מבין שלושת הזנים הצביע על כך שהאלימות של ה-50336 Delta micC המוטנטי השתפרה פי 2.5 בהשוואה לסוג הפראי. טכניקה זו מסייעת לחוקרים לחקור את תפקודם של גנים חיידקיים ולהשיג את הזן המהונדס הרצוי על ידי מחיקת גני מטרה.

a-non-coding-small-rna-micc-contributes-to-virulence-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

סי אלגנס התפתחה כמודל גנטי חדש כדי לחקור אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה בשילוב עם טכניקת התערבות RNAi גדיל פעמיים כדי לבחון את התפקיד של גנים מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה.

פרוטוקול להדביק<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; Typhimurium סלמונלה</em

Assay תפוקה גבוהה לסלמונלה במבחנה פנוטיפ או עמותת חיידקים אחרת, פלישה, ושכפול בתאי phagocytic עם קיבולת תפוקה גבוהה פותח. השיטה הועסקה כדי להעריך זנים מוטנטים נוקאאוט גן סלמונלה למעורבותם באינטראקציות מאכסן לפתוגן.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ Enterica סלמונלה Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וברור לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר הרחבת קוד גנטי (GCE) ספציפי ותמונה של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)...

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

HIV כמיהות ניתן להסיק באזור V3 המעטפה ויראלי. V3 הוא PCR מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR, רצף, ופירשו באמצעות תוכנת bioinformatic. דוגמאות עם רצף עם 1 או יותר (ים) עם ציונים נמוכים g2P מסווגים וירוס לא R5.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

אנו מתארים זמנית PCR לזיהוי מהיר של סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. Serovars סלמונלה מסוימים ניתן לזהות על ידי מיקוד זמנית PCR לגנים רצפים ייחודיים אשכול O-האנטיגן ביוסינתזה ו flagellin של serovar נתון. Serovar מוקצה אז סלמונלה לבודד המבוססת על הופעתו של, amplicons גודל מסוים (מוצר PCR) המתאים אלל היעד.

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

חקור שיטה ליצירת מוטנטי מחיקה של RNA קטן שאינו מקודד ב-Salmonella enteritidis באמצעות מערכת רקומבינציה מבוססת λ-Red. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים ופיתוח חיסונים מוחלשים.

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

גלה סרטונים נוספים