Name: ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: חקור את ההשפעות המכניות על התחדשות רקמות באמצעות ביו-ריאקטור רב-שלבי. הפרוטוקול מדגים תרבית דינמית של מקרופאגים ומיופיברובלסטים אנושיים בתוך פיגומים אלקטרוספונים צינוריים לפיתוח שתלים וסקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך כלכלית על ידי ZonMw כחלק מתוכנית LSH 2Treat (436001003) וקרן הכליות ההולנדית (14a2d507). N.A.K. מכיר בתמיכת מועצת המחקר האירופית (851960). אנו מכירים בהכרת תודה בתוכנית הכבידה "התחדשות מונעת חומרים", במימון הארגון ההולנדי למחקר מדעי (024.003.013).

למחברים אין מה לחשוף.

הביו-ריאקטור המתואר כאן מאפשר הערכה שיטתית של תרומתו של האדם וההשפעות המשולבות של לחץ גזוז ומתיחות מחזוריות על דלקת והתחדשות רקמות בפיגומים צינוריים הניתנים לשחזור. גישה זו מאפשרת גם לבצע מגוון רחב של ניתוחים על מבנים וסקולריים, כפי שמדגים בסעיף התוצאות הייצוגיות. תוצאות אלה מראות את ההשפעה הייחודית של משטרי הטעינה ההודינמיים השונים (כלומר, שילובים שונים של גיסת ומתיחה) הן על הצמיחה והן על השיפוץ של מבנה TEVG. תובנות אלה, שנאספו באמצעות פלטפורמת במבחנה זו, מסייעות באופטימיזציה של פרמטרי עיצוב פיגומים עבור TEVGs ממוקמים ח...

הנדסת רקמות לב וכלי דם (TE) נרדפת כאפשרות טיפול חלופית לתותבות הלב וכלי הדם הקבועות הנמצאות בשימוש כיום (למשל, שתלי כלי דם, תחליפי שסתום לב), שהן תת-אופטימליות עבור קבוצות גדולות שלחולים 1,2,3,4. יישומים מבוקשים רבים כוללים שתלים וסקולריים מהונדסים רקמה (TEVGs)5,6 ושסתומי לב (TEHVs)7,8. לרוב, מתודולוגיות TE לב וכלי דם לעשות שימוש ביו-חומרים הניתנים למיחזור (טבעי או סינתטי) המשמשים פיגום מאלף עבור הרקמה החדשה להיווצר. היווצרות של רקמה חדשה יכולה להיות מהונדסת לחלוטין במבחנה, על ידי זריעת הפיגומים עם תאים ו culturing ב bioreactor לפני ההשתלה (במבחנה TE)9,10,11, או ישירות במקום, שבו הפיגומים הסינתטי מושתל ללא פולחן מראש על מנת לגרום להיווצרות של רקמה חדשה ישירות בגוף (במקום TE)12,13,14. הן במבחנה והן בגישות TE לב וכלי דם במקום, התחדשות תפקודית מוצלחת תלויה באופן דומיננטי הן בתגובה החיסונית המארחת למבנה המושתל והן בטעינה ביומכנית מתאימה.
החשיבות של טעינה ביומכנית עבור TE לב וכלי דם הוא מוכר היטב15. במקרה של שתלים לב וכלי דם, התאים המאכלסים את הפיגומים חשופים למתיחות מחזוריות וללחצי גיסת המתעוררים כתוצאה מהסביבה המודינמית. מחקרים רבים דיווחו על ההשפעה הממריצת של מתיחה (מחזורית) על היווצרות רכיבי מטריצה, כגון קולגן16,17,18,19, גליקוזאמינוגליקאנים (GAGs)20, ואלסטין21,22, על ידי סוגי תאים שונים. לדוגמה, הואנג ואח ' הוכיח כי מתיחה biaxial העלה את התצהיר ואת הארגון של קולגן ואלסטין במבחנה TEVGs באמצעות bioreactor כלי דם23. בעוד הדגש טמון בדרך כלל על מתיחה כמו עומס דומיננטי, מחקרים אלה לעתים קרובות לעשות שימוש ביו-קטרקטורים מונחה זרימה שבו המדגם חשוף גם לזרימת גיסת. למרות מעט יחסית ידוע על ההשפעה המבודדת של לחצי גיזה על היווצרות רקמות ודלקת בתלת ממד, כמה נתונים זמינים. לדוגמה, Hinderer et al. ו Eoh ואח ' הוכיח כי זרימת הגלד, בנוסף מיקרו פיגומים 3D, היה חשוב להיווצרות של אלסטין בוגר על ידי תאי שריר חלקים כלי דם אנושיים במערכת מודל במבחנה24,25. בסך הכל, ממצאים אלה ממחישים את הרלוונטיות של מתיחות מחזוריות ומתח גיסת עבור TE לב וכלי דם.
גורם חשוב נוסף להצלחה או לכישלון של שתלי TE הוא התגובה החיסונית של הפונדקאי לשתל המושתל26. זה חשוב במיוחד עבור חומרים מונעים באסטרטגיות TE situ, אשר למעשה מסתמכים על התגובה הדלקתית החריפה לפיגומים כדי להתחיל את התהליכים הבאים של זרם הסלולר היווצרות רקמות אנדוגני ושיפוץ27. המקרופאג ' הוא יוזם קריטי שלהתחדשות רקמותפונקציונלית, אשר הוכח על ידי מחקרים מרובים 28,29,30. מקביל לריפוי פצעים, התחדשות הרקמה נשלטת על ידי איתות פרקרינית בין מקרופאגים ותאים המייצרים רקמות כגון פיברובלסטים ומיופיברובלסטים31,32,33. בנוסף לתיאום תצהיר רקמות חדש, מקרופאגים מעורבים בספיגה פעילה של חומר פיגומיםזרים 34,35. ככזה, תגובת המקרופאג' במבחנה לביו-חומרים זוהתה כפרמטר חזוי להצלחת in vivo של שתלים36,37,38.
תגובת המקרופאג' לפיגומים מושתלים תלויה בתכונות עיצוב פיגומים כגון הרכב חומרים ומיקרו מבנה35,39,40. בנוסף לתכונות הפיגומים, תגובת המקרופאג' לפיגומים וההצלבה שלהם עם מיופיברובלסטים מושפעת גם מעומסים המודינמיים. לדוגמה, מתיחה מחזורית הוצגה כמאפנן חשוב של פנוטיפ מקרופאג'41,42,43,44 והפרשת ציטוקינים43,44,45,46 בפיגומי אלקטרוזופון תלת-ממדיים. באמצעות מערכת תרבית משותפת של מקרופאגים ותאי שריר חלקים וסקולריים, Battiston et al. הוכיח כי נוכחות של מקרופאגים הובילה לרמות גבוהות יותר של אלסטין ו GAGs וכי רמות מתונות של מתיחה מחזורית (1.07-1.10) עוררו את התצהיר של קולגן אני ואלסטין47. בעבודות קודמות, הוכחנו כי מתח גיזה הוא דטרמיננטה חשובה לגיוס מונוציטים לתוך פיגומי אלקטרו-ספון תלת מימדיים48,49, וכי הן מתח גיסת ומתיחה מחזורית משפיעות על האיתות הפרקריני בין מונוציטים אנושיים ותאי סטרומה מזנכימליים50. Fahy et al. הראה כי זרימת הגלד הגדילה את הפרשת ציטוקינים פרו דלקתיים על ידי מונוציטים אנושיים51.
יחד, הראיות לעיל מראות כי הבנה נאותה ושליטה על עומסים hemodynamic הוא חיוני עבור TE לב וכלי דם, וכי חשוב לשקול את התגובה הדלקתית כדי להשיג זאת. ביו-רקטורים רבים תוארו בעבר עבור במבחנה52,53,54,55,56,57,58 או ex vivo59,60,61 תרבות של רקמות לב וכלי דם. עם זאת, כל המערכות הללו נועדו לחקות את תנאי הטעינה ההמודינמית הפיזיולוגיים ככל האפשר. אמנם זה בעל ערך רב לצורך יצירת רקמות לב וכלי דם במבחנה או שמירה על תרביות ex vivo, מערכות כאלה אינן מאפשרות מחקרים שיטתיים לתוך ההשפעות האישיות של רמזים בודדים. הסיבה לכך היא היישום של מתח מחזורי ומתח גיסת אלה מונע על ידי אותה זרימה בלחץ, אשר באופן מהותי מקשר אותם. בעוד מיקרו-מערכות המאפשרות מניפולציה מכנית רב-מדומה מדויקת תוארו עבור מצעים דו-ממדיים62 או 3D הגדרות הידרוג'ל63,64, הגדרות כאלה אינן מאפשרות שילוב של פיגומים ביו-חומריים תלת-חומריים אלסטומרים.
כאן, אנו מציגים את היישום של מערכת bioreactor צינורית המאפשרת באופן ייחודי ניתוק של מתח גיסת ומתיחה מחזורית ומסייעת לחקור באופן מכני את ההשפעות האישיות והמשולבים שלהם. מערכת זו מאפשרת בדיקה של מגוון רחב של שתלי כלי דם מהונדסים רקמה (למשל, מקור סינתטי או טבעי, מיקרו-ארכיטקטורה שונה, נקבוביות שונות). כדי לנתק ביעילות את היישום של מתח הגיה ומתיחה, מושגי המפתח שבהם משתמש הביו-ריאקטור הם (1) הפרדה של השליטה בלחץ הגיסה ומתיחה באמצעות מערכות משאבה נפרדות ו-(2) גירוי של הפיגומים באופן 'מבפנים החוצה' עם ממדים מונעים חישובית. הזרימה מוחלת על פני השטח החיצוניים של הפיגומים הצינוריים באמצעות משאבת זרימה, ואילו מתיחה היקפית של הפיגומים מושרה על ידי הרחבת צינור סיליקון שעליו מותקן הפיגומים באמצעות משאבת מאמץ נפרדת. הממדים של צינור הסיליקון וצינור הזכוכית המכיל את המבנה נבחרים בקפידה ומאומתים באמצעות סימולציות דינמיקה של נוזלים חישוביים, כדי להבטיח כי לחץ הגיזה על הפיגומים (עקב זרימה) והמתיחת ההיקפית (עקב הרחבת הצינור) אינם משפיעים באופן משמעותי זה על זה. לעיצוב מבפנים החוצה זה יש כמה רציונלים מעשיים. אם המתיחה מוחלת על ידי לחץ הנוזלים הזוהרים (בדומה לטעינה פיזיולוגית), היא דורשת מטבעה שעיצוב המדגם יהיה נטול דליפות. בנוסף, הלחץ הנדרש כדי למתוח את המדגם ייקבע לחלוטין על ידי נוקשות המדגם, אשר עשוי להשתנות בין דגימות בתוך מדגם לאורך זמן, מה שמקשה על השליטה במתיחה. ביו-ריקטור זה מרכיב את השתל המהונדס על הרקמה סביב צינור סיליקון ומאפשר ליישום מתח גזיזת קיר (WSS) על הקיר החיצוני של השתל ולוחץ על השתל מבפנים. בדרך זו, תנאי טעינה שווים בין דגימות ובתוך דגימות לאורך זמן ניתן להבטיח, יתר על כן, הדגימות מותר להיות דולף, כמקובל עבור פיגומים כלי דם נקבובי19. ביו-ריאקטור מבפנים החוצה זה מיועד במיוחד למחקרים שיטתיים על ההשפעות של גיזום ו/או מתיחה, ולא ההנדסה של כלי דם דמוי יליד במבחנה, שעבורו תצורות ביו-ריאקטור כלי דם מסורתיות מתאימות יותר. ראה איור 1A-B עבור ציורי העיצוב של הביו-ריאקטור, ואת הטבלה המתאימה 1 לתיאור פונקציונלי ורציונל מאחורי המרכיבים העיקריים של הביו-ריאקטור.
השימוש bioreactor הוא הודגם על בסיס סדרה של מחקרים אחרונים על ידי הקבוצה שלנו שבו חקרנו את ההשפעות הפרט והשילוב של מתח גזוז ומתיחה מחזורית על דלקת היווצרות רקמות פיגומי אלקטרו-ספון resorbable עבור רקמת לב וכלי דם במקום19,43,44. כדי לכך, השתמשנו במקרופלגות אנושיות ובמיאופיברובלסטים במונו או בתרבות משותפת כדי לדמות את השלבים השונים של מפל ההתחדשות במקום. הוכחנו כי הפרשת ציטוקינים על ידי מקרופאגים אנושיים מושפעת באופן מובהק הן על ידי מתח מתיחה מחזורית והן על ידי לחץ גיסת, המשפיעים על תצהיר המטריצה וארגון על ידי מיופיברובלסטים אנושיים בפיגומים אלה, הן באמצעות איתות פרקרין והן על מגע ישיר19,43,44. ראוי לציין, מחקרים אלה גילו כי במקרה של יישום משולב של מתח גיסת ומתיחה, ההשפעות על היווצרות רקמות ודלקת נשלטים על ידי אחד משני העומסים, או שיש השפעות סינרגטיות של שני העומסים. ממצאים אלה ממחישים את הרלוונטיות של ניתוק שני העומסים כדי להבין טוב יותר את תרומת הסביבה המכנית בתהליכי TE. הבנה זו יכולה להיות מיושמת כדי לייעל באופן שיטתי את הפרמטרים של עיצוב פיגומים במשטרי טעינה המונמיים רלוונטיים. בנוסף, הנתונים המכניסטיים מסביבות מבוקרות כגון עשויים לשמש קלט עבור מודלים מספריים המפותחים כדי לחזות את מהלך שיפוץ רקמת situ, כפי שדווח לאחרונה עבור TEVGs65 או TEHVs66, כדי לשפר עוד יותר את יכולת החיזוי.

<table><tbody><tr><td>דולבקו מתקדם s שונה EagleMedium (aDMEM)</td> <td>Gibco</td><td>12491-015</td><td>מדיום תרבית תאים לפיברובלסטים</td></tr><tr><td>Aqua Stabil</td><td>Julabo</td><td>8940012</td><td>למנוע צמיחת מיקרואורגניזמים במאגר ביו-ריאקטור-הידראולי</td></tr><tr><td>פיברינוגן בקר</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td>להכנת ג'ל פיברינוגן לזרוע את התאים על פיגום ה-Electrospun</td></tr><tr><td>תרומבין בקר</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td>להכנת ג'ל פיברינוגן לזרוע את התאים על הפיגום החשמלי</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td>לסובב תאים ומדיום מותנה</td></tr><tr><td>מספריים מהדק - "מלקחיים קלי"</td><td>Almedic</td><td>P-422</td><td>מהדקים את צינור הסיליקון ומורחים מתיחה מוקדמת על הפיגום כך שניתן יהיה לתפור את הפיגום לתוך החריץ החרוט (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr><tr><td>חממות תרבית תאי CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-170AIC-PE</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>מאגר אוויר דחוס</td><td>Festo</td><td>CRVZS-5</td><td>מחליק תנודות בלחץ האוויר ויוצר עיכובי זמן להצטברות לחץ</td></tr><tr><td>סקריפט Matlab מותאם אישית לחישוב המתיחות המקסימליות</td><td>Matlab</td><td>R2017. ה-Mathworks, Natick, MA</td><td>מחשבים את הקוטר החיצוני המינימלי והמקסימלי של הפיגום האלקטרוספון</td></tr><tr><td>לוח רכישת נתונים</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td>עיבוד נתונים בין מערכת המגבר למחשב</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>VWRK4096-9005</td><td>כדי לשמור על תנאי עבודה סטריליים</td></tr><tr><td>סרום עגל בקר עוברי (FBS)</td><td>גריינר</td><td>758087</td><td>תוסף מדיום תרבית תאים; תוסף סרום</td></tr><tr><td>תאי תא תרבית זרימה, המורכבים מצינור לחץ עם חריצים חרוטים וחורים קטנים להפעלת לחץ על צינורות סיליקון, חוט בורג, חרוט אף, תא עליון עם כניסת זרימה ויציאת זרימת תא תחתון, תותב מתאם</td><td>בהתאמה אישית, המחלקה להנדסה ביו-רפואית, האוניברסיטה הטכנולוגית של איינדהובן</td><td>תאי</td> <td>תא תרבית זרימה (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr> <tr><td>עוזר</td> <td>צינור פסטר מזכוכית</td><td>HE40567002</td><td>להחיל ואקום על פיגום אלקטרוסון (חיטוי בשלב 1)</td></tr> <tr><td>צינורות זכוכית של תא תרבות הזרימה</td><td>שקוסטון עשה, ציוד & מרכז אב טיפוס, האוניברסיטה הטכנולוגית של איינדהובן</td><td>n.a.חלק</td> <td>מתא תרבית הזרימה (נקה ואחסן ב-70% אתנול, בשלב 1 ו-7)</td></tr> <tr><td></td><td>תוסף חומצות אמינו בינוני של GlutaMax Gibco 35050061 תרבית תאים, ממזער הצטברות אמוניה</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מצלמה במהירות גבוהה</td><td>MotionScope</td><td>M-5</td><td>לפקח על המתיחה במהלך התרבית; צילומי זמן-lapse של הפיגומים מצולמים בתדר של 30 הרץ למשך 6 שניות (כלומר 3 מחזורי מתיחה)</td></tr><tr><td>עדשת מצלמה במהירות גבוהה - Micro-NIKKOR 55 מ"מ f/2.8 - עדשת</td><td>Nikon</td><td>JAA616AB</td><td>לניטור המתיחה במהלך התרבית; צילומי זמן-lapse של הפיגומים מצולמים בתדר של 30 הרץ למשך 6 שניות (כלומר 3 מחזורי מתיחה)</td></tr><tr><td>תפס צינור</td><td>ibidi GmbH</td><td>10821</td><td>חוסם זרימה בינונית (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr> <tr><td>מאגר הידראולי עם 8 חוטי בורג ל -8 תאי תרבית זרימה</td><td>בהתאמה אישית, המחלקה להנדסה ביו-רפואית, האוניברסיטה הטכנולוגית של איינדהובן</td><td>n.a.</td> <td>כדי להפעיל לחץ על המבנים המותקנים בסיליקון (נקה מבחוץ עם רקמת נייר עם 70% אתנול, שטוף את המאגר עם 70% אתנול ואחריו דמי מים, בשלב 1 ו -7)</td></tr><tr><td>מערכת משאבות איבידי (8x) כולל משאבת איבידי, תוכנת PumpControl, יחידת נוזלים, סט זלוף (צינורות בינוניים), צינורות לחץ אוויר, בקבוקי ייבוש עם חרוזי סיליקה כתומים</td><td>ibidi GmbH</td><td>10902</td><td>שהוגדרו המשמשים לבקרת הזרימה בתאי תרבית הזרימה. הערה 1: משאבות ה-ibidi שונו על ידי היצרן כדי לאפשר קיבולת של 200 mbar. הערה 2: ניתן להחליף במערכת משאבה של יצרן אחר, כל עוד ניתן ליישם את אותם משטרי זרימה.</td></tr><tr><td>סכינים (מס' 10 להבים סטריליים, חבילת נייר כסף אישית) וידית אזמל (נירוסטה, עטופה בנפרד)</td> <td>Swann Morton</td><td>0301; 0933</td><td>כדי לחתוך את צינור הסיליקון בגודל הנכון לפיגום ולחתוך את חומר התפר</td></tr><tr><td>LabVIEW Software</td><td>National Instruments</td><td>גרסה 2018</td><td>כדי לשלוט במתיחה המופעלת על הפיגומים</td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית זרימה למינרית עם אור UV</td><td>Labconco</td><td>302310001</td><td>כדי להבטיח תנאי עבודה סטריליים. ה-UV משמש לטיהור כל מה שלא ניתן לבצע חיטוי, או לגעת בו לאחר חיטוי</td></tr><tr><td>צלחות פטרי גדולות וקטנות</td><td>Greiner</td><td>664-160</td><td>לתנאי עבודה סטריליים</td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית 2-פוספט (ויטמין C)</td> <td>תוסף מדיום תרבית תאים</td> <td>Sigma</td><td>A8960</td>, חשוב לייצור קולגן</tr> מקור <tr><td>אור LED קר KL2500</td><td>Zeiss</td><td>Schott AG</td><td>כדי לסייע בהדמיה של חלוף הזמן של הפיגומים במהלך ניטור</td></tr><tr><td>המנעולים והמחברים של Luer (נקבה וזכר), כובעי לואר לבנים</td><td>ibidi GmbH</td><td>שונים, ראה (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td> <td>לסגירה או חיבור של חלקים מהביו-ריאקטור ומשאבת ה-ibidi (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr><tr><td>מגבר מדידה (PICAS)</td><td>מכשירי PEEKEL BV.</td><td>n.a.כדי</td> <td>להגביר את האות מחיישן הלחץ והמשוב למאגר LabView</td></tr><tr><td>Medium (מזרקים גדולים 60 מ"ל) ולמחזיקי המאגר</td><td>ibidi GmbH</td><td>10974</td><td>מאגר בינוני (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr><tr><td>צינורות בינוניים בקוטר חיצוני של 4.25 מ"מ וקוטר פנימי של 1 מ"מ</td><td>גומי BV</td><td>1805</td><td>כדי לאפשר קצב זרימה גדול יותר, נעשה שימוש בצינור הבינוני של IBידי בקוטר גדול יותר. הערה: החלק של צינורות בינוניים המונחים דרך שסתומי היחידה הנוזלית זהים לצינורות ברירת המחדל הבינוניים של ibidi</td></tr><tr><td>Motion Studio Software</td><td>Idtvision</td><td>2.15.00</td><td>כדי ליצור את תמונות הזמן במהירות גבוהה לניטור מתיחה</td></tr><tr><td>מחט (19G)</td> <td>BD Microlance</td><td>301700</td><td>יחד עם צינורות גמישים דקים המשמשים למילוי המאגר ההידראולי במים טהורים במיוחד מבלי להוסיף בועות אוויר</td></tr><tr><td>נהג</td> <td>מחטAdson</td><td>2429218</td><td>לטפל במחט של תפר הניילון דרך צינור הסיליקון (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr> <tr><td>רקמות נייר</td><td>Kleenex</td><td>38044001</td><td>לניקוי הציוד עם 70% אתנול</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>תיקון מהיר אם מתרחשת דליפה</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (P/S)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>תוסף מדיום תרבית תאים; למנוע חיידקים זיהום</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>לשלבי אחסון וכביסה (חיטוי בשלב 1)</td></tr> <tr><td>מיכלי פלסטיק (60 מ"ל) עם מכסי בורג אדומים</td><td>גריינר</td><td>206202</td><td>להכנת תמיסת הפיברינוגן</td></tr><tr><td>צילינדר פנאומטי</td><td>Festo</td><td>AEVC-20-10-I-P</td><td>להפעלת מפוח הטפלון (נקה עם טישו נייר עם 70% אתנול בשלב 1 ו-7)</td></tr><tr><td>פיגומים צינוריים Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) (קוטר פנימי של 3 מ"מ, 200 ומיקרו; m עובי דופן, אורך 20 מ"מ)</td> <td>SyMO-Chem, איינדהובן, הולנד</td><td>n.a.מיוצר</td> <td>באמצעות אלקטרו-ספינינג מ-15% (w/w) כלורופורם (Sigma; 372978) תמיסות פולימר. ראה Van Haaften et al הנדסת רקמות חלק ג' (2018) לפרטים נוספים</td></tr><tr><td>צינור לחץ ללא חורים (לבקרה סטטית)</td> <td>בהתאמה אישית, המחלקה להנדסה ביו-רפואית, האוניברסיטה הטכנולוגית של איינדהובן</td><td>n.a.להרכיב</td> <td>צינורות אלקטרוספון על צינורות סיליקון (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr> <tr><td>חיישן לחץ ומתמר</td><td>BD</td><td>TC-XX ו- P 10 EZ</td><td>לחץ האוויר העובר למשאבה המופעלת הפנאומטית מוגבה עד שהיא מגיעה ללחץ שנקבע</td></tr><tr><td>שסתום בקרת לחץ אוויר פרופורציונלי וחיישן לחץ</td><td>Festo</td><td>MPPES-3-1/8-2-010,</td><td>159596 מספק אוויר דחוס למשאבה המופעלת פנאומטית</td></tr><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק 1640 (RPMI-1640)</td> מדיום תרבית תאים <td>A1049101 של Gibco</td><td></td><td>למונוציטים/מקרופאגים</td></tr> צינורות <tr><td>אפנדורף נעילה בטוחה (1.5 מ"ל)</td><td>אפנדורף</td><td>30120086</td><td>יישומים מרובים (אוטוקלב בשלב 1)</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן דודציל סולפט 20%</td> <td>סיגמא</td><td>5030</td><td>משמשת לניקוי חומרים, בריכוז של 0.1%.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>טבעות O מסיליקון</td><td>Technirub</td><td>1250S</td><td>למניעת דליפה (חיטוי בשלב 1, שלב 7)</td></tr> <tr><td>צינורות סיליקון (קוטר חיצוני 2.8 מ"מ, עובי דופן 400 אום)</td> <td>גומי BV</td><td>1805</td><td>להרכבת צינורות האלקטרוספון על צינורות הלחץ (חיטוי בשלב 1)</td></tr> <tr><td>צינור סטרילי (15 מ"ל)</td> <td>פלקון</td><td>352095</td><td>יישומים מרובים</td></tr><tr><td>תפר, 5-0 פרולן עם מחט</td> <td>נקודה מתחדדת מחוברת מראשאתיקון, ג'ונסון & חוט תפר ג'ונסון</td><td>EH7404H</td><td>פרולן 5-0 (אורך 75 ס"מ, מחט נקודת התחדדות TF, 1/2 עיגול, אורך מחט 13 מ"מ)</td></tr> <tr><td>מזרק (24 מ"ל)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>2057932</td><td>להוסיף את המים או המדיום האולטרה-טהורים למאגר ההידראולי או לתא תרבית הזרימה</td></tr><tr><td>מסנן מזרק (0.2 ומיקרו; מ)</td> <td>Satorius</td><td>17597-K</td><td>לסינון תמיסת הפיברינוגן</td></tr><tr><td>T150 בקבוק תרבית תאים עם מכסה מסנן</td><td>Nunc</td><td>178983</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>תאים T75 בקבוק תרבית תאים עם מכסה מסנן</td><td>Nunc</td><td>156499</td><td>לתרבית דגימות בקרה סטטיות</td></tr><tr><td>טפלון מפוח</td><td>בהתאמה אישית, המחלקה להנדסה ביו-רפואית, האוניברסיטה הטכנולוגית של איינדהובן</td><td>n.a.</td><td>להעמסת המאגר ההידראולי (נקה מבחוץ עם טישו נייר עם 70% אתנול בשלב 1 ו-7)</td></tr> <tr><td>מגש (נירוסטה)</td> <td>PolarWare</td><td>15-248</td><td>להובלה קלה של תאי התרבית הנוזלית והביו-ריאקטור מהחממה לארון הזרימה הלמינרית ובחזרה (נקה עם טישו נייר עם 70% אתנול לפני ואחרי השימוש)</td></tr> <tr><td>פינצטה</td><td>Wironit</td><td>4910</td><td>טיפול סטרילי בחלקים בודדים (חיטוי בשלב 1 ו-7)</td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>Stakpure</td><td>Omniapure UV 18200002</td><td>לתיקון אידוי בינוני, מעורבב עם אקווה סטביל מעורבב ומשמש כנוזל הידראולי. (מים אולטרה-טהורים בשלב 1)</td></tr><tr><td>אור UV</td><td>פיליפס</td><td>TUV 30W/G30 T8</td><td>לטיהור שתלים וחלקי ביו-ריאקטור לפני הזריעה</td></tr></tbody></table>

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

השימוש בביו-חומרים הניתנים למיחזור כדי לגרום להתחדשות ישירות בגוף הוא אסטרטגיה אטרקטיבית מנקודת מבט תרגומית. חומרים כאלה גורמים לתגובה דלקתית עם ההשתלה, שהיא המניע לספיגה מחדש של החומר והתחדשות של רקמה חדשה. אסטרטגיה זו, הידועה גם בשם הנדסת רקמות situ, הוא נרדף כדי להשיג תחליפי לב וכלי דם כגון שתלים וסקולריים מהונדסים רקמות. הן התהליכים הדלקתיים והן התהליכים המתחדשים נקבעים על ידי רמזים ביומכניים מקומיים על הפיגומים (כלומר, מתח מתיחה וגיסת). כאן, אנו מתארים בפירוט את השימוש בביורומטר שפותח בהתאמה אישית המאפשר באופן ייחודי ניתוק של מתח מתיחה וגימה על פיגום צינורי. זה מאפשר הערכה שיטתית ומתוקננת של היכולת הדלקתית וההתחדשותית של פיגומים צינוריים בהשפעת עומסים מכניים מבוקרים היטב, אשר אנו מדגימים על בסיס ניסוי דינמי של תרבות משותפת באמצעות מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים. הצעדים המעשיים העיקריים בגישה זו – בנייתו והקמתו של הביו-רהקטור, הכנת הפיגומים וזריעת התאים, היישום והתחזוקה של זרימת המתיחה וההגשה וקצירת הדגימה לניתוח – נדונים בפירוט.

bioreactor זה פותח כדי לחקור את ההשפעות הפרטניות והמשולבים של מתח גיסת ומתיחות מחזוריות על צמיחת רקמת כלי הדם ושיפוץ פיגומים ביו-חומרים תלת-ממדיים. העיצוב של הביו-ריאקטור מאפשר פולחן של עד שמונה מבני כלי דם בתנאי טעינה שונים(איור 1A). מבני כלי הדם ממוקמים בתא תרבות זרימה (איור 1B) שבו ניתן לשלוט באופן עצמאי הן במתיחה ההיקפית והן ב- WSS. התא העליון של תא תרבות הזרימה מכיל מחליק זרימה כדי לייצב את הזרימה באורך יישוב קצר יחסית(איור 1C).</strong...

מטרת הפרוטוקול הזה היא לבצע תרבות משותפת דינמית של מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים בפיגומי אלקטרו-ספון צינוריים כדי לחקור התחדשות רקמות מונחית חומרים, באמצעות ביו-ריאה המאפשרת ניתוק של לחץ גיסת ומתיחות מחזוריות.

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

עד כה, היה קשה מאוד לזהות את קשרי הסיבה והתוצאה בין המודינמיקה להתחדשות רקמות כלי הדם. וזה בגלל שזה מאתגר לשלוט בעומסים המכניים הבודדים. ביו-ריאקטור זה מאפשר לנו לחקור באופן מכני את ההשפעות האישיות והמשולבות של מתח טהור ומתיחה מחזורית על פוטנציאל ההתחדשות של מגוון רחב של שתלי כלי דם מהונדסים רקמות.מי שתדגים את ההליך הזה תהיה סוזן קוך, דוקטורנטית בקבוצה שלנו. וד"ר תמר ויסינג שהיא חוקרת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. כדי להרכיב את פיגום האלקטרו המסתובב על צינור הסיליקון, השחילו תפר פרולן 4-0 לקצה אחד של חתיכת צינור סיליקון והחוצה מהקצה השני.צרו קשר קטן משני צידי הצינור, השאירו כ -10 סנטימטרים של חוט על שני הקשרים וצרו קשר שלישי על גבי השניים. לאחר הסרת מחט תפרים, חתוך את שולי צינור הסיליקון לצורה משולשת וצור קשר סופי בקצה שני חוטי 10 סנטימטרים. טובלים את הפיגום המסתובב האלקטרו באתנול 30% ומניחים את הפיגום על קצה אחד של חוט תפר חופשי.לאחר מכן, מתחו בעדינות את שני צידי צינור הסיליקון וקשר התפר של 10 סנטימטר בזמן שהחוקר השני משתמש בפינצטה עם קצה פנימי חלק כדי להחליק בעדינות את פיגום האלקטרו המסתובב מעל הצינור. שחרר לאט את המתיחה על צינור הסיליקון ובמקביל החליק את הפיגום המסתובב עם הפינצטה. וטבלו את הפיגום וצינורות הסיליקון במים טהורים במיוחד פעמיים.בנה את התא התחתון וודא שטבעת ה-O ממוקמת כהלכה. הנח תותב מתאם בחלקו העליון של התא התחתון והנח את צינור הלחץ עם חורים דרך התא התחתון. שרוך את טבעת ה-O מסיליקון סביב הקצה התחתון של צינור הלחץ כדי למנוע דליפה.והברג את החלק התחתון של התא התחתון לחלקו העליון של התא התחתון כדי לאבטח את צינור הלחץ. ודא שהחריץ החרוט התחתון של צינור הלחץ נמצא כשלושה עד חמישה מילימטרים מעל קצה תותב המתאם של התא התחתון. משוך את צינור הסיליקון עם פיגום האלקטרו המסובב מעל צינור הלחץ והנהון ואת חוט התפר בקצה התחתון של פיגום האלקטרו המסתובב, במיקום החריץ החרוט על צינור הלחץ.הנהון שני בצד הנגדי כדי לאבטח היטב את צינור הסיליקון עם השתל המסתובב האלקטרו. והנחת מהדק מספריים המצויד בכלל בקצה העליון של צינור הסיליקון, משוך את מהדק המספריים כלפי מעלה בצורה עקבית ומשוך בעדינות את פיגום השריצה החשמלי כדי להסיר קמטים. השתמש בחוט תפר כדי ליצור שני קשרים בשני קצוות הפיגום בחריץ החרוט העליון של צינור הלחץ.לאחר ששני הקשרים נוצרו, שחרר את מהדק המספריים והשתמש בסכין כדי להסיר עודפי צינורות סיליקון. הברג את קונוסי האף על חוט הבורג של צינורות הלחץ עבור הדגימות שייטענו באופן דינמי. טבלו את צינור הלחץ, הצינורות והפיגום פעם אחת באתנול 30% ופעמיים במים טהורים במיוחד כדי להרטיב מראש את ההתקנה.הנח את צינור הזכוכית מעל צינור הלחץ ודחף בעדינות על התא התחתון כדי להדק את צינור הזכוכית במקומו. לאחר מכן הנח את מחליק הזרימה, טבעת O מסיליקון ותותב מתאם בתא העליון. ואבטח את התא מעל הקצה הפתוח של צינור הזכוכית.הסר את תקע הפיתוי הגברי משקע הזרימה, עבוד בארון זרימה למינרי סטרילי. פתח את מכסה הפיתוי הלבן והנח רקמת ספיגת אתנול מול יציאת הזרימה. פרק את תא תרבית הזרימה על ידי הורדת צינור הזכוכית עם התא העליון.הניחו צינור מרעה ואקום על הפיגום המסתובב האלקטרו כדי להסיר כמה שיותר מדיום. והוסף תמיסת פיברינוגן ביחס של אחד לאחד עם תרחיף התאים בתוספת תרומבין. פיפטו את התמיסה למעלה ולמטה פעם אחת וטפטפו מיד את התמיסה לכל אורך הפיגום.לאחר שכל התאים נמסרו, הזיזו את הפיגום באיטיות משמאל לימין ולמעלה ולמטה כדי להשיג פיזור אחיד של התאים. לאחר ששני צידי הפיגום נזרעו, שחזרו בזהירות את תא תרבית הזרימה על ידי החזרת צינור הזכוכית והתא העליון. והנח את תא תרבית הזרימה לתוך החממה כדי לאפשר לסיבים להתמצק.כדי לחבר את הביוריאקטור למערכת המשאבה, הנח את תא תרבית הזרימה על אחד משמונת הברגים בבסיס הביוריאקטור. והנח קליפ מארח על הצינור הבינוני. הסר את מכסה הפיתוי הלבן, המכסה את כניסת הזרימה של התא העליון של תא תרבית הזרימה והסר את מצמד הפיתוי הנקבי של הצינור הבינוני.חבר את הצינור הבינוני עם צד אחד של כניסת הזרימה בתא העליון. והצד השני עם יציאת הזרימה בתא התחתון. העבר את ההתקנה המלאה מארון הזרימה הלמינרית לחממה.וחבר יחידות נוזליות ואת בסיס הביוריאקטור לצינור לחץ האוויר ולכבל החשמלי. הפעל את התוכנה ואתחל את המשאבות. התחל את הזרימה הבינונית עבור הדגימות אחת אחת.לאחר מכן שנה את פרמטרי משאבת המתח להגדרות הרצויות והתחל את המתח. עקוב אחר המתיחה המופעלת על הפיגום כל יומיים. הניטור של מתח מתיחה וגזירה על פני תקופות תרבית ארוכות טווח מראה כי ניתן לשמור על ערכים אלה ברמות קבועות יחסית לאורך תקופה של עד 20 יום.לאחר שלושה ימים של העמסה המודינמית, צביעה אימונופלואורסצנטית חושפת התפלגות הומוגנית של מקרופאגים ומיופיברובלסטים שמקורם במונוציטים ברחבי הפיגום. לאחר 20 יום של תרבית משותפת, מתיחה מחזורית גורמת לשקיעה של סיבי קולגן מסוג 1 רבים ועבים יותר. בעוד שבקבוצת העומס ההמודינמי המשולבת, אפקט המתיחה המחזורי מתבטל על ידי מתח מוחלט וכתוצאה מכך שקיעת קולגן מסוג 1 פחות בולטת.לאחר שמונה ימים של מונוקולטורה של מקרופאגים, נצפתה שחיקת סיבים ומחשוף סיבים בכל משטרי ההעמסה ההמודינמיים עם הספיגה הבולטת ביותר שנצפתה בקבוצה הסטטית, והספיגה הפחות בולטת שנצפתה בקבוצת המתח הטהורה. גם מתיחה מחזורית וגם מתח מוחלט משפיעים על פרופיל הפרשת הציטוקינים של מערך התרבות המשותפת. מעניין שההשפעות המשולבות של שני העומסים מראות דומיננטיות של אחד משני העומסים או השפעות סינרגטיות של שני העומסים.ניסויי תרבית משותפת מראים גם שהסביבה המכנית והסביבות הדלקתיות התלויות בעומס כתוצאה מכך מווסתות את הפנוטיפ של המיופיברובלסטים. יתר על כן, דפוסי ביטוי הגנים של סמן ההתכווצות אלפא שריר חלק אקטין נמצאים בקורלציה עם סינתזת חלבון. הדבר החשוב ביותר בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא מה שהיישום של מתיחה, חיוני שההתקנה שלך תהיה נטולת דליפות.

a-multi-cue-bioreactor-to-evaluate-inflammatory-regenerative-capacity

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

Bioreactor לחץ מחזורית מסוגל להעמיד שסתום רקמת לב לתנאי הלחץ פיזיולוגיים ופתולוגיים תוכנן. תוכנית LabVIEW מאפשר למשתמשים לשלוט על גודל הלחץ, משרעת ותדירות. מכשיר זה יכול לשמש כדי לחקור את mechanobiology של רקמת לב שסתום או תאים בודדים.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית תאים ראשוניים, מודלים של רקמות וביופסיות ניקוב בשבב מיקרופלואידי מרובה איברים למשך עד 28 ימים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים, אגרגטים בכבד וביופסיות עור שולבו בהצלחה במחזור מדיה משותף.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

אנו מציעים הרחבה תא פרוטוקול על macroporous microcarriers ואת השימוש בהם כמערכת משלוח ב זלוף מגיב ביולוגי כדי להפיץ מטריצה רקמות decellularized. אנו גם כוללים טכניקות שונות כדי לקבוע התפשטות תאים ואת הכדאיות של תאים תרבותי על microcarriers. יתר על כן, נדגים את הפונקציונליות של התאים לאחר ביוריאקטור תרבויות.

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן

מאמר זה מספק שיטות מפורטות לגבי בדיית ואפיון מכשיר מיקרופלואידיג בעלי דלקת ריאות לדחיסת כונדרוציט.

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

מאמר זה מציג שיטה לבנייה והפעלה של מערכת תרבית תאים רב-ערוצית רב-ערוצית בעלות נמוכה למדידת הדינמיקה של הפרשה וקצבי ספיגה של מומסים בתהליכים תאיים. המערכת יכולה גם לחשוף תאים לפרופילי גירוי דינמיים.

ביוריאקטור פרפוזיה מרובה זרמים משולב עם פיצול מוצא לתרבית תאים דינמית

רקמות לב תלת-ממדיות שהונדסו ביולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע התגלו כמודלים מבטיחים לחקר שריר הלב האנושי הבריא והחולה במבחנה תוך שחזור היבטים מרכזיים של נישת הלב הטבעית. כתב יד זה מתאר פרוטוקול לייצור וניתוח רקמות לב מהונדסות בעלות תוכן גבוה שנוצרו מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם.

תכנון ביוריאקטור לשיפור איסוף הנתונים והפקת מודלים של רקמות לב מהונדסות

תא גזירה היא פיתחה עבור מדידות פיזור ניטרונים זווית קטנה במישור שיפוע מהירות-המהירות של גזירה ומשמש לאפיון נוזלים מורכבים. מדידות נפתרו מרחבית בכיוון שיפוע המהירות אפשריות לחקר חומרי גזירת פסים. יישומים כוללים חקירות של תפוצות colloidal, פתרונות פולימר, ומבנים עצמי התאספו.

מדידת חומר מיקרו תחת זרם באמצעות 1-2 מטוס זרימה קטן זווית ניוטרון פיזור

העמידות של פולימרים וחומרים מרוכבים פולימרים מחוזקים בסיבים בשירות היא היבט קריטי לעיצובים ולתחזוקה מבוססת מצב. אנו מציגים פלטפורמת בדיקות מעבדה חדשה בעלות נמוכה לחקירת ההשפעה של עומסים מכניים וסביבתיים במקביל, ועשויים לסייע בתכנון מבנים מרוכבים יעילים יותר אך בטוחים יותר.

בדיקת פלטפורמה לעמידות ללימודים של פולימרים ומחוזקים בסיבים פולימריים מרוכבים תחת גירויים במקביל Hygrothermo-מכאניים

חקור את ההשפעות המכניות על התחדשות רקמות באמצעות ביו-ריאקטור רב-שלבי. הפרוטוקול מדגים תרבית דינמית של מקרופאגים ומיופיברובלסטים אנושיים בתוך פיגומים אלקטרוספונים צינוריים לפיתוח שתלים וסקולריים.

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

גלה סרטונים נוספים