ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים
November 12th, 2020
מאמר זה נועד להציג פרוטוקול כיצד לבנות מיקרוסקופ ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציה נקודתית כדי למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים.
התצוגה הנוכחית של הארגון הרוחבי של קרום הפלזמה נותרה לא שלמה. מסיבה זו, חשוב ליישם כמה טכניקות חדשניות חדשות כגון וריאציה נקודתית ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי. זוהי טכניקה חזקה מאוד המאופיינת בזמן מעולה וברזולוציה מרחבית.
יתר על כן, הוא אינו פולשני ומאפשר לחקור את קרומי התאים בתנאים פיזיולוגיים. בכל יום לפני ביצוע ניסוי, פתחו את כל דיאפרגמות הקשתית והשתמשו במד כוח כדי למדוד את עוצמת הלייזר כשהקשתית הראשונה פתוחה במלואה. סובב את לוחית האמצע כדי לאתר את ההספק המרבי.
אם עוצמת הלייזר נמוכה מהרגיל, השתמש בקשתית כדי לבדוק את היישור ולהזיז לסירוגין את L1 ו-M1 לפי הצורך. לאחר מכן רשום את ערך ההספק במחברת מעבדה. כדי לבדוק את נתיב הזיהוי, הנח מים, החלקת כיסוי וטיפה של שני תמיסת רודמין 6G ננו-מולרית על המטרה.
לאחר מכן הפעל את תוכנת המתאם ורשום את הנתונים. פונקציית המתאם האוטומטי אמורה להציג כמות נמוכה של רעש, גודל פסולת קטן וקצב ספירה גבוה למולקולה לשנייה. כדי לכייל את גודל הנקודה, הנח תעודת כיסוי מקודדת תרבית תאים על יעד הטבילה במים והוסף 200 מיקרוליטר של שני תמיסת רודמין 6G ננו-מולרית להחלקת הכיסוי.
התאם את עוצמת קרן הלייזר של 488 ננומטר ל-300 מיקרו-וואט ובתוכנה, בחר את יציאת מיקרוסקופ זיהוי התאורה svFCS. הפעל את ה-APD ופתח את הקשתית עד שיורד אות כדי להשיג את גודל הפסולת המינימלי או סגור אותו לגודל פסולת גדול יותר. רשום כ-10 פונקציות מתאם אוטומטי של 20 שניות כדי לשפר את יכולת השחזור הסטטיסטית ולכבות את ה-APD.
בתוכנית ניתוח נתונים מתאימה, בדוק והשליך את הריצות עם תנודות חזקות עקב אגרגטים מולקולריים, ולאחר מכן התאם את הממוצע של פונקציית המתאם האוטומטי שנשמרה עם מודל דיפוזיה תלת מימדית, חלץ את זמן הדיפוזיה הממוצע מהפרמטרים המתאימים ושמור את הנתונים כקובץ TXT. לניתוח svFCS, כוונן את אלומת ה-488 ננומטר המופעלת בין שניים לארבעה מיקרו-וואט ואזן את הדגימות למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בחר את יציאת המיקרוסקופ לזיהוי תאורה svFCS, וב-APD.
לאחר מכן, בצע סריקת XY וסריקת Z של התא שנבחר. בחר את קרום הפלזמה בחלק העליון של התא כדי לאתר את הנקודה הקונפוקלית בעוצמת הקרינה המקסימלית ולהתחיל ברכישת הנתונים. בתוכנת המתאם, הקלט סדרה אחת של 20 ריצות של חמש שניות.
לאחר הריצה האחרונה, כבה את ה-APD והשליך כל ריצה בלתי צפויה כפי שהודגם. התאם את פונקציית המתאם האוטומטי הממוצעת עם מודל דיפוזיה דו-ממדי של שני מינים ושמור את פרמטרי ההתאמה בקובץ ה-TXT שנשמר בעבר. לאחר שתועדו כל התאים המעניינים, נתח לפחות ארבעה גדלי פסולת הנעים בין 200 ל-400 ננומטר כדי לקבוע חוק דיפוזיה יחיד.
לאחר מכן ב-MATLAB, בחר תיקיה המכילה את כל קבצי ה-TXT המתאימים לפחות לארבעה ניסויים בגודל פסולת ושרטט את זמן הדיפוזיה לעומת הפסולת הריבועית. באיור זה ניתן לראות חוק דיפוזיה עבור Thy1-GFP המתבטא בתאי Cos7. לחוק הדיפוזיה יש ערך אפס זמן חיובי, המצביע על כך שה-Thy1-GFP מוגבל בתוך מבני תחום ננו של קרום הפלזמה.
בניתוח זה, הטיפול בכולסטרול אוקסידאז בתאים המבטאים Thy1-GFP הביא לשינוי ערך זמן אפס של חוק הדיפוזיה ל-7.36 פלוס מינוס 1.34 אלפיות השנייה. אישור כי אופי הכליאה של Thy1-GFP תלוי בתכולת הכולסטרול וקשור לתחומי ננו רפסודת שומנים. ירידה קטנה אך משמעותית בתכולת הכולסטרול הכוללת נצפתה גם לאחר הטיפול בכולסטרול אוקסידאז.
מכיוון שאנזים זה פועל רק על מאגר הכולסטרול הנגיש בעלון החיצוני של קרום הפלזמה, נתונים אלה מצביעים על כך שהירידה הנצפית בכולסטרול קשורה רק לקרום הפלזמה וגורמת לערעור היציבות של תחומי הננו של רפסודת השומנים. הדבר החשוב ביותר כאשר מנסים הליך זה הוא כיול נכון של מערכת svFCS והכנת תאים לניתוח. svFCS הוא כלי מצוין לחקר ארגון קרום התא.
עם זאת, ניתן להשתמש בו גם כדי לנתח את הדיפוזיה של מולקולות תוך תאיות. ניתן ליישם טכניקה זו בהצלחה בביו-רפואה על מנת לקבוע את השפעת התרופות הפוטנציאליות על תאים חיים כגון תאים סרטניים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבניית מיקרוסקופ ספקטרוסקופית קורלציה של פלואורסצנציה (svFCS) כתמית למדידת דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים. הטכניקה מציעה רזולוציה זמנית ומרחבית מעולה תוך היותה לא פולשנית.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- הארגון הרוחבי של קרום הפלזמה אינו מובן במלואו.
- יש צורך בטכניקות חדשניות כמו svFCS לתובנות טובות יותר.
- svFCS מאפשרת לחקור את ממברנות התא בתנאים פיזיולוגיים.
- כיול נכון והכנת תאים הם חיוניים לתוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול למיקרוסקופיה svFCS.
- למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה.
- לנתח את השפעת הכולסטרול על ארגון הממברנה.
שיטות ששימשו
- כיול מערכת svFCS באמצעות תמיסת rhodamine 6G.
- רכישת נתונים באמצעות סריקות XY ו-Z של תאים נבחרים.
- ניתוח חוקי הדיפוזיה באמצעות MATLAB.
- השוואה של פרמטרי דיפוזיה לפני ואחרי טיפול בכולסטרול אוקסידאז.
תוצאות עיקריות
- דיפוזיה של Thy1-GFP מוגבלת בתוך מבני ננו-דומיין.
- טיפול בכולסטרול אוקסידאז מזיז את ערך הזמן האפס של חוק הדיפוזיה.
- נצפתה ירידה בתכולת הכולסטרול הכוללת.
- המחקר מציע שהכולסטרול משפיע על יציבות רפטות השומנים.
מסקנות
- svFCS יעילה לחקר ארגון קרום התא.
- הטכניקה יכולה גם לנתח דיפוזיה של מולקולות תוך-תאיות.
- הממצאים יש להם השלכות להבנת השפעות התרופות על תאים חיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) enables high-resolution analysis of molecular diffusion at the plasma membrane under physiological conditions, providing critical insights into membrane organization and lipid raft dynamics. This capability supports target validation by elucidating the biophysical context of membrane-associated proteins, informing mechanistic de-risking in early discovery. The method’s non-invasive nature and compatibility with living cells enhance its utility in preclinical screening and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying diffusion behavior of membrane proteins like Thy1-GFP within nanodomain structures.
- Operational Value: Reveals cholesterol-dependent confinement, enabling functional validation of lipid raft associations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets whose membrane localization is sensitive to lipid environment perturbations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline diffusion laws under physiological conditions.
- Quantitative Output: Generates reproducible diffusion time measurements across varying beam waist sizes, supporting assay standardization.
- Screening Relevance: Detects compound-induced shifts in diffusion parameters, indicating alterations in membrane organization or target engagement.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plasma membrane raft nanodomain disruption, relevant to pathologies involving lipid dysregulation.
- Translational Continuity: Connects early discovery observations to preclinical validation by demonstrating how environmental perturbations (e.g., cholesterol modulation) alter target behavior.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic readouts that inform go/no-go criteria based on target resilience to membrane perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
svFCS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a biophysical layer of characterization that complements biochemical and phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring diffusion coefficients and identifying confined vs. mobile molecular populations.
- Screening: Enables assay readiness through standardized calibration using rhodamine 6G and validation of detection path integrity.
- Analytics: Delivers quantitative diffusion laws via MATLAB analysis of auto correlation functions, allowing comparison of molecular behavior across conditions.
- Translational Research: Links membrane organization changes to functional outcomes, supporting biomarker alignment when diffusion shifts correlate with phenotypic responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying membrane protein dynamics across multiple targets and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving nanoscale confinement and diffusion heterogeneity at the plasma membrane.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized laser power calibration, detection path checks, and replicate auto correlation function averaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target stability in native-like membrane environments, reducing late-stage attrition due to unforeseen biophysical liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their dependence on lipid raft integrity for proper localization and function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, laser safety, and correlation spectroscopy data analysis.
- Needs a customized fluorescence microscope with APD, correlator software, and precise laser power control (2–4 µW for svFCS measurements).
- Demands cross-team standardization of calibration protocols (e.g., rhodamine 6G spot size validation) and data analysis pipelines (e.g., MATLAB fitting of 2D diffusion models).
- Involves adaptation considerations for different membrane proteins, cell types, and perturbation agents beyond cholesterol oxidase.
- Limited by the need for careful sample preparation to avoid molecular aggregates and ensure physiological relevance during 37°C equilibration.
