ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

עד כה, היה קשה מאוד לזהות את קשרי הסיבה והתוצאה בין המודינמיקה להתחדשות רקמות כלי הדם. וזה בגלל שזה מאתגר לשלוט בעומסים המכניים הבודדים. ביו-ריאקטור זה מאפשר לנו לחקור באופן מכני את ההשפעות האישיות והמשולבות של מתח טהור ומתיחה מחזורית על פוטנציאל ההתחדשות של מגוון רחב של שתלי כלי דם מהונדסים רקמות.

מי שתדגים את ההליך הזה תהיה סוזן קוך, דוקטורנטית בקבוצה שלנו. וד"ר תמר ויסינג שהיא חוקרת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. כדי להרכיב את פיגום האלקטרו המסתובב על צינור הסיליקון, השחילו תפר פרולן 4-0 לקצה אחד של חתיכת צינור סיליקון והחוצה מהקצה השני.

צרו קשר קטן משני צידי הצינור, השאירו כ -10 סנטימטרים של חוט על שני הקשרים וצרו קשר שלישי על גבי השניים. לאחר הסרת מחט תפרים, חתוך את שולי צינור הסיליקון לצורה משולשת וצור קשר סופי בקצה שני חוטי 10 סנטימטרים. טובלים את הפיגום המסתובב האלקטרו באתנול 30% ומניחים את הפיגום על קצה אחד של חוט תפר חופשי.

לאחר מכן, מתחו בעדינות את שני צידי צינור הסיליקון וקשר התפר של 10 סנטימטר בזמן שהחוקר השני משתמש בפינצטה עם קצה פנימי חלק כדי להחליק בעדינות את פיגום האלקטרו המסתובב מעל הצינור. שחרר לאט את המתיחה על צינור הסיליקון ובמקביל החליק את הפיגום המסתובב עם הפינצטה. וטבלו את הפיגום וצינורות הסיליקון במים טהורים במיוחד פעמיים.

בנה את התא התחתון וודא שטבעת ה-O ממוקמת כהלכה. הנח תותב מתאם בחלקו העליון של התא התחתון והנח את צינור הלחץ עם חורים דרך התא התחתון. שרוך את טבעת ה-O מסיליקון סביב הקצה התחתון של צינור הלחץ כדי למנוע דליפה.

והברג את החלק התחתון של התא התחתון לחלקו העליון של התא התחתון כדי לאבטח את צינור הלחץ. ודא שהחריץ החרוט התחתון של צינור הלחץ נמצא כשלושה עד חמישה מילימטרים מעל קצה תותב המתאם של התא התחתון. משוך את צינור הסיליקון עם פיגום האלקטרו המסובב מעל צינור הלחץ והנהון ואת חוט התפר בקצה התחתון של פיגום האלקטרו המסתובב, במיקום החריץ החרוט על צינור הלחץ.

הנהון שני בצד הנגדי כדי לאבטח היטב את צינור הסיליקון עם השתל המסתובב האלקטרו. והנחת מהדק מספריים המצויד בכלל בקצה העליון של צינור הסיליקון, משוך את מהדק המספריים כלפי מעלה בצורה עקבית ומשוך בעדינות את פיגום השריצה החשמלי כדי להסיר קמטים. השתמש בחוט תפר כדי ליצור שני קשרים בשני קצוות הפיגום בחריץ החרוט העליון של צינור הלחץ.

לאחר ששני הקשרים נוצרו, שחרר את מהדק המספריים והשתמש בסכין כדי להסיר עודפי צינורות סיליקון. הברג את קונוסי האף על חוט הבורג של צינורות הלחץ עבור הדגימות שייטענו באופן דינמי. טבלו את צינור הלחץ, הצינורות והפיגום פעם אחת באתנול 30% ופעמיים במים טהורים במיוחד כדי להרטיב מראש את ההתקנה.

הנח את צינור הזכוכית מעל צינור הלחץ ודחף בעדינות על התא התחתון כדי להדק את צינור הזכוכית במקומו. לאחר מכן הנח את מחליק הזרימה, טבעת O מסיליקון ותותב מתאם בתא העליון. ואבטח את התא מעל הקצה הפתוח של צינור הזכוכית.

הסר את תקע הפיתוי הגברי משקע הזרימה, עבוד בארון זרימה למינרי סטרילי. פתח את מכסה הפיתוי הלבן והנח רקמת ספיגת אתנול מול יציאת הזרימה. פרק את תא תרבית הזרימה על ידי הורדת צינור הזכוכית עם התא העליון.

הניחו צינור מרעה ואקום על הפיגום המסתובב האלקטרו כדי להסיר כמה שיותר מדיום. והוסף תמיסת פיברינוגן ביחס של אחד לאחד עם תרחיף התאים בתוספת תרומבין. פיפטו את התמיסה למעלה ולמטה פעם אחת וטפטפו מיד את התמיסה לכל אורך הפיגום.

לאחר שכל התאים נמסרו, הזיזו את הפיגום באיטיות משמאל לימין ולמעלה ולמטה כדי להשיג פיזור אחיד של התאים. לאחר ששני צידי הפיגום נזרעו, שחזרו בזהירות את תא תרבית הזרימה על ידי החזרת צינור הזכוכית והתא העליון. והנח את תא תרבית הזרימה לתוך החממה כדי לאפשר לסיבים להתמצק.

כדי לחבר את הביוריאקטור למערכת המשאבה, הנח את תא תרבית הזרימה על אחד משמונת הברגים בבסיס הביוריאקטור. והנח קליפ מארח על הצינור הבינוני. הסר את מכסה הפיתוי הלבן, המכסה את כניסת הזרימה של התא העליון של תא תרבית הזרימה והסר את מצמד הפיתוי הנקבי של הצינור הבינוני.

חבר את הצינור הבינוני עם צד אחד של כניסת הזרימה בתא העליון. והצד השני עם יציאת הזרימה בתא התחתון. העבר את ההתקנה המלאה מארון הזרימה הלמינרית לחממה.

וחבר יחידות נוזליות ואת בסיס הביוריאקטור לצינור לחץ האוויר ולכבל החשמלי. הפעל את התוכנה ואתחל את המשאבות. התחל את הזרימה הבינונית עבור הדגימות אחת אחת.

לאחר מכן שנה את פרמטרי משאבת המתח להגדרות הרצויות והתחל את המתח. עקוב אחר המתיחה המופעלת על הפיגום כל יומיים. הניטור של מתח מתיחה וגזירה על פני תקופות תרבית ארוכות טווח מראה כי ניתן לשמור על ערכים אלה ברמות קבועות יחסית לאורך תקופה של עד 20 יום.

לאחר שלושה ימים של העמסה המודינמית, צביעה אימונופלואורסצנטית חושפת התפלגות הומוגנית של מקרופאגים ומיופיברובלסטים שמקורם במונוציטים ברחבי הפיגום. לאחר 20 יום של תרבית משותפת, מתיחה מחזורית גורמת לשקיעה של סיבי קולגן מסוג 1 רבים ועבים יותר. בעוד שבקבוצת העומס ההמודינמי המשולבת, אפקט המתיחה המחזורי מתבטל על ידי מתח מוחלט וכתוצאה מכך שקיעת קולגן מסוג 1 פחות בולטת.

לאחר שמונה ימים של מונוקולטורה של מקרופאגים, נצפתה שחיקת סיבים ומחשוף סיבים בכל משטרי ההעמסה ההמודינמיים עם הספיגה הבולטת ביותר שנצפתה בקבוצה הסטטית, והספיגה הפחות בולטת שנצפתה בקבוצת המתח הטהורה. גם מתיחה מחזורית וגם מתח מוחלט משפיעים על פרופיל הפרשת הציטוקינים של מערך התרבות המשותפת. מעניין שההשפעות המשולבות של שני העומסים מראות דומיננטיות של אחד משני העומסים או השפעות סינרגטיות של שני העומסים.

ניסויי תרבית משותפת מראים גם שהסביבה המכנית והסביבות הדלקתיות התלויות בעומס כתוצאה מכך מווסתות את הפנוטיפ של המיופיברובלסטים. יתר על כן, דפוסי ביטוי הגנים של סמן ההתכווצות אלפא שריר חלק אקטין נמצאים בקורלציה עם סינתזת חלבון. הדבר החשוב ביותר בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא מה שהיישום של מתיחה, חיוני שההתקנה שלך תהיה נטולת דליפות.