Name: פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: למד שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור ספציפי בצלחת 6-באר באמצעות שייקר מסלולי. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת מאמצי גזירה על תאי אנדותל ביולוגיה של כלי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים בהכרת תודה על מענק פרויקט קרן הלב הבריטית (ל-PDW), המועצה הלאומית למחקר רפואי סינגפור TAAP ודינמו גרנט (ל-XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), מלגת בוגרי A*STAR (ל-KTP) ומרכז קרן הלב הבריטית למצוינות במחקר (לתואר שני).

1. ייצור מכשירים והכנת ריאגנטים
<ol><li>ייצור מודול נירוסטה<ol>
<li>פברק את מודול הנירוסטה מפלדת אל-חלד בדרגה 316 באמצעות מכונת כרסום CNC בהתאם לציור ההנדסי שסופק (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדפסה תלת-ממדית של תבנית פוליאדימיאתילסילוקסן (PDMS)<ol>
<li>הכינו דגם תכנון תלת מימדי בעזרת מחשב (CAD) של תבנית ה-PDMS באמצעות SolidWorks בהתאם לציור ההנדסי שסופק (איור 2).</li>
		<li>יצא את מודל CAD לקובץ STL וייבא את קובץ ה- STL ל- Cura 2.6.2.</li>
		<li>פורסים את הדגם לשכבות במהירות הדפסה של 50 מ"מ/ים וצפיפות מילוי של 60%.</li>
		<li>יצא את הקובץ כקוד G והעלה אותו למדפסת Ultimakerדו-ממדית להדפסה. השתמש בחומצה פולילקטית (PLA) כחומר ההדפסה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליהוק טבעת PDMS<ol>
<li>מערבבים את בסיס PDMS ואת סוכן הריפוי (שניהם מערכת אלסטומר סיליקון) עם יחס של 90.9% בסיס ו 9.1% ריפוי סוכן.</li>
		<li>יוצקים כ 2.6 מ"ל של הפתרון מעורב היטב לתוך עובש מודפס 3D.</li>
		<li>הסר בועות בתא גמילה ואקום.</li>
		<li>לרפא אותו במשך 1 שעות בתנור 80 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>אפשרו לטבעת PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו בזהירות את טבעת ה-PDMS שנרפאה מהתבנית. הציור ההנדסי של טבעת PDMS מוצג באיור 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת 1% F-127 פלרוני<ol>
<li>שוקלים 5 גרם של F-127 פלורוני, יוצקים אותו לתוך בקבוק זכוכית, ולאחר מכן מוסיפים 100 מ"ל של מים סטריליים לתוך בקבוק הזכוכית. זה נותן 5% פתרון F-127 פלורוני.</li>
		<li>ודא כי כל אבקת Pluronic F-127 שקוע במים, לסגור את הכובע autoclave אותו באמצעות תוכנית מחזור עיקור נוזלי.</li>
		<li>לאחר אוטוקלאב, תן לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
		<li>הוסף 10 מ"ל של 5% פתרון F-127 פלורוני ל 40 מ"ל של מים סטריליים autoclaved לעשות 1% Pluronic F-127 פתרון. בצע את הדילול בארון biosafety (BSC) מכסה המנוע.</li>
		<li>יש לאחסן הן 1% והן 5% F-127 פלורוניק בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת 4% פארפורמלדהיד (PFA)<ol>
<li>מוסיפים 800 מ"ל של מלוחים עם אגירה פוספטית (PBS) לזכוכית ומחממים אותה ל-60 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב (ממשיכים לבחוש משלב 1.5.1 עד 1.5.5).</li>
		<li>שוקלים 40 גרם של אבקת PFA ומוסיפים אותה לפתרון PBS החם. התראה: PFA הוא מסוכן, לבצע את השלבים 1.5.2 כדי 1.5.6 במכסה המנוע אדים.</li>
		<li>הוסף 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH) לאט dropwise לתוך פתרון PFA עד הפתרונות הופכים ברורים.</li>
		<li>להתאים את ה- pH של פתרון PFA כ 7.4 עם 1 מ 'של חומצה הידרוכלורית (HCl).</li>
		<li>התמלא את הפתרון ל- 1 L עם PBS 1X. זה נותן 1 L של 4% PFA.</li>
		<li>סנן את פתרון PFA עם מסנני 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים, aliquot ולהקפיא במקפיא -20 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של 0.1% טריטון-X<ol>
<li>הוסף 50 μL של Triton-X טהור לתוך 50 מ"ל של PBS כדי להפוך 0.1% טריטון-X פתרון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת 1% אלבומין סרום שור (BSA)<ol>
<li>שוקלים 0.5 גרם של BSA, יוצקים אותו לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של PBS לתוך הצינור.</li>
		<li>תן לו להתגלגל במשך שעה בטמפרטורת החדר על רולר להתמוסס.</li>
		<li>חנות 1% BSA ב 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ציפוי צלחת של 6 באר
<ol><li>מובלעת אוטומטית של מודול נירוסטה, טבעת PDMS ופינצ'רים לפני השימוש. בצע את כל ההליכים הבאים במכסה המנוע BSC ולבחון טכניקות אספטיות כדי להבטיח סטריליות.</li>
	<li>הנח את טבעת ה- PDMS במרחק של 6 בארות באמצעות פינצטה. השתמש בקצה החיצוני של טבעת PDMS כדי ליישר את טבעת PDMS באופן מרוכז עם הבאר. הערה: יש להשתמש רק בתרבית שאינה רקמה המטופלת היטב.</li>
	<li>הנח את מודול נירוסטה על גבי טבעת PDMS באמצעות פינצטה.</li>
	<li>הכנס את קצות צבת טבעת ההחזקה הפנימית לתוך חורי האחיזה של הטבעת השומרת, לסחוט את המחזיק כדי להפחית את קוטר הטבעת השומרת. להתאים אותו לתוך 6-טוב, לחץ אותו בחוזקה על מודול נירוסטה ולשחרר את הצבת כדי לאבטח את טבעת PDMS בבאר.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של 5 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין למרכז או לקצה הבאר (בהתאם לאזור העניין) דרך פתיחת טבעת PDMS ומודול נירוסטה.</li>
	<li>מערבולת הצלחת כדי להבטיח כי פתרון fibronectin מכסה את כל האזור של עניין.</li>
	<li>דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח תחת 95% אוויר / 5% CO2.</li>
	<li>הסר את הפתרון fibronectin מן הבאר ולשטוף פעמיים עם PBS. הסר לחלוטין את ה- PBS מהבאר.</li>
	<li>הסר את טבעת ההחזקה, מודול נירוסטה וטבעת PDMS מהבאר.</li>
	<li>מוסיפים 1.5 מ"ל של 1% פלורוני F-127 למרכז או לקצה הבאר (משטח לא צבוע) ומדגרת במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי להעביר את המשטח הלא צלוי.</li>
	<li>הסר את פתרון ה-F-127 הפלורוני מהבאר ושטף שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>השתמש היטב מצופה מיד או לאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים עם שכבה של PBS בבאר מצופה.</li>
</ol>3. זריעת HUVECs
<ol><li>השתמש HUVECs מתחת לקטע 5 בניסוי.</li>
	<li>הסר את כל מדיום התרבות ולשטוף תאים פעם אחת עם PBS.</li>
	<li>הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין ודגרת במשך 3 דקות ב 37 °C (69 °F) באינקובטור לח תחת 95% אוויר / 5% CO2. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לעקור את התאים. הערה: פרוטוקול זה נבדק באמצעות HUVECs ואת הריכוז של טריפסין וזמן הדגירה שלה עשוי להיות שונה עבור סוג אחר של ECs.</li>
	<li>להעביר את הפתרון צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולנטרל את טריפסין באמצעות 6 מ"ל של מדיום תרבות (למשל, Lonza EGM-2) מראש ל 37 °C (60 °F).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות. הסר את פתרון טריפסין מנוטרל resuspend תאים עם 1 מ"ל של מדיום תרבות מראש.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות המוציטרומטר וזרע 180k תאים לתוך צלחת מצופה 6-באר ב 1.5 מ"ל של מדיום תרבות מראש.</li>
	<li>לנער את צלחת היטב לרוחב כדי להבטיח כי התאים להפיץ באופן שווה בבאר.</li>
	<li>השאירו אותו באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-95% אוויר/5% CO2 למשך הלילה.</li>
	<li>הסר את התאים הלא מחוברים ואת מדיום התרבות והחלף ב- 2 מ"ל של מדיום תרבות טרום-מלחמתי. הערה: צפויים תאים רבים שאינם מחוברים לצוף באמצעי.</li>
</ol>4. יישום מתח גזירה באמצעות שייקר מסלולית
<ol><li>HUVECs צריך להגיע להתכנסות לאחר 3 ימים של צמיחה. החלף את המדיום עם 1.9 מ"ל של מדיום תרבות מראש (כדי להשיג גובה של 2 מ"מ).</li>
	<li>מניחים את הצלחת על הפלטפורמה של שייקר מסלולית באינקובטור לח תחת 95% אוויר / 5% CO2 ומסחררים אותו ב 150 סל"ד במשך 3 ימים. הערה: לנגב את המשטח החיצוני של שייקר מסלולית באמצעות 70% אתנול לפני הצבת אותו לתוך החממה.</li>
	<li>(אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' לאחר יומיים של גזירה, ציטוקינים ניתן להוסיף למדיום התרבות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ציטוקינים ומתח גזירה. לאחר הטיפול, לגזירה התאים ליום אחר. במחקר זה, TNF-α שימש להפעלת התאים.</li>
	<li>בצע ניתוחים לאחר 3 ימים של יישום מתח גזירה.</li>
</ol>5. כתמים והדמיה של תאים
<ol><li>לאחר 3 ימים של גזירה, להסיר את הצלחת מן האינקובטור ולשטוף תאים פעמיים עם PBS.</li>
	<li>לתקן את התאים על ידי הוספת 1.5 מ"ל של 4% PFA לתוך הבאר דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את 4% PFA מהבאר ולשטוף פעמיים עם PBS.</li>
	<li>לחלחל את התאים על ידי הוספת 0.1% טריטון-X לתוך הבאר דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את פתרון טריטון-X של 0.1% מהבאר והוסף 1.5 מ"ל של 1% BSA לבאר לחסימה. דגירה התאים עם 1% BSA עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדלל ארנב אנטי אנושי ZO-1 נוגדן בדילול 1:200 ב 1% BSA. מוסיפים 1.5 מ"ל של נוגדן מדולל לתוך הבאר ומדגירה אותו עם התאים לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר הדגירה לילה, להסיר את הנוגדן מדולל לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>לדלל אלקסה פלואור 488 שכותרתו עז נגד ארנב IgG נוגדן משני ב 1:300 דילול PBS. מוסיפים 1.5 מ"ל של נוגדן משני מדולל לבאר ומדגירה אותו עם התאים במשך שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את הנוגדן המשני מדולל לשטוף תאים פעמיים עם PBS.</li>
	<li>לדלל DRAQ5 בדילול של 1:1000 ב PBS. מוסיפים 1.5 מ"ל של DRAQ5 מדולל לתוך הבאר ולהדגיר אותו עם התאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את גרעיני התא.</li>
	<li>הסר את DRAQ5 מדולל לשטוף שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>בצע סריקת אריחים מהקצה למרכז הבאר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.</li>
</ol>6. כימות אינדקס הצורות ומספר התאים
<ol><li>פרסם את התמונות באמצעות MATLAB R2016a.</li>
	<li>קרא את קובץ ה- LIF ממיקרוסקופ קונפוקאלי ל- MATLAB והמר את סריקת האריחים הממוזגת לתמונה בינארית, ולאחר מכן הוסף את התמונה לפי אזור ועוצמה כדי להבדיל בין גרעינים לרקע.</li>
	<li>לחלק את סריקת האריחים הבינאריים למקטעים רדיאליים של 1 מ"מ.</li>
	<li>התאם אליפסה לכל גרעין בנפרד.</li>
	<li>ספור את מספר האליפסות בתוך כל מקטע מוקדי כדי לתת מספר תא.</li>
	<li>הגדר את אינדקס הצורות = כ- SI = 4π x שטח / היקף2. חשב את אינדקס הצורות עבור כל אליפסה18.</li>
</ol>

<ol><li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li>
<li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Sensing+of+Flow+Direction%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).</li>
<li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437, 426-431 (2005).</li>
<li>Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+compliance+of+endothelial+cells+after+shear+stress+in+vitro+or+from+different+aortic+regions%3A+Scanning+ion+conductance+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study.</a> PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).</li>
<li>Asakura, T., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Patterns+and+Spatial+Distribution+of+Atherosclerotic+Lesions+in+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human.</a> Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).</li>
<li>Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+evidence+for+a+change+in+the+pattern+of+aortic+wall+shear+stress+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).</li>
<li>Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fluid+mechanics+in+the+localization+and+detection+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis.</a> Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).</li>
<li>Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+vitro+rheological+system+for+studying+the+effect+of+fluid+shear+stress+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells.</a> The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).</li>
<li>Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation+and+orientation+of+cultured+endothelial+cells+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress.</a> Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).</li>
<li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li>
<li>Venugopal Menon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+microfluidic+3D+stenosis+model+to+study+leukocyte-endothelial+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis.</a> APL Bioengineering. 2 (1), 016103(2018).</li>
<li>Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium%3A+A+review+of+the+orbital+shaker+method%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li>
<li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15(2018).</li>
<li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture%3A+comparison+of+aortic%2C+venous%2C+capillary%2C+and+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%22%5BJournal%5D)">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li>
<li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li>
<li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li>
<li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li>
<li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Heart+Association%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיטת ה-swirling-well מסוגלת ליצור פרופילי זרימה מורכבים בבאר אחת - זרימה רב-כיוונית בעוצמה נמוכה (LMMF) במרכז וזרימה חד-ערוצית בעוצמה גבוהה (HMUF) בקצה הבאר. עם זאת, הפרשות גזירה בתיווך מתח של מתווך מסיס יהיה מעורב במדיום מתערבל להשפיע על התאים בבאר כולה, פוטנציאל מיסוך ההשפעה האמיתית של פרופיל מתח גזירה מסוים על התאים.
שיטת הציפוי המודגמת כאן מתגברת על בעיה זו על ידי הגבלת צמיחת התאים לאזור מסוים של הבאר. תאים בדרך כלל לצרף משטחים הידרופיליים ולא אלה הידרופובי. מסיבה זו, כלי תרבות פוליסטירן מ...

התגובות של תאי כלי הדם לסביבה המכנית שלהם חשובים בתפקוד תקין של כלי הדם ובהתפתחות של מחלה1. Mechanobiology של תאי אנדותל (ECs) כי קו פני השטח הפנימיים של כל כלי הדם כבר מוקד מסוים של מחקר mechanobiological כי ECs לחוות ישירות את הלחץ גזירה שנוצר על ידי זרימת הדם מעליהם. שינויים פנוטיפיים שונים כגון תגובות דלקתיות, נוקשות ומורפולוגיה שהשתנו, שחרור חומרים vasoactive, לוקליזציה וביטוי של חלבונים junctional תלויים בחשיפה EC ללחץ גזירה2,3,4. תכונות אנדותל תלויות גזירה עשויות להסביר גם את ההתפתחות הלא יציבה של מחלות כגון טרשת עורקים5,6,7.
כדאי לחקור את ההשפעה של גזירה על מחשבים אלקטרוניים בתרבות, שם ניתן לשלוט בלחצים, וניתן לבודד ECs מסוגי תאים אחרים. התקני במבחנה הנפוצים להחלת לחץ גזירה על מחשבים אלקטרוניים כוללים את תא הזרימה של הלוח המקביל ואת viscometer חרוט וצלחת, אבל רק חד-מיני יציב, נדנוד, זרימה pulsatile ניתן להחיל8,9. למרות שפותחו תאי זרימה מותאמים עם גיאומטריות מחודדות או מסתעפות ושבבים מיקרופלואידיים המחקים גיאומטריה סטנוטית, התפוקה הנמוכה שלהם ומשך התרבות הקצר יחסית האפשרי מציבים אתגר10, 11.
שיטת שייקר מסלולית (או מערבולת היטב) לחקר mechanotransduction אנדותל, שבו תאים גדלים בכלי פלסטיק סטנדרטיים של תרבות התא להציב על הפלטפורמה של שייקר מסלולית, הוא צובר תשומת לב גוברת כי הוא מסוגל כרונית הטלת מורכבים, דפוסי מתח גזירה שונים מרחבית על ECs עם תפוקה גבוהה (ראה סקירה על ידי Warboys ואח'12). סימולציות דינמיקת נוזלים חישובית (CFD) הופעלו כדי לאפיין את הווריאציה המרחבית והטמפורלית של לחץ גזירה בבאר מתערבלת. התנועה המסתובבת של מדיום התרבות הנגרמת על ידי התנועה המסלולית של פלטפורמת השייקר שעליה ממוקמת הלוח מובילה לזרימה רב-כיוונית בדרגה נמוכה (LMMF, או זרימה פרו-אתרוגנית) במרכז וזרימה יוניקסיאלית בעוצמה גבוהה (HMUF, או זרימה את'רופקטיבית באופן פוטטיבי) בקצה הבארות של צלחת של 6 בארות. לדוגמה, לחץ גזירה קיר ממוצע זמן (TAWSS) הוא כ 0.3 Pa במרכז ו 0.7 Pa בקצה צלחת 6-באר הסתחרר ב 150 סל"ד עם רדיוס מסלולי 5 מ"מ13. השיטה דורשת רק כלי פלסטיק זמינים מסחרית ואת שייקר מסלולית עצמה.
יש, עם זאת, חיסרון לשיטה (ולשיטות אחרות של הטלת זרימות במבחנה): ECs לשחרר מתווכים מסיסים ומיקרו-חלקיקים באופן תלוי גזירה14,15,16 ו secretome זה עשוי להשפיע על ECs באזורים של הבאר מלבד זה שבו הם שוחררו, בשל ערבוב במדיום מתערבל. זה עשוי להסוות את ההשפעות בפועל של לחץ גזירה על פנוטיפ EC. לדוגמה, Ghim et al. העריכו כי זה מסביר את ההשפעה הזהה לכאורה של פרופילי גזירה שונים על הובלה טרנסצ'לית של חלקיקים גדולים17.
כאן אנו מתארים שיטה לקידום הידבקות תא אנדותל וריד טבור אנושי (HUVEC) באזורים ספציפיים של צלחת 6-באר באמצעות ציפוי פיברונקטין תוך שימוש F-127 פלורוני כדי להעביר את פני השטח ולמנוע צמיחה במקום אחר. השיטה פותרת את המגבלה שתוארה לעיל מכיוון, על ידי פילוח צמיחת תאים, מחשבים אלקטרוניים חווים רק סוג אחד של פרופיל גזירה, ואינם מושפעים מפרחומים ממחשבים אלקטרוניים החשופים לפרופילים אחרים במקומות אחרים בבאר.

<table><tbody><tr><td><חזק>תאים ומדיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול אנדותל (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>cc-3162</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל וריד טבורי אנושי</td><td>NA</td><td>NA מבודד</td><td>מחבלים שהתקבלו מתורמים עם לידה לא מסובכת בבית החולים</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> האמרסמית<tr><td>' <חזק>ריאגנטים וחומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fuor 488-labeled goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9418-50G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom לא מטופל&nbsp;</td><td>סיינטיפיק ציוד מעבדה בע"מ</td><td></td><td></td>351146</tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמה בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי TNF-a</td><td>פפרוטק</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>RS PRO 2.85 מ"מ נימה למדפסת תלת מימד PLA שחורה, 1 ק"ג</td><td>RS</td><td>832-0264</td><td></td></tr><tr><td>נירוסטה 316</td><td>סופרמרקט מתכת</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Farnell</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>פתרון Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13663</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (5mM)</td><td>Bio Status DR50200</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>SHA7930</tr><tr><td>Leica TCS SP5 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>צבת טבעת שמירה</td><td>Misumi</td><td>RTWP32-58</td><td></td></tr><tr><td>טבעות שמירה/פנימיות/C-Type</td><td>Misumi</td><td>RTWS35</td><td></td></tr><tr><td>מדפסת Ultimaker 2+3-D Ultimaker</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cura 2.6.2</td><td>Ultimaker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 2016</td><td>דאסו סיסטמס</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

לחץ גזירה שנכפה על דופן העורקים על ידי זרימת הדם משפיע על מורפולוגיה ותפקוד של תאי אנדותל. לחצים בדרגה נמוכה, נדנוד ורב-כיווני הונחו כולם כדי לעורר פנוטיפ פרו-אתרוסקלרוטי בתאי אנדותל, בעוד שגודל גבוה וגזירה חד-כיוונית או חד-ערוצית נחשבים לקידום הומאוסטזיס אנדותל. השערות אלה דורשות חקירה נוספת, אך טכניקות במבחנה מסורתיות יש מגבלות, והם עניים במיוחד בהטלת לחצים גזירה רב כיוונית על תאים. 
שיטה אחת שצוברת שימוש גובר היא לתרבות תאי אנדותל בלוחות רב-באר סטנדרטיים על הפלטפורמה של שייקר מסלולי; בשיטה פשוטה, זולה, בעלת תפוקה גבוהה וכרונית זו, המדיום המסתחרר מייצר דפוסים ועוצמות שונות של גזירה, כולל גזירה רב-כיוונית, בחלקים שונים של הבאר. עם זאת, יש לו מגבלה משמעותית: תאים באזור אחד, החשופים לסוג אחד של זרימה, עשויים לשחרר מתווכים למדיום המשפיעים על תאים בחלקים אחרים של הבאר, חשופים לזרימות שונות, ומכאן מעוותים את הקשר לכאורה בין זרימה לפנוטיפ. 
כאן אנו מציגים שינוי קל ובמחיר סביר של השיטה המאפשרת לתאים להיחשף רק למאפייני מתח גזירה ספציפיים. זריעת תאים מוגבלת לאזור מוגדר של הבאר על ידי ציפוי אזור העניין עם פיברונקטין, ואחריו פסיבציה באמצעות פתרון passivating. לאחר מכן, הצלחות ניתן להסתחרר על שייקר, וכתוצאה מכך חשיפה של תאים פרופילי גזירה מוגדרים היטב כגון גזירה רב כיוונית בעוצמה נמוכה או גזירה חד-כיוונית בעוצמה גבוהה, בהתאם למיקומם. כמו קודם, השימוש בכלי פלסטיק סטנדרטיים לתרבות התאים מאפשר ניתוח נוסף ופשוט של התאים. השינוי כבר איפשר הדגמה של מתווכים מסיסים, ששוחררו מאנדותל תחת מאפייני לחץ גזירה מוגדרים, המשפיעים על תאים הממוקמים במקומות אחרים בבאר.

הידבקות של HUVECs לאזורים של צלחת היטב לא מצופה פיברונקטין בוטלה על ידי פסיבציה Pluronic F-127; הצמיחה הוגבלה לאזור מצופה פיברונקטין גם לאחר 72 שעות של תרבות, עם וללא יישום מתח גזירה (איור 4A, איור 4C). ללא פסיבציה Pluronic F-127, HUVECs מחובר אל פני השטח ללא fibronectin והתפשט עוד יותר על ידי 72 שעות של תרבות (איור 4B, איור 4D).
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

פרוטוקול זה מתאר שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור מסוים של צלחת 6 בארות ליישום לחץ גזירה באמצעות מודל שייקר מסלולית.

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

פרוטוקול זה מתאר שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור מסוים של צלחת 6 בארות ליישום מתח מוחלט באמצעות מודל שייקר מסלולית. דרך נפוצה ללמוד את ההשפעות של זרימה על אנדותל היא לתרבות תאי אנדותל בצלחות תרבות רב-בארות על שייקר מסלולי. שייקר מסלולית גורם גל שמסתובב סביב הבאר.תאים במרכז הבאר חווים את סוג הזרימות שנחשבות כמובילות לטרשת עורקים. תאים הקרובים יותר לזרימה של חוויית הקצה שנחשבת למגוננת. המאפיינים של התאים בכל אזור הם הניחו להיות תלויים הלחצים העצומים שהם חווים.עם זאת, יש רצפה פוטנציאלית בלוגיקה זו. תאי אנדותל משחררים מתווכים באופן תלוי זרימה. מתווכים אלה יגיעו לריכוז אחיד במדיום המסתחרר ולכן ישפיעו על תאים באזורים שאינם אלה שבהם הם שוחררו.זה עלול להשחית או להסתיר השפעות אמיתיות של ההטעיה על התנהגות התא. ההשפעה אינה מוגבלת למערכת הבאר המסתחררת. זה עלול להתרחש אפילו בדגמים פשוטים, כמו תא זרימת הלוח המקביל.זה יכול להימנע על ידי גידול תאים רק בחלק אחד של המערכת. כאן, אנו מתארים שיטות להתיר הידבקות בתאים רק במרכז או רק בקצה הבאר המסתחררת. ייצור מודול נירוסטה.פברק את מודול נירוסטה מפלדת אל-חלד בדרגה 316 בהתאם לרישום הנדסי שסופק. הדפסה תלת-ממדית על PDMs. הכן מודל CAD תלת-ממדי של עובש PDMs באמצעות SOLIDWORKS בהתאם לציור ההנדסי שסופק.יצא את מודל CAD לקובץ STL וייבא את קובץ ה- STL לתוך Cura 2.6.2. פורסים את הדגם לשכבות במהירות הדפסה של 50 מילימטרים לשנייה וממלאים צפיפות של 60%ייצוא הקובץ כ- GCode. העלה אותו למדפסת תלת-ממד של Ultimaker להדפסה.השתמש בחומצה פולילקטית כחומר ההדפסה. ליהוק טבעת PDMS. ערבבו היטב את בסיס ה-PDMS ואת סוכן הריפוי עם יחס של 90.9% בסיס ו-9.1% ריפוי סוכן.יוצקים את הפתרון המעורב היטב לתוך התבנית המודפסת בתלת-ממד. הסר בועות בתא גמילה ואקום. תרפא את זה לשעה בכבשן של 80 מעלות.אפשרו לטבעת PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסירו בזהירות את טבעת ה-PDMS שנרפאה מהתבנית. הכנה של 1%Pluronic F-127.שוקלים חמישה גרם של F-127 פלרוני. יוצקים אותו לתוך בקבוק זכוכית. ואז להוסיף מאה מיליון מים מילי-Q לבקבוק הזכוכית.זה נותן פתרון F-127 5%פלורוני. ודאו שכל אבקת ה-F-127 הפלורונית שקועה במים. סגור את המכסה וסגור אותו אוטומטית באמצעות תוכנית מחזור עיקור נוזלי.תן לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הוסף 10 מיליון של 5% פלורוני F-127 פתרון 40 מיל של מים מילי Q autoclaved לעשות 1% Pluronic F-127 פתרון. בצע את הדילול במכסה המנוע של ארון הביו-רוויה.אחסן הן 1%והן 5%Pluronic F-127 בטמפרטורת החדר. ציפוי של צלחת 6 באר. מובלעת אוטומטית של מודול נירוסטה, טבעת PDMS ופינצ'רים לפני השימוש.בצע את כל ההליכים הבאים במכסה המנוע BSC ולבחון טכניקות אספטיות כדי להבטיח סטריליות. הנח את טבעת ה- PDMS במרחק של 6 בארות באמצעות פינצטה. השתמש בקצה החיצוני של טבעת PDMS כדי ליישר את טבעת PDMS באופן קונצנטרי בתוך הבאר.שימו לב, יש להשתמש רק בצלחות באר שאינן מטופלות בתרבית רקמות. הנח את מודול נירוסטה על גבי טבעת PDMS באמצעות פינצטה. הכנס את קצות צבת טבעת ההחזקה הפנימית לאחיזת האחיזה של הטבעת השומרת.לסחוט את המחזיק כדי להפחית את הקוטר של הטבעת שמירה. שים אותו לתוך 6-טוב, לחץ אותו בחוזקה על מודול נירוסטה, ולשחרר את הצבת כדי לאבטח את טבעת PDMS בבאר. הוסף מיליון אחד של חמישה מיקרוגרם לכל מיקרוליטר פיברונקטין למרכז או לקצה הבאר, בהתאם לאזור העניין, דרך פתיחת טבעת PDMS ומודול נירוסטה.מערבולת הצלחת כדי להבטיח את פתרון fibronectin מכסה את כל האזור של עניין. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות באינקובטור לח תחת 95% אוויר ו 5%CO2. הסר את פתרון פיברונקטין מהבאר.ועכשיו לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר סיום, להסיר לחלוטין את PBS מן הבאר. הסר את טבעת ההחזקה, מודול נירוסטה וטבעת PDMS מהבאר.הוסף 1.5 מיליון של 1% Pluronic F-127 לתוך הבאר ואת הדגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להעביר את פני השטח לא צבוע. הסר את פתרון ה-F-127 הפלורוני מהבאר ושטף שלוש פעמים עם PBS. לאחר שטף, להשתמש היטב מצופה מיד או לאחסן בארבע מעלות עד שבועיים עם שכבת PBS היטב מצופה.זריעה של תאי אנדותל. לספור תאים באמצעות hemocytometer וזרע 180, 000 תאים לתוך צלחת מצופה 6 באר ב 1.5 מיליון של מדיום תרבות התא חם מראש. לנער את צלחת היטב לרוחב כדי להבטיח כי התאים להפיץ באופן שווה בבאר.השאירו אותו באינקובטור לח ב-37 מעלות מתחת ל-95% אוויר ו-5%CO2 למשך הלילה. יישום מתח גזירה באמצעות שייקר מסלולית. תאים צריכים להגיע להתכנסות לאחר שלושה ימים של צמיחה.החלף את המדיום עם 1.9 מיליון של מדיום תרבות התא מראש להזהיר כדי להשיג גובה של שני מילימטרים. מניחים צלחת באר על הרציף של שייקר מסלולי באינקובטור לח ומסחררים אותו במהירות של 150 סל"ד במשך שלושה ימים. אופציונלי, לאחר יומיים של גזירה, ציטוקינים ניתן להוסיף למדיום תרבות התא כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ציטוקינים ומתח מוחלט.לאחר הטיפול, לגזירה התאים ליום אחר. במחקר זה, TNF-אלפא שימש להפעלת התאים. בצע ניתוח לאחר שלושה ימים של יישום מתח גזירה.תמונות מיקרוסקופ מראות כי F-127 פלורוני מנע הידבקות HUVEC לאזור ללא ציפוי פיברונקטין. לא חוברו HUVECs לחלק של פני השטח היטב שלא טופלו מראש עם פיברונקטין לפני פסיבציה של F-127 פלורוני לאחר 24 שעות, באיור A, ו 72 שעות, באיור C, של צמיחה. ללא פסיבציה Pluronic F-127, HUVECs היו מחוברים אל פני השטח ללא fibronectin, 24 שעות לאחר הזריעה, באיור B, והם התפשטו עוד יותר על ידי 72 שעות, באיור D.The סרגל קנה המידה שווה 500 מיקרומטר.כתם אדום גרעיני מראה את המורפולוגיה של HUVECs גזירה, A, במרכז, ו B, בקצה של באר מלאה. סרגל קנה המידה שווה למאה מיקרומטרים. A ו- B גם להראות קווי מתאר התא המסוים על ידי immunostaining של ZO-1.שים לב ליישור ולהתארכות של תאים בקצה אך לא במרכז. זה לא מראה הבדל משמעותי במדד הצורה הגרעינית, המציין מעוגלה, בין HUVECs גדל בבארות מלאות ומפולחים נראו עבור HUVECs שאינם מטופלים או TNF-אלפא מטופלים. התאים היו מוארכים יותר ליד קצה הבאר.נטייה להארכה גדולה יותר ב- HUVECs שטופלו ב- TNF-alpha לא הייתה משמעותית באופן עקבי בין מיקומים. לא נצפה הבדל משמעותי בין בארות מלאות ומפולגות במספר הצפיפות של HUVECs A, לא מטופלים ו- B, TNF-אלפא-מטופלים במקומות רדיאליים שונים. בשני המקרים, היו יותר תאים ליחידת שטח בקצה מאשר במרכז הבאר.לסיכום, השיטה שתיארנו כאן מאפשרת לך לגדל תאים באזור אחד בלבד של המערבולת היטב או אכן, של כל מערכת תרבית תאים מבוססת פלסטיק. משמעות הדבר היא שתאים בחלק אחד של הבאר חווים סוג אחד של זרימה אינם מושפעים ממתווכים המשתחררים מתאים באזור אחר החווים זרימות שונות. לא רק זה, אנחנו יכולים להסתכל על תאים הגדלים באזור אחד עם או בלי תאים גדלים באזורים אחרים.זה מאפשר להפגין את ההשפעות של מתווכים מסיסים כאלה. בדיקת ההשפעות של מדיום מותנה על תאים נאיביים מאפשר את אותו הדבר. על-ידי ניתוח מדיום התנאי, ניתן לזהות את המתווכים.

segmenting-growth-endothelial-cells-6-well-plates-on-an-orbital

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

ניתוח שיטתי של במבחנה תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

ידוע כי רמות ודפוסים שונים של גזירה נוזלית מווסתים את ביטוי הגנים האנדותליים, הפנוטיפ והרגישות למחלות. אנו דנים בהרכבה ושימוש ב'טבעות גזירה': מודל המייצר דפוסי מתח גזירה חד-כיווניים ותקופתיים. טבעות גזירה פשוטות להרכבה, חסכוניות ויכולות לייצר תשואות תאים גבוהות.

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

כאן אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות כלי בצורת O, התמחה במשך תרבויות השעיה של אגרגטים הסלולר, ברעידות מסלולית. התאים HEK293 גדל בתיק הזה יוצרים יותר אגרגטים הומוגנית מאשר אלה גדל בכלי תרבות קונבנציונלי.

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

מתואר כאן תהליך עבודה פשוט להבדיל בין תאי אנדותל לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואחריו פרוטוקול מפורט לגירוי המכני שלהם. זה מאפשר לחקור את המכנוביולוגיה ההתפתחותית של תאי אנדותל. גישה זו תואמת לבדיקות במורד הזרם של תאים חיים שנאספו משבב התרבית לאחר גירוי מכני.

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

אנו מציגים פרוטוקול לייצור תפוקה גבוהה של תעלות כלי דם עם גדלים גמישים ודפוסים רצויים על לוח סטנדרטי של שש בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המכונה כלי על צלחת (VOP). לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לקדם את הפיתוח של טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל בסיכון.

שיטת הדפסה ביולוגית בתפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות עם גודל וגמישות דפוס

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

למד שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור ספציפי בצלחת 6-באר באמצעות שייקר מסלולי. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת מאמצי גזירה על תאי אנדותל ביולוגיה של כלי דם.

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

גלה סרטונים נוספים