Name: ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: למד ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים. השיטה מאפשרת מדידת השפעת כולסטרול על ארגון הממברנה בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SB, SM ו- DM נתמכו על ידי מימון מוסדי מ- CNRS, Inserm ואוניברסיטת Aix-Marseille ומענקי תוכנית מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-17-CE15-0032-01 ו- ANR-18-CE15-0021-02) ומענקי התוכנית הצרפתיים "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW מכיר ב-"BioTechNan", תוכנית ללימודי דוקטורט סביבתיים בין-תחומיים בתחום הביוטכנולוגיה והננוטכנולוגיה. EB מכיר בתמיכה הכספית של מרכז המדע הלאומי של פולין (NCN) במסגרת פרויקט מס '2016/21/D/NZ1/00285, כמו גם ממשלת צרפת ושגרירות צרפת בפולין. MŁ מכיר בתמיכה הכספית של משרד הפיתוח הפולני (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) והמרכז הלאומי למחקר ופיתוח (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT מכיר בתמיכה כספית ממרכז המדע הלאומי של פולין (NCN) במסגרת פרויקט מס '2016/21/B/NZ3/00343 ומהמרכז הביוטכנולוגיה של ורוצלב (KNOW).

<ol><li>Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+are+more+mosaic+than+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membranes are more mosaic than fluid.</a> Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).</li>
<li>Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ABC+kinases+by+phosphorylation%3A+protein+kinase+C+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm.</a> The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: From model membranes to cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+as+a+membrane-organizing+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts as a membrane-organizing principle.</a> Science. , (2010).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+cell+membrane%3A+Do+proteins+rule+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).</li>
<li>Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluid+-+Mosaic+Model+of+Membrane+Structure%3A+Still+relevant+to+understanding+the+structure%2C+function+and+dynamics+of+biological+membranes+after+more+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).</li>
<li>Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+undergo+hop+diffusion+in+compartmentalized+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shift+of+the+plasma+membrane+concept+from+the+two-dimensional+continuum+fluid+to+the+partitioned+fluid%3A+high-speed+single-molecule+tracking+of+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).</li>
<li>Destainville, N., Salomé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).</li>
<li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Un%29confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. , (1976).</li>
<li>Petrášek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2008).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((40+Years+of+FCS%3A+How+it+all+began%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">40 Years of FCS: How it all began.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Elson, E. L., Magde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+I.+Conceptual+basis+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+II.+An+experimental+realization%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+in+living+cells+observed+by+fluorescence+correlation+spectroscopy+with+one-+and+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation.</a> Biophysical Journal. , (1999).</li>
<li>Bouchaud, J. P., Georges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffusion+in+disordered+media%3A+Statistical+mechanisms%2C+models+and+physical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Reports%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications.</a> Physics Reports. , (1990).</li>
<li>Yechiel, E., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-scale+domains+in+fibroblast+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes.</a> Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).</li>
<li>Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+domains+by+FRAP+experiments+at+variable+observation+areas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas.</a> European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).</li>
<li>Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+K-Ras+and+H-Ras+display+different+interactions+with+saturable+nonraft+sites+at+the+surface+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+diffusion+laws+to+probe+the+submicron+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+corralation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence corralation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Lenne, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+confinement+in+the+plasma+membrane+by+microdomains+and+the+cytoskeleton+meshwork%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork.</a> EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).</li>
<li>Ruprecht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contractility+triggers+a+stochastic+switch+to+fast+amoeboid+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility.</a> Cell. , (2015).</li>
<li>Billaudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+plasma+membrane+organization+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).</li>
<li>Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+for+characterizing+plasma+membrane+subdomains+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).</li>
<li>Rege, T. A., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%2C+a+versatile+modulator+of+signaling+affecting+cellular+adhesion%2C+proliferation%2C+survival%2C+and+cytokine%2Fgrowth+factor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).</li>
<li>Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCahuzac%2C+N+%22Blood%22">Blood</a>. , (2006).</li>
<li>Guia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+of+activating+receptors+at+the+plasma+membrane+controls+natural+killer+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance.</a> Science Signaling. 4 (167), 21(2011).</li>
<li>Blouin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation-dependent+IFN-%CE%B3R+partitioning+in+lipid+and+actin+nanodomains+is+critical+for+JAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation.</a> Cell. 166 (4), 920-934 (2016).</li>
<li>Chouaki-Benmansour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+regulate+the+TCR%2FCD3+complex+membrane+dynamics+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation.</a> Scientific Reports. , (2018).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+to+determine+diffusion+laws%3A+application+to+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Micro-+and+Nano-Imaging%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes.</a> Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).</li>
<li>Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescence+correlation+spectroscopy+enabling+direct+observation+of+spatiotemporal+dependence+of+diffusion+constants+as+an+evidence+of+anomalous+transport+in+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Humpolíčková, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2006).</li>
<li>Benda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+diffusion+coefficients+in+planar+phospholipid+systems+by+confocal+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy.</a> Langmuir. , (2003).</li>
<li>Ganguly, S., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+mimics+the+effect+of+cytoskeletal+destabilization+on+membrane+dynamics+of+the+serotonin1A+receptor%3A+A+zFCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li>
<li>Wenger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+analysis+within+single+nanometric+apertures+reveals+the+ultrafine+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).</li>
<li>Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+fluorescence+correlation+spectroscopy+on+intact+living+cell+membranes+with+NSOM+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes.</a> Biophysical Journal. , (2011).</li>
<li>Regmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+optical+nanoantennas+resolve+cholesterol-dependent+nanoscale+heterogeneities+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells.</a> Nano Letters. , (2017).</li>
<li>Mueller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+in+STED+microscopy%3A+Studying+the+nanoscale+of+lipid+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nanoscale+diffusion+dynamics+in+cellular+membranes+with+super-resolution+STED-FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+STED-background+corrected+fitting+model+for+unbiased+STED-FCS+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Veerapathiran, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+imaging+FCS+diffusion+law+in+the+presence+of+multiple+diffusive+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+hop+or+not+to+hop%3A+exceptions+in+the+FCS+diffusion+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law.</a> Biophysical Journal. , (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן תיארנו את היישום של מודול svFCS על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי, גישה ניסיונית רבת עוצמה לפענוח הדינמיקה של ארגון קרום הפלזמה בתאים חיים הודות לניתוח חוק הדיפוזיה של FCS. מבחינה מושגית, ה- svFCS מבוסס על עיקרון פשוט: מדידות קורלציה של פלואורסצנציה בתחום הזמן תוך שינוי גודל אזור ההארה23. אסטרטגיה זו סייעה להסיק מידע ננוסקופי ממדידות מיקרוסקופיות, המסייעות לפענח את היסודות הפיזיקוכימיים העיקריים התורמים לארגון קרום הפלזמה במצב יציב25 ובתהליכים פיזיולוגיים 30,31,32,33. בסך הכל, ניתוחי svFCS אלה מדגימים באופן חד משמעי את קיומם של ננו-דומיינים תלויי שומנים בסוגים שונים של תאים ואת ההשלכה הישירה שלהם בכוונון אירועי איתות שונים.
במסגרת זו, ישנם כמה היבטים אופטיים שיש לקחת בחשבון בעת בניית הגדרת svFCS כדי לייעל את תקציב הפוטונים ולמזער סטיות אופטיות. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש במיקרוסקופ שממנו ניתן להסיר את עדשת הצינור כאשר מתבצעת מדידת svFCS. יתר על כן, קשתית בודדת ממלאת תפקיד מפתח במערך svFCS: היא משנה את גודל הקרן בפתח האחורי של המטרה, ובכך משנה ישירות את גודל המותניים האפקטיבי (כלומר, נפח העירור האפקטיבי). קוטר הקורה צריך להתאים לאישון האחורי האובייקטיבי כדי לקבל את גודל המותניים הקטן ביותר34. אפשרות זו, המסייעת לכוונן את גודל המותניים, מבטיחה אופטימיזציה של תקציב הפוטונים וקלה ליישום. לבסוף, מספר מינימלי של חלקים אופטיים משמשים לאורך נתיב האור; ככל שהמערכת פחות מורכבת, כך הפוטונים שאבדו פחות. כל האפשרויות הללו משפרות באופן משמעותי את החוסן של ניסויי svFCS.
לגבי הפרוטוקול עצמו, יש לקחת בחשבון כמה צעדים קריטיים. החשוב ביותר הוא יישור מתאים של הנתיבים האופטיים החיוני למדידות svFCS מוצלחות (פרוטוקול, סעיף 2). קל לבדוק זאת על ידי ניתוח האות הפלואורסצנטי מפתרון 2 ננומטר Rh6G, שאמור להיות ~ 200 קילוהרץ תחת תאורת לייזר של 300 μW. יש לפתוח את כל הקשתיות, ול-ACFs צריכה להיות משרעת חשובה (בדרך כלל G0~1.5-2.0). נקודה קריטית נוספת נוגעת לתאים ולהכנתם לניתוח svFCS (פרוטוקול, סעיפים 4-8). הצפיפות שלהם צריכה להיות מותאמת כך שתאים מבודדים לצפייה יהיו זמינים לניתוח. תאים שאינם דבקים צריכים להיות משותקים על כוסית כיסוי קאמרית באמצעות תמיסת פולי-L-ליזין. האות הפלואורסצנטי מתיוג תאים לא צריך להיות חזק מדי, או שהוא יגרום ל-ACFs שטוחים מאוד שקשה להתאים, ופרמטרים של התאמה עמוסים בשגיאה חשובה. בנוסף, תיוג לא-הומוגני ואגרגטים פלואורסצנטיים בתאים הופכים את מדידות ה-svFCS לקשות מאוד לפענוח. לבסוף, טיפול בכולסטרול אוקסידאז משפיע על כדאיות התאים, וניתוח svFCS לא יעלה על שעה אחת לאחר הטיפול. כמו כן, עדיף לרשום את התנודות הפלואורסצנטיות מממברנת הפלזמה העליונה מכיוון שהיא אינה מחוברת לתמיכה, ואין סיכון להפרעה לדיפוזיה של מולקולות בשל האינטראקציות הפיזיקליות עם התמיכה.
חלה התקדמות מספקת בטכניקת svFCS לשימוש בה בגישות שונות בשל מגוון האופנים להתאמת נפח הגילוי, מה שמאפשר לחקור תהליכים ביולוגיים שונים בתאים חיים. חלופה להתאמת גודל נפח העירור היא שימוש במרחיב קרן משתנה35. ניתן גם פשוט לווסת את גודל אזור ההארה על ידי הקלטת האות הפלואורסצנטי מהיירוט של קרום הפלזמה לאורך כיוון z36. ניתן לעשות זאת על מיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי שעבורו פותחה מסגרת תיאורטית לגזירת חוק הדיפוזיה37,38.
למרות ששיטת svFCS מציעה רזולוציה מרחבית-טמפורלית, הנחוצה לאפיון הארגון הלטרלי האי-הומוגני של קרום הפלזמה, אופני הכליאה הגיאומטריים אינם בלעדיים זה לזה. סטייה של t0 בכיוון זה או אחר חושפת באופן בלעדי מצב דומיננטי של כליאה25. יתר על כן, מגבלה חשובה נוספת של שיטת svFCS הנוכחית נובעת ממגבלת עקיפה אופטית קלאסית (~ 200 ננומטר). זה ללא ספק גדול יותר מהתחומים המגבילים את המולקולות בתוך קרום הפלזמה של התא. לכן, ניתוח הכליאה מסיק מהערך t0 , אקסטרפולציה מחוק הדיפוזיה.
חיסרון זה התגבר על ידי יישום שיטות חלופיות. בתחילה, שימוש בסרטים מתכתיים שנקדחו עם ננו-צמצם הציע את האפשרות להאיר שטח ממברנה קטן מאוד (כלומר, מתחת לגבול עקיפה אופטית של מפתחי צמצם ננומטריים בודדים של רדי הנעים בין 75 ל-250 ננומטר)39. לפיכך דווח על משטר המעבר שנחזה מחוק הדיפוזיה התיאורטי לארגון תחום מבודד, והוא איפשר חידוד של הגודל האופייני של הטרוגניות הממברנה הננומטרית ואומדן כמותי של שטח הפנים שנכבש על ידי ננו-דומיינים תלויי ליפידים39. לחלופין, תאורה ננומטרית פותחה גם באמצעות מיקרוסקופיה אופטית לסריקת שדה קרוב40 או ננו-אנטנות אופטיות מישוריות41. לאחרונה, שילוב של דלדול פליטה מגורה (STED) ו-FCS סיפק כלי רב עוצמה ורגיש לתיעוד חוק הדיפוזיה ברזולוציה מרחבית גבוהה מאוד. STED-FCS זה נותן גישה למאפייני דיפוזיה מולקולרית בקנה מידה ננומטרי המתרחשים תוך פרק זמן קצר, ומאפשרים לחקור את הארגון הדינמי של בדיקות השומנים בקרום הפלזמה42,43. עם זאת, הדיכוי הלא שלם של פלואורסצנציה בתהליך STED מאתגר את הניתוח של עקומות המתאם האוטומטי ב- FCS.
פותח מודל מתאים חדש כדי להתגבר על קושי זה, ולשפר את הדיוק של זמני הדיפוזיה ומדידות מספרי המולקולות הממוצעות44. לבסוף, עבור דיפוזיה מולקולרית איטית בקרום הפלזמה, ניתן ליישם את עקרון svFCS על נתונים שנרשמו על ידי ספקטרוסקופיית מתאם תמונה45. לאחרונה, הוכח כי שילוב מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) עם הדמיה של השתקפות פנימית כוללת-FCS (ITIR-FCS) תורם לעידון אופי המנגנון המעכב דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה, במיוחד בסמוך לתצורת ממברנת סף החלחול בגלל צפיפות גבוהה של ננו-דומיינים46.
לסיכום, קביעת חוק הדיפוזיה על ידי svFCS סיפקה את הראיות הניסיוניות להסקת הטרוגניות מקומית שנוצרה על ידי שומנים קולקטיביים דינמיים וקשרים של חלבוני ממברנה. כפי שנאמר על ידי Wohland ועמיתיו46, "ניתוח חוק הדיפוזיה של FCS נותר כלי רב ערך להסקת תכונות מבניות וארגוניות מתחת למגבלת הרזולוציה ממידע דינמי". ובכל זאת, עלינו לפתח מודלים חדשים כדי לחדד את הפרשנות של חוק הדיפוזיה שאמורים לאפשר הבנה טובה יותר של הדינמיקה של האירועים המולקולריים המתרחשים בקרום הפלזמה.

המורכבות של ארגון ממברנת הפלזמה ההבנה הנוכחית של ארגון קרום התא צריכה לקחת בחשבון מספר היבטים1. ראשית, הרכב שומנים מורכב משתנה לא רק בין סוגי תאים, אלא גם בתוך תא בודד (אברוני ממברנה/קרום פלזמה). חוץ מזה, חלבוני ממברנה קשורים או פנימיים מאורגנים ברובם בקומפלקסים דינמיים רב-ימיים, עם תחומים גדולים המשתרעים מחוץ לממברנה, ומהווים שטח גדול משמעותית מזה של תחומי הטרנס-ממברנה בלבד. יתר על כן, חלבונים הקשורים לממברנה מפגינים יכולות ספציפיות של קשירת שומנים או אינטראקציה עם שומנים, הממלאות תפקידים בוויסות תפקוד החלבון. אלה תלויים ישירות בהרכב המקומי ובנגישות של השומנים2.
לבסוף, רמה משמעותית של אסימטריה נצפתה בין שני עלוני ממברנה בשל המבנה האסימטרי הפנימי של חלבוני הממברנה והתפלגות השומנים. ואכן, איזון מטבולי של שומנים בין סינתזה להידרוליזה, בשילוב עם כפכף שומנים בין העלונים, יוצר התפלגות אסימטרית כגון. מכיוון שכל הובלה על פני הדו-שכבתית מוגבלת על ידי האנרגיה החופשית הנדרשת כדי להזיז את קבוצת ראש הקוטב דרך הפנים ההידרופוביות של הממברנות, היא בדרך כלל נעזרת במובילים סלקטיביים. עבור כל סוג תא, אסימטריה נוטה להישמר היטב. בסך הכל, גורמים אלה תורמים לאי-הומוגניות צידית או למידור של קרום הפלזמה 3,4.
אנו מעשירים את הייצוג הזה של קרום הפלזמה על ידי התחשבות בדיפוזיה המולקולרית הפנימית בתוך ולרוחב הדו-צדדי, מה שתורם להטרוגניות הצידית הדינמית בסולם של עשיריות עד מאות ננומטרים ומיקרו-שניות לשניות. לדוגמה, ננו-דומיינים של ממברנה התלויה בשומנים – מה שמכונה רפסודות ליפידים, המוגדרות ככולסטרול, ופלטפורמות איתות עשירות בספינגוליפידים – תורמות למידור קרום הפלזמה 5,6. עם זאת, ההשקפה הנוכחית של ארגון הממברנה אינה מוגבלת לרפסודות שומנים בלבד. ננו-דומיינים של ממברנה הם מורכבים יותר והטרוגניים יותר בהרכב, במקור ובתפקוד. ובכל זאת, נוכחותם בקרום הפלזמה חייבת להיות מתואמת היטב, ונראה כי אינטראקציות דינמיות בין חלבונים ושומנים חשובות בחלוקה המרחבית ובשינוי הכימי של ננו-דומיינים של ממברנה 1,3,7,8.
עקרון svFCS ויישומו כדי לחקור את הארגון של קרום הפלזמה למרות התקדמות רבה נעשתה בניתוח של תחומי ממברנה, בעיקר באמצעות טכניקות ביופיזיות, הדטרמיננטות המכתיבות את הארגון המקומי של קרום הפלזמה צריכות להיות מעודנות עם רזולוציה מרחבית וטמפורלית מתאימה. דטרמיננטות המבוססות על מעקב אחר מולקולות בודדות מספקות דיוק מרחבי מצוין ומאפשרות אפיון של מצבי תנועה שונים 9,10,11,12, אך יש להן רזולוציה טמפורלית מוגבלת עם קצבי פריימים נמוכים קלאסיים של מצלמה ודורשות מאמץ ניסיוני רב יותר כדי לתעד מספר משמעותי של מסלולים. לחלופין, ניתן להעריך את מקדם הדיפוזיה של רכיבי הממברנה על ידי התאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטו-הלבנה (FRAP)13 או ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS)14. האחרון זכה לתשומת לב רבה יותר, בעיקר בגלל הרגישות הגבוהה והסלקטיביות שלו, נפח הגילוי המיקרוסקופי, הפולשנות הנמוכה והטווח הדינמי הרחב15.
הבסיס הרעיוני של FCS הוצג על ידי מגד ועמיתיו לפני כ-50 שנה, לפני 16,17 שנה. הוא מבוסס על רישום התנודתיות של פליטת פלואורסצנציה ברזולוציה טמפורלית גבוהה (מ-μs ל-s)18. בגרסתו המודרנית, מדידות בתאים חיים מבוצעות על ידי נפח עירור קונפוקלי קטן (~0.3 פמטוליטרים) הממוקם בתוך אזור עניין (למשל, בקרום הפלזמה); האות הפלואורסצנטי שנוצר על ידי פיזור מולקולות פלואורסצנטיות הנכנסות ויוצאות מנפח התצפית נאסף ברזולוציה טמפורלית גבוהה מאוד (כלומר, זמן הגעתו של כל פוטון לגלאי). לאחר מכן, האות מחושב כדי ליצור את פונקציית התיקון האוטומטי (ACF), שממנה מופק הזמן הממוצע td (זמן דיפוזיה) שעבורו מולקולה נשארת בתוך נפח המוקד, יחד עם המספר הממוצע של חלקיקים, (N), הנמצא בנפח התצפית, שהוא ביחס הפוך למשעת של ACF. פרמטר אחרון זה עשוי להיות מידע שימושי על ריכוז המולקולה בתוך נפח התצפית.
מאז, מספר גדל והולך של שיטות FCS יושמו הודות למכשור המתפתח במהירות בביופוטוניקה, המאפשר תיאור של תופעות דינמיות המתרחשות במערכות חיות. ובכל זאת, מין מולקולרי יחווה התפלגות חופפת יותר של ערכי מקדם הדיפוזיה, אשר משתקפת בדרך כלל על ידי מאפיין דיפוזיה חריג, שבו מולקולות מתפזרות עם קשר לא ליניארי בזמן19, וקושי לזהות את המשמעות הביולוגית של תת-דיפוזיה חריגה זו. בעבר, קושי זה התגבר במידה מסוימת על ידי תיעוד הדיפוזיה המולקולרית על ידי FRAP מאזורים בגדלים שונים, ולא מאזור אחד בלבד, ובכך סיפק מידע מרחבי נוסף. זה איפשר, למשל, את ההמשגה של מיקרו-דומיינים של ממברנות 20,21,22.
תרגום של אסטרטגיה זו למדידות FCS (כלומר, מה שמכונה וריאציה נקודתית ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS)) נקבע על ידי שינוי גודל נפח המוקד של התצפית, מה שאפשר לתנודתיות בפלואורסצנציה להירשם בקני מידה מרחביים שונים23. לפיכך, גישת svFCS מספקת מידע מרחבי עקיף המאפשר זיהוי וקביעה של מצבי דיפוזיה מולקולרית וסוג של חלוקת ממברנות (תחומים מבודדים לעומת רציפים24) של מולקולות שנחקרו. על ידי התוויית זמן הדיפוזיה td כפונקציה של הסולמות המרחביים השונים המוגדרים על ידי ערך המותניים (ω), התואם את גודל רדיוס קרן הגילוי במקרה זה23,25, ניתן לאפיין את חוק הדיפוזיה של מולקולה נתונה במצב פיזיולוגי נתון. ה-svFCS הוא, אם כן, אנלוגי מושלם למעקב אחר חלקיקים בודדים בתחום הזמן26. תחת אילוץ הדיפוזיה הבראונית, יש לצפות לקשר ליניארי לחלוטין בין זמן הדיפוזיה td לבין המותניים ω (איור 1)23,25. ניתן לייחס את מקור הסטייה של חוק הדיפוזיה מתוכנית זו לסיבות לא בלעדיות, כגון עבודת רשת שלד ציטוסקלטון, צפיפות מולקולרית, חלוקה דינמית בננו-דומיינים, או כל שילוב של השפעות אלה ואחרות (איור 1), ויש לבחון אותה באופן ניסיוני25.
כאן אנו מספקים את כל מחסומי הבקרה הדרושים לשימוש יומיומי במערכת אופטית svFCS מותאמת אישית הבנויה מאפס, המשלימה את סקירות הפרוטוקול הקודמות שלנו 27,28 על גישה ניסיונית זו. יתר על כן, כהוכחת היתכנות, אנו נותנים קווים מנחים לגבי כיול ההתקנה, הכנת תאים, איסוף נתונים וניתוח להקמת חוק הדיפוזיה svFCS (DL) עבור Thy1-GFP, חלבון מעוגן גליקוסילפוספטידילינוזיטול עם קרום פלזמה, אשר ידוע כמיקום בננו-דומיינים של רפסודת שומנים29. לבסוף, אנו מדגימים כיצד התערערות חלקית של ננו-דומיינים של רפסודות שומנים על ידי טיפול באוקסידאז כולסטרול משפיעה על תכונות הדיפוזיה של Thy1-GFP. בנוסף, תיאור מפורט של בניית מערך svFCS מאפס מסופק בחומר משלים.

מפתח ברגים <table><tbody><tr><td>לכלי Aligment</td><td>עבור טבעות שמירה עם הברגה SM1</td><td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>פוטודיודת מפולת ומודול ספירת פוטון יחיד (SPCM)</td> <td>מודול ספירת פוטון יחיד, מפולת פוטודיודה</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 &Omega; תקע ל-50 &Omega; מוליכת תקע 2 מ'</td><td>רכיבי RS</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>כבל קואקסיאלי 415 מחברי Cinch , RG-316, 50 ואומגה; עם מחבר, 1.22 מ', רכיבי RoHS2</td><td>RS</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>Tee 50&Omega; מתאם RF תקע BNC לשקע BNC 0 &rarr; רכיבי RS 1GHz</td><td></td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2.5 מ', 8 שקעים מסוג E &ndash; עופרת הארכה צרפתית, רכיבי RS 230 V</td><td></td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>קמע, ספק כוח תקע 6W 5V DC, 1.2A, ספק כוח מצב מיתוג פלט אחד,</td><td>רכיבי RS</td> מסוג C <td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 מתנד ייחוס כבל חשמל מתאם RF</td><td>רכיבי RS</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>סינון פלואורסצנטי</td><td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&deg; קוטר כרומה 25 מ"מ</td><td>מסנן AHF</td><td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>מפצל קרן לייזר zt488 RDC, AOI 45&deg; מסנן AHF כרומה 25.5 x 36 x 1 מ"מ</td><td></td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Longpass מסנן, AOI 0&deg; קוטר כרומה 25</td><td>מסנן AHF</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>מתאם חומרה</td><td>80 מגה-הרץ מתאם דיגיטלי</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td></td><td>לייזר לייזר LASOS LDM-XT סיבים מצמדים, 488 ננומטר, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>בטיחות לייזר</td><td>סרט מיסוך שחור בעל ביצועים גבוהים, 1 אינץ' x 180' (25 מ"מ x 55 מ') רול</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>רקמות עדשה, 25 גיליונות בחוברת, 5 חוברות</td> משקפי בטיחות לייזר <td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>, עדשות כתומות בהירות, 48% העברת אור נראה</td><td>Thorlabs</td> מיקרוסקופ <td>LG3B</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss Axiovert 200M מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ממונע 200M מיקוד עדין וגס, סיבוב צריח רפלקטור, סיבוב אף אובייקטיבי, החלפת יציאות מצלמה ותריסי אור פנימיים</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.נבחר עבור FCS (D=0.14-0.19 מ"מ) (WD=0.28 מ"מ ב-D=0.17 מ"מ), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>מתאם W0.8 / M27x0.75 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>טבעת אמצעית W0.8 - W0.8 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>נתיב אופטי</td><td>D25.4 מ"מ מראה, כסף מוגן</td><td></td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25.4 מ"מ, F=60.0.mm, Achromat</td><td>Thorlabs</td> גלוי <td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25.4 מ"מ, F=35.0.mm, Achromat</td><td>Thorlabs</td> גלוי <td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 ומיקרו; m רכוב חור</td><td>סיכה Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4 מ"מ רכוב אפס, סדר 1/2 לוחית גל 488 ננומטר</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr> <tr><td></td><td>20 מ"מ קוביית מפצל קרן מקטב 420-680 ננומטר</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>שלב סיבוב 56 מ"מ x 26 מ"מ מזהה הברגה</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 מ"מ x 52 מ"מ פלטפורמה קינמטית הר</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>מהדק פריזמה מתכוונן</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>בלוק קרן - שטח פעיל 19 מ"מ x 38 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>דיאפרגמה של איריס 1 מ"מ עד 25 מ"מ צמצם</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>תושבת עדשה גלילית קינמטית שמאלית</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td><td>מחזיק אופטי בגודל 1 אינץ', M4 Tap</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>צינור עדשה הניתן לערמה בגודל 1 אינץ'</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>תושבת עדשה הניתנת לערמה לעומק ו-frac12 לשימוש אופטי בגודל 1 אינץ';</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>תושבת עדשה ניתנת לערום עבור 1 "אופטי שמיש עומק 2"</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>מסילות אופטיות קטנות 600 מ"מ, מטרי</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600 / M</td></tr><tr><td></td><td>מסילות אופטיות קטנות 75 מ"מ, מטרי</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075 / M</td></tr><tr><td></td><td>מסילות אופטיות קטנות 150 מ"מ,</td> מנשא מסילות מטרי <td>Thorlabs</td><td>RLA150 / M</td></tr><tr><td></td><td>, חור משועמם 1 "x 1"</td> <td>מנשא מסילה Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>, ניצב זנב יונה</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>תושבת עדשת תרגום דיוק גבוהה עבור 1 אינץ</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY / M</td></tr><tr><td></td><td>&frac12; " (12 מ"מ) שלב תרגום זנב יונים</td><td>Thorlabs</td><td>DT12 / M</td></tr><tr><td></td><td>מהדקי מסילה</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>שלב תרגום XYZ מטרי (כולל PT102)</td> <td>Thorlabs</td><td>PT3 / M</td></tr><tr><td></td><td>בד גומי שחור</td><td>Thorlabs</td> ערכת נהג כדור <td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>/ 6 כלים</td><td>מתאם Thorlabs</td><td>BD-KIT / M</td></tr><tr><td></td><td>עם חוטים חיצוניים M6 x 1.0 וחוטים חיצוניים M4 x 0.7</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>בסיס הרכבה, 25 מ"מ x 58 מ"מ x 10 מ"מ, 5 חבילות</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S / M-P5</td></tr><tr><td></td><td>תושבת עדשה עבור 25.4 מ"מ אופטי</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1 / M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC / APC מתאם</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>קינמטי מראה הר עבור אופטיקה 1 אינץ</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>ראש כוח סיליקון, 400-1100 ננומטר, 50mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12.7 מ"מ מחזיקי עמודים, בורג אגודל נעילת משושה קפיץ, L = 50 מ"מ, 5 חבילות</td><td>Thorlabs</td> מחזיק עמוד <td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>עם בורג אגודל נעילת משושה קפיצי, L=20 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 מ"מ x 50 מ"מ עמוד אופטי מנירוסטה, חתיך M4, חור M6 עם הקשה , 5 חבילות</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>12.7 מ"מ x 75 מ"מ עמוד אופטי מנירוסטה, חתיך M4, חור M6 עם הקשה , 5 חבילות</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>ממשק מד כוח ואנרגיה USB</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>12.7 מ"מ x 30 מ"מ עמוד אופטי מנירוסטה, M4 Stud, M6-Tapped Hole</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 מ"מ x 20 מ"מ עמוד אופטי מנירוסטה, M4 Stud, M6-Tapped</td><td>Hole Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>750 מ"מ אורך מסילה מבנית (תיבת זיהוי)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>מסילה מבנית באורך 350 מ"מ (תיבת זיהוי)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>קובייה פינתית מהירה למסילות 25 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>תושבת זווית ישרה למסילות 25 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>פוסטר שחור 20 אינץ' x 30 אינץ' (508 מ"מ x 762 מ"מ), עובי 1/16 אינץ' (1.6 מ"מ), 5 גיליונות</td><td>ציר Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>למארזי מסילות 25 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>עצירת מכסה למארזי מסילה 25 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 ערכת בורג כובע</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 ערכת בורג כובע וערכת חומרה</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>מהדק שולחן, בצורת L, 5 חבילות</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1 דיאפרגמת קשתית המופעלת על ידי טבעת (&Oslash; 0.8 - ואוסלאש; 12 מ"מ)</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&Oslash; 1 "SM1-רכוב זכוכית חלבית יישור דיסק w/&oslash; 1 מ"מ חור</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>חלת דבש שולחן אופטי</td>, <td>Standa Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>תמיכה בשולחן אופטי, Standa</td><td>Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>מדגם ננו-מיקום</td><td>דיוק XYZ ננו-מיקום Physik</td><td>Instrumente</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>דיגיטלי רב ערוצי Piezo Co, 3 ערוצים, -30 עד 130 V Sub-D מחברים, חיישנים קיבוליים,</td> <td>Physik Instrumente</td><td>PI</td></tr><tr><td>תא טמפרטורה</td> E727-3.CD <td>Zeiss 200M מערכת חממת מיקרוסקופ הפוך MATT BLK</td><td>פיקסל</td><td></td></tr><tr><td></td><td>דיגיטלי דו-ערוצי מיקרו-מעבד בקר טמפרטורה</td><td>פיקסל דיגיטלי</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>שני מודולי</td> <td>חימום ללא רעידותחיישן טמפרטורה פיקסל דיגיטלי</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100</td><td>פיקסל דיגיטלי</td> <<td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td>>ריאגנטים וחומרים ביולוגיים חזקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים וטרנספקציה</td><td>תאי Cos7</td><td>ATCC&reg;</td><td>CRL-1651 ומסחר;</td></tr><tr><td></td><td>8- well Lab-Tek chambers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-גלוטמין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>PBS buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>PolyJet Transfection Reagent</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>מדידת תכולת כולסטרול</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום Amplex Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>מעכב פוספטאז קוקטייל</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant פתרון עבודה</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax לגלות קורא מיקרופלייט</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS מדידות</td><td>מאגר HBSS</td><td>תרמו פישר 14025092</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מאגר Hepes</td><td>תרמו פישר 15630080</td><td></td></tr><tr><td></td><td>כולסטרול אוקסידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>רודמין 6G</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

תהליכים ביולוגיים דינמיים בתאים חיים, כולל אלה הקשורים לארגון קרום הפלזמה, מתרחשים בקני מידה מרחביים וטמפורליים שונים, החל מננומטרים ועד מיקרומטרים ומיקרו-שניות ועד דקות, בהתאמה. מגוון כה רחב של תהליכים ביולוגיים מאתגר גישות מיקרוסקופיות קונבנציונליות. כאן אנו מפרטים את הנוהל ליישום מדידות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציות נקודתיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קלאסי שהותאם אישית. הפרוטוקול כולל בדיקת ביצועים ספציפית של מערך svFCS ואת ההנחיות למדידת דיפוזיה מולקולרית על ידי svFCS על קרום הפלזמה של תאים חיים בתנאים פיזיולוגיים. בנוסף, אנו מספקים הליך לשיבוש ננו-דומיינים של רפסודות ממברנת פלזמה על ידי טיפול בכולסטרול אוקסידאז ומדגימים כיצד שינויים אלה בארגון הלטרלי של קרום הפלזמה עשויים להתגלות על ידי ניתוח svFCS. לסיכום, שיטה פלואורסצנטית זו יכולה לספק פרטים חסרי תקדים על הארגון הלטרלי של קרום הפלזמה עם הרזולוציה המרחבית והזמנית המתאימה.

יצרנו DL עבור Thy1-GFP המבוטא בתאי Cos-7 (איור 4, ריבועים שחורים). לחוק הדיפוזיה יש ערך t0 חיובי (19.47 אלפיות השנייה ± 2 אלפיות השנייה), המציין כי Thy1-GFP מוגבל במבנים ננו-דומייניים של קרום הפלזמה. הטיפול בכולסטרול אוקסידאז בתאים המבטאים Thy1-GFP הביא להסטת ערך DL t0 ל-7.36 ± 1.34 אלפיות השנייה (איור 4, ריבועים אפורים). תצפית זו מאשרת כי אופי הכליאה של Thy1-GFP תלוי בתכולת הכולסטרול וקשור לננו-דומיינים של רפסודות שומנים. שני חוקי דיפוזיה אלה מוצגים כשונים על פי המבחן הסטטיסטי שתואר לעיל (ראה שלב 9.1.3) במונחים של ערכי t0 ו - Deff . בנוסף, הערכנו את הריכוז של הכולסטרול התאי הכולל בתאי Cos-7 שאינם מטופלים לעומת התאים שטופלו ב-COase. ירידה קטנה, אך משמעותית, בתכולת הכולסטרול הכללי נצפתה בטיפול ב-COase (איור 5). מכיוון שאנזים זה פועל רק במאגר הכולסטרול הנגיש בעלון החיצוני של קרום הפלזמה, אנו מניחים שהירידה הנצפית בכולסטרול קשורה רק לקרום הפלזמה וגורמת לערעור היציבות של ננו-דומיינים של רפסודות שומנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> איור 1: מדומה של ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS) חוקי דיפוזיה שנקבעו על ידי FCS בווריאציה נקודתית עבור צורות שונות של ארגון ממברנה. (לוחות עליונים) ייצוג סכמטי של ארגון ממברנה – (A) דיפוזיה חופשית, (B) מחסומי רשת, ו-(C) כליאה של מלכודות/תחומים – כאשר המסלול נמשך עבור מולקולה בודדת (אדום). עיגולים כחולים מציינים את ההצטלבות של הממברנה וקרן הלייזר של המותניים ω. (לוחות תחתונים) חוקי הדיפוזיה של FCS המיוצגים על ידי התוויית זמן הדיפוזיה td כפונקציה של הרדיוס בריבוע ω2. היטל חוק הדיפוזיה (קו מקווקו ירוק) מיירט את ציר הזמן ב- (A) המקור (t0 = 0) במקרה של דיפוזיה חופשית; (B) בציר שלילי (t0 &lt; 0) כאשר יש מחסומי רשת, או (C) בציר חיובי (t0 &gt; 0) כאשר יש מלכודות ותחומים (רפסודות שומנים). D הוא מקדם הדיפוזיה הלטרלי לתנועה בראונית; Deff, מקדם הדיפוזיה האפקטיבי; Dmicro, מקדם הדיפוזיה המיקרוסקופי בתוך מלכודות הרשת; Din, מקדם הדיפוזיה בתוך תחומים; Dout, מקדם הדיפוזיה מחוץ לתחומים; L, גודל הצד של תחום מרובע; ו-rD, הרדיוס של תחום מעגלי. נתון זה שונה מ-He ו-Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> איור 2: תצוגה סכמטית של בקרת החומרה של svFCS. המחשב שולט בכל המכשירים באמצעות פרוטוקולי תקשורת שונים: טורי (מיקרוסקופ, תריס חיצוני), USB (שלב פיאזואלקטרי XYZ, מתאם) ו- PCI (לוח רכישה). DAQ: לוח איסוף נתונים, APD: פוטודיודה מפולת שלגים, SPCM: מודול ספירת פוטונים בודדים, DO: פלט דיגיטלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> איור 3: תצוגה סכמטית של נתיבים אופטיים של עירור ופליטה של הגדרת svFCS. מערך ה-svFCS מכיל ארבעה מודולים: (1) התפוקה של לייזר 488 ננומטר עם סיבים מתנגשת, (2) שילוב של צלחת חצי גל ומפצל קרן מקטב קובע את העוצמה האופטית, (3) קרן הלייזר המתמקדת בדגימה לאחר שעברה דרך מיקרוסקופ ממונע ללא עדשת צינור, ו-(4) הפלואורסצנטיות מזוהה דרך נתיב זיהוי דמוי קונפוקל על פוטודיודה של מפולת שהוצמדה למודול ספירת פוטונים יחיד, המספק אות למתאם חומרה. הפשטות מעניקה למערכת את הרגישות, החוסן וקלות השימוש שלה (צוין בהרחבה בחומר משלים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> איור 4: חוקי הדיפוזיה של svFCS שנוצרו מניתוח דיפוזיה של Thy1-GFP שבאו לידי ביטוי ב-Cos-7. חוקי הדיפוזיה של svFCS של תאי Cos-7 ללא טיפול (NT, ריבועים שחורים) ולאחר טיפול באוקסידאז כולסטרול (COase, עיגולים אפורים). התוספת בגרף מייצגת בדיקה סטטיסטית של הבדל משמעותי בין שני חוקי הדיפוזיה של svFCS שהוצגו (על פי Mailfert et al.28). ערך הבדיקה (T) צריך להיות מעל הסף שנקבע ב- 3.8 כאשר שני חוקי הדיפוזיה שונים. ככל שהוא גבוה יותר, כך גדל ההבדל בין חוקי הדיפוזיה. הערך של T מקודד בצבע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> איור 5: השוואה של תכולת הכולסטרול הכוללת בתאי Cos-7. תאי Cos-7 לא טופלו (NT) או טופלו ב-1 U/mL של כולסטרול אוקסידאז (COase) במשך שעה אחת. הנתונים מייצגים דוגמה לניסוי אחד במשולש. מבחן t דו-זנב ולא מזווג שימש להערכת ההפרש הסטטיסטי (α=0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלת חומרים: רשימת האלמנטים האופטיים הנדרשים להגדרת svFCS.
חומר משלים: מסמך זה מתאר את בנייתה של הגדרת svFCS מאפס. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול כיצד לבנות מיקרוסקופ ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציה נקודתית כדי למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים.

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

התצוגה הנוכחית של הארגון הרוחבי של קרום הפלזמה נותרה לא שלמה. מסיבה זו, חשוב ליישם כמה טכניקות חדשניות חדשות כגון וריאציה נקודתית ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי. זוהי טכניקה חזקה מאוד המאופיינת בזמן מעולה וברזולוציה מרחבית.יתר על כן, הוא אינו פולשני ומאפשר לחקור את קרומי התאים בתנאים פיזיולוגיים. בכל יום לפני ביצוע ניסוי, פתחו את כל דיאפרגמות הקשתית והשתמשו במד כוח כדי למדוד את עוצמת הלייזר כשהקשתית הראשונה פתוחה במלואה. סובב את לוחית האמצע כדי לאתר את ההספק המרבי.אם עוצמת הלייזר נמוכה מהרגיל, השתמש בקשתית כדי לבדוק את היישור ולהזיז לסירוגין את L1 ו-M1 לפי הצורך. לאחר מכן רשום את ערך ההספק במחברת מעבדה. כדי לבדוק את נתיב הזיהוי, הנח מים, החלקת כיסוי וטיפה של שני תמיסת רודמין 6G ננו-מולרית על המטרה.לאחר מכן הפעל את תוכנת המתאם ורשום את הנתונים. פונקציית המתאם האוטומטי אמורה להציג כמות נמוכה של רעש, גודל פסולת קטן וקצב ספירה גבוה למולקולה לשנייה. כדי לכייל את גודל הנקודה, הנח תעודת כיסוי מקודדת תרבית תאים על יעד הטבילה במים והוסף 200 מיקרוליטר של שני תמיסת רודמין 6G ננו-מולרית להחלקת הכיסוי.התאם את עוצמת קרן הלייזר של 488 ננומטר ל-300 מיקרו-וואט ובתוכנה, בחר את יציאת מיקרוסקופ זיהוי התאורה svFCS. הפעל את ה-APD ופתח את הקשתית עד שיורד אות כדי להשיג את גודל הפסולת המינימלי או סגור אותו לגודל פסולת גדול יותר. רשום כ-10 פונקציות מתאם אוטומטי של 20 שניות כדי לשפר את יכולת השחזור הסטטיסטית ולכבות את ה-APD.בתוכנית ניתוח נתונים מתאימה, בדוק והשליך את הריצות עם תנודות חזקות עקב אגרגטים מולקולריים, ולאחר מכן התאם את הממוצע של פונקציית המתאם האוטומטי שנשמרה עם מודל דיפוזיה תלת מימדית, חלץ את זמן הדיפוזיה הממוצע מהפרמטרים המתאימים ושמור את הנתונים כקובץ TXT. לניתוח svFCS, כוונן את אלומת ה-488 ננומטר המופעלת בין שניים לארבעה מיקרו-וואט ואזן את הדגימות למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בחר את יציאת המיקרוסקופ לזיהוי תאורה svFCS, וב-APD.לאחר מכן, בצע סריקת XY וסריקת Z של התא שנבחר. בחר את קרום הפלזמה בחלק העליון של התא כדי לאתר את הנקודה הקונפוקלית בעוצמת הקרינה המקסימלית ולהתחיל ברכישת הנתונים. בתוכנת המתאם, הקלט סדרה אחת של 20 ריצות של חמש שניות.לאחר הריצה האחרונה, כבה את ה-APD והשליך כל ריצה בלתי צפויה כפי שהודגם. התאם את פונקציית המתאם האוטומטי הממוצעת עם מודל דיפוזיה דו-ממדי של שני מינים ושמור את פרמטרי ההתאמה בקובץ ה-TXT שנשמר בעבר. לאחר שתועדו כל התאים המעניינים, נתח לפחות ארבעה גדלי פסולת הנעים בין 200 ל-400 ננומטר כדי לקבוע חוק דיפוזיה יחיד.לאחר מכן ב-MATLAB, בחר תיקיה המכילה את כל קבצי ה-TXT המתאימים לפחות לארבעה ניסויים בגודל פסולת ושרטט את זמן הדיפוזיה לעומת הפסולת הריבועית. באיור זה ניתן לראות חוק דיפוזיה עבור Thy1-GFP המתבטא בתאי Cos7. לחוק הדיפוזיה יש ערך אפס זמן חיובי, המצביע על כך שה-Thy1-GFP מוגבל בתוך מבני תחום ננו של קרום הפלזמה.בניתוח זה, הטיפול בכולסטרול אוקסידאז בתאים המבטאים Thy1-GFP הביא לשינוי ערך זמן אפס של חוק הדיפוזיה ל-7.36 פלוס מינוס 1.34 אלפיות השנייה. אישור כי אופי הכליאה של Thy1-GFP תלוי בתכולת הכולסטרול וקשור לתחומי ננו רפסודת שומנים. ירידה קטנה אך משמעותית בתכולת הכולסטרול הכוללת נצפתה גם לאחר הטיפול בכולסטרול אוקסידאז.מכיוון שאנזים זה פועל רק על מאגר הכולסטרול הנגיש בעלון החיצוני של קרום הפלזמה, נתונים אלה מצביעים על כך שהירידה הנצפית בכולסטרול קשורה רק לקרום הפלזמה וגורמת לערעור היציבות של תחומי הננו של רפסודת השומנים. הדבר החשוב ביותר כאשר מנסים הליך זה הוא כיול נכון של מערכת svFCS והכנת תאים לניתוח. svFCS הוא כלי מצוין לחקר ארגון קרום התא.עם זאת, ניתן להשתמש בו גם כדי לנתח את הדיפוזיה של מולקולות תוך תאיות. ניתן ליישם טכניקה זו בהצלחה בביו-רפואה על מנת לקבוע את השפעת התרופות הפוטנציאליות על תאים חיים כגון תאים סרטניים.

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

טכניקה לחקור את הרפסודה השומנים חלוקה של חלבונים ניאון על הממברנה של התאים החיים המתואר. הוא מנצל את הפער בזמנים דיפוזיה של חלבונים המצויים בתוך או מחוץ רפסודות שומנים בדם. הרכישה יכולה להתבצע באופן דינמי בתנאי בקרה, או אחרי כן התרופה.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים.

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

מתוארת שיטה למדידת דיפוזיה של חלבון בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS). במאמר זה מודגם השימוש בנוגדנים לסימון פלואורסצנטי.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

מערכות אוטומטיות, פרוטוקולים עבור הכנת כמות גדולה של מסכי שגרתית ו nanoliter טיפות התגבשות לניסויים דיפוזיה אדי תיאר, דנו.

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

כאן, אנו מציגים טיפול נסיוני זה יכול להיות מועסק כדי לקבוע את הזיקות מחייב ואת מצב של האינטראקציה של פוספוליפיד מחייב חלבון ללא תווית annexin A2 עם קיבוע הנתמכות על-ידי מוצק bilayers (סאט גלובל) על ידי מדידת בו זמנית ספיגת המוני, המאפיינים viscoelastic של החלבון annexin A2.

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

למד ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים. השיטה מאפשרת מדידת השפעת כולסטרול על ארגון הממברנה בזמן אמת.

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

גלה סרטונים נוספים