ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים
12 בנובמבר 2020
מאמר זה נועד להציג פרוטוקול כיצד לבנות מיקרוסקופ ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציה נקודתית כדי למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים.
התצוגה הנוכחית של הארגון הרוחבי של קרום הפלזמה נותרה לא שלמה. מסיבה זו, חשוב ליישם כמה טכניקות חדשניות חדשות כגון וריאציה נקודתית ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי. זוהי טכניקה חזקה מאוד המאופיינת בזמן מעולה וברזולוציה מרחבית.
יתר על כן, הוא אינו פולשני ומאפשר לחקור את קרומי התאים בתנאים פיזיולוגיים. בכל יום לפני ביצוע ניסוי, פתחו את כל דיאפרגמות הקשתית והשתמשו במד כוח כדי למדוד את עוצמת הלייזר כשהקשתית הראשונה פתוחה במלואה. סובב את לוחית האמצע כדי לאתר את ההספק המרבי.
אם עוצמת הלייזר נמוכה מהרגיל, השתמש בקשתית כדי לבדוק את היישור ולהזיז לסירוגין את L1 ו-M1 לפי הצורך. לאחר מכן רשום את ערך ההספק במחברת מעבדה. כדי לבדוק את נתיב הזיהוי, הנח מים, החלקת כיסוי וטיפה של שני תמיסת רודמין 6G ננו-מולרית על המטרה.
לאחר מכן הפעל את תוכנת המתאם ורשום את הנתונים. פונקציית המתאם האוטומטי אמורה להציג כמות נמוכה של רעש, גודל פסולת קטן וקצב ספירה גבוה למולקולה לשנייה. כדי לכייל את גודל הנקודה, הנח תעודת כיסוי מקודדת תרבית תאים על יעד הטבילה במים והוסף 200 מיקרוליטר של שני תמיסת רודמין 6G ננו-מולרית להחלקת הכיסוי.
התאם את עוצמת קרן הלייזר של 488 ננומטר ל-300 מיקרו-וואט ובתוכנה, בחר את יציאת מיקרוסקופ זיהוי התאורה svFCS. הפעל את ה-APD ופתח את הקשתית עד שיורד אות כדי להשיג את גודל הפסולת המינימלי או סגור אותו לגודל פסולת גדול יותר. רשום כ-10 פונקציות מתאם אוטומטי של 20 שניות כדי לשפר את יכולת השחזור הסטטיסטית ולכבות את ה-APD.
בתוכנית ניתוח נתונים מתאימה, בדוק והשליך את הריצות עם תנודות חזקות עקב אגרגטים מולקולריים, ולאחר מכן התאם את הממוצע של פונקציית המתאם האוטומטי שנשמרה עם מודל דיפוזיה תלת מימדית, חלץ את זמן הדיפוזיה הממוצע מהפרמטרים המתאימים ושמור את הנתונים כקובץ TXT. לניתוח svFCS, כוונן את אלומת ה-488 ננומטר המופעלת בין שניים לארבעה מיקרו-וואט ואזן את הדגימות למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בחר את יציאת המיקרוסקופ לזיהוי תאורה svFCS, וב-APD.
לאחר מכן, בצע סריקת XY וסריקת Z של התא שנבחר. בחר את קרום הפלזמה בחלק העליון של התא כדי לאתר את הנקודה הקונפוקלית בעוצמת הקרינה המקסימלית ולהתחיל ברכישת הנתונים. בתוכנת המתאם, הקלט סדרה אחת של 20 ריצות של חמש שניות.
לאחר הריצה האחרונה, כבה את ה-APD והשליך כל ריצה בלתי צפויה כפי שהודגם. התאם את פונקציית המתאם האוטומטי הממוצעת עם מודל דיפוזיה דו-ממדי של שני מינים ושמור את פרמטרי ההתאמה בקובץ ה-TXT שנשמר בעבר. לאחר שתועדו כל התאים המעניינים, נתח לפחות ארבעה גדלי פסולת הנעים בין 200 ל-400 ננומטר כדי לקבוע חוק דיפוזיה יחיד.
לאחר מכן ב-MATLAB, בחר תיקיה המכילה את כל קבצי ה-TXT המתאימים לפחות לארבעה ניסויים בגודל פסולת ושרטט את זמן הדיפוזיה לעומת הפסולת הריבועית. באיור זה ניתן לראות חוק דיפוזיה עבור Thy1-GFP המתבטא בתאי Cos7. לחוק הדיפוזיה יש ערך אפס זמן חיובי, המצביע על כך שה-Thy1-GFP מוגבל בתוך מבני תחום ננו של קרום הפלזמה.
בניתוח זה, הטיפול בכולסטרול אוקסידאז בתאים המבטאים Thy1-GFP הביא לשינוי ערך זמן אפס של חוק הדיפוזיה ל-7.36 פלוס מינוס 1.34 אלפיות השנייה. אישור כי אופי הכליאה של Thy1-GFP תלוי בתכולת הכולסטרול וקשור לתחומי ננו רפסודת שומנים. ירידה קטנה אך משמעותית בתכולת הכולסטרול הכוללת נצפתה גם לאחר הטיפול בכולסטרול אוקסידאז.
מכיוון שאנזים זה פועל רק על מאגר הכולסטרול הנגיש בעלון החיצוני של קרום הפלזמה, נתונים אלה מצביעים על כך שהירידה הנצפית בכולסטרול קשורה רק לקרום הפלזמה וגורמת לערעור היציבות של תחומי הננו של רפסודת השומנים. הדבר החשוב ביותר כאשר מנסים הליך זה הוא כיול נכון של מערכת svFCS והכנת תאים לניתוח. svFCS הוא כלי מצוין לחקר ארגון קרום התא.
עם זאת, ניתן להשתמש בו גם כדי לנתח את הדיפוזיה של מולקולות תוך תאיות. ניתן ליישם טכניקה זו בהצלחה בביו-רפואה על מנת לקבוע את השפעת התרופות הפוטנציאליות על תאים חיים כגון תאים סרטניים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבניית מיקרוסקופ של ספקטרוסקופיית קורלציית פלואורסצנציה עם וריאציית נקודות (svFCS) למדידת דיפוזיה מולקולרית בממברנה הפלזמית של תאים חיים. הטכניקה מציעה רזולוציה זמנית ומרחבית מצוינת תוך שהיא אינה פולשנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- הארגון הלטרלי של ממברנת הפלזמה אינו מובן במלואו.
- דרושות טכניקות חדשניות כגון svFCS לקבלת תובנות טובות יותר.
- svFCS מאפשרת לחקור ממברנות של תאים תחת תנאים פיזיולוגיים.
- כיול נכון והכנת תאים הן קריטיות להשגת תוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול למיקרוסקופיית svFCS.
- מדידת דיפוזיה מולקולרית בממברנה הפלזמית.
- ניתוח השפעת הכולסטרול על ארגון הממברנה.
שיטות ששימשו במחקר
- כיול של מערכת ה-svFCS באמצעות תמיסת rhodamine 6G.
- רכישת נתונים באמצעות סריקות XY ו-Z של תאים נבחרים.
- ניתוח של חוקי דיפוזיה באמצעות MATLAB.
- השוואת פרמטרי דיפוזיה לפני ואחרי טיפול ב-cholesterol oxidase.
תוצאות עיקריות
- דיפוזיית Thy1-GFP מוגבלת למבני ננו-דומיין.
- טיפול בכולסטרול אוקסידאז משנה את ערך זמן האפס של חוק הדיפוזיה.
- נצפתה ירידה בתכולת הכולסטרול הכוללת.
- המחקר מצביע על כך שכולסטרול משפיע על יציבות רפסים ליפידיים.
מסקנות
- svFCS יעילה לחקר ארגון ממברנת התא.
- ניתן להשתמש בטכניקה זו גם לניתוח דיפוזיה של מולקולות תוך-תאיות.
- לממצאים יש השלכות על הבנת השפעותיהם של תרופות על תאים חיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ספקטרוסקופיית קורלציה של פלואורסצנציה עם וריאציית נקודה (svFCS) מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של דיפוזיה מולקולרית בממברנה הפלזמית בתנאים פיזיולוגיים, ומספקת תובנות קריטיות לגבי ארגון הממברנה ודינמיקה של רפטים ליפידיים. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות באמצעות הבהרת ההקשר הביופיזיקלי של חלבונים הקשורים לממברנה, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנוניים בשלבי הגילוי המוקדמים. אופיה הבלתי פולשני של השיטה ותאימותה לתאים חיים מגבירים את יעילותה בסריקה פרה-קלינית ובמחקרים של סממנים ביולוגיים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות כימות התנהגות הדיפוזיה של חלבוני ממברנה כגון Thy1-GFP בתוך מבני ננו-דומיין.
- ערך תפעולי: חושף כליאה תלוית כולסטרול, המאפשרת תיקוף פונקציונלי של קשרי רפטי ליפידים (lipid raft).
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מטרות שמיקום הממברנה שלהן רגיש להפרעות בסביבת הליפידים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות באמצעות קביעת חוקי דיפוזיה בסיסיים בתנאים פיזיולוגיים.
- פלט כמותי: יצירת מדידות זמן דיפוזיה הניתנות לשחזור עבור גדלי מותני קרן (beam waist) משתנים, התומכות בסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- רלוונטיות לסריקה: זיהוי שינויים בפרמטרי הדיפוזיה המושרים על ידי תרכובות, המעידים על שינויים בארגון הממברנה או על קישור למטרה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה שיבוש של ננו-דומיינים ברפתי ממברנה פלזמית, רלוונטי לפתולוגיות הכוללות הפרות בוויסות ליפידים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין תצפיות בשלבי הגילוי המוקדמים לבין תיקוף פרה-קליני, על ידי הדגמה כיצד הפרעות סביבתיות (למשל, מודולציה של כולסטרול) משנות את התנהגות המטרה.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מדדים מכניסטיים המנחים קריטריוני go/no-go בהתבסס על עמידות המטרה להפרעות בממברנה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת svFCS משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, ומספקת שכבה של אפיון ביופיזיקלי המשלים בדיקות ביוכימיות ופנוטיפיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת היפותזות באמצעות מדידת מקדמי דיפוזיה וזיהוי אוכלוסיות מולקולריות מוגבלות לעומת ניידות.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות כיול סטנדרטי באמצעות rhodamine 6G ותיקוף של שלמות נתיב הגילוי.
- אנליטיקה: מספק חוקי דיפוזיה כמותיים באמצעות ניתוח MATLAB של פונקציות אוטו-קורלציה, המאפשר השוואה של התנהגות מולקולרית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויים בארגון הממברנה לתוצאות פונקציונליות, ותומך בהתאמת ביומרקרים כאשר שינויי דיפוזיה נמצאים במתאם עם תגובות פנוטיפיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר דינמיקה של חלבוני ממברנה על פני מספר מטרות וקווי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי פתרון בעיות של כליאה בננו-קנה מידה והטרוגניות של דיפוזיה בממברנה הפלזמית.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות כיול סטנדרטי של הספק הלייזר, בדיקות של נתיב הגילוי וממוצע של פונקציות אוטוקורלציה מחזרות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי כימות יציבות המטרה בסביבות ממברנה דמויות-טבע, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב חסרונות ביופיזיקליים בלתי צפויים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מטרות בהתבסס על תלותן בשלמות רפטי ליפידים (lipid rafts) לצורך לוקליזציה ותפקוד תקינים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בטיחות בלייזר ובניתוח נתוני ספקטרוסקופיית קורלציה.
- נדרש מיקרוסקופ פלואורסצנטי מותאם אישית עם APD, תוכנת קורלטור ובקרת הספק לייזר מדויקת (2–4 µW למדידות svFCS).
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי כיול (לדוגמה, תיקוף גודל נקודה של rhodamine 6G) ושל צינורות עיבוד נתונים (לדוגמה, התאמה של מודלי דיפוזיה דו-ממדיים ב-MATLAB).
- כולל שיקולי התאמה עבור חלבוני ממברנה שונים, סוגי תאים וחומרי הפרעה מעבר ל-cholesterol oxidase.
- מוגבל על ידי הצורך בהכנה קפדנית של הדגימות כדי למנוע צברים מולקולריים ולהבטיח רלוונטיות פיזיולוגית במהלך שיווי משקל ב-37°C.
