האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להאכיל ולבצע במו ידיהם מדידות תפוקה גבוהות כדי להשוות את נפחי הארוחות הנצרכים על ידי מאות יתושים בודדים. זה יכול להיות אדפטיבי כדי לשנות את תוכן הארוחה, או להשוות את הנפח הנצרך על ידי קבוצות ניסוי שונות. פרוטוקול זה נועד להיות ידידותי למשתמש ובעלות נמוכה.

למניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות, לחקור את האכלת דם היתושים והתנהגות האכלה לאחר שיטפון. ארגון הוא קריטי לפרוטוקול זה. הכינו את ההתקנה והריאגנטים מראש, כך שתוכלו להעביר במהירות את הארוחות ליתושים.

כדי להתחיל, העבירו 1.98 עד שני מיליליטר של דם כבשים דפיברין לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. אם מבצעים כימות מבוסס פלואורסצנטי של גודל הארוחה, הוסף תמיסת פלואורסצאין לריכוז סופי של 0.002% והפחתת נפח הדם באותה כמות כמו הפלואורסצין שנוסף. שמור מיליליטר אחד מנוסחת הארוחה הסופית כדי ליצור את עקומת הייחוס הסטנדרטית.

כל הארוחות והתמיסות המכילות פלואורסצאין, צריכות להיות עטופות בנייר אלומיניום או לשמור בחושך. להכנת ארוחות מלוחות ללא חלבון, שלבו 600 מיקרוליטר של נתרן ביקרבונט 400 מילי-מולרי עם 1.39 מיליליטר מים מזוקקים כפולים בשפופרת חרוטית של 15 מיליליטר. אם לאחר מכן יש לבצע כימות מבוסס פלואורסצנטי של גודל הארוחה, הוסף תמיסת פלואורסצאין לריכוז סופי של 0.002%הפחתת נפח המים באותה כמות כמו הפלואורסצאין הנוסף.

שמור לפחות מיליליטר אחד של נוסחת הארוחה הסופית המכילה 0.002% פלואורסצאין כדי ליצור את עקומת תקן הייחוס. הניחו בצד את הארוחות המוכנות עד שתהיו מוכנים לספק אותן. יש לעטוף את כל הארוחות והתמיסות המכילות פלואורסצאין בנייר אלומיניום או לשמור בחושך.

הכניסו את קבוצת הניסוי של נקבות היתושים למיכל וכסו אותם ברשת. אפשר לנקבות אלה להתאקלם בתא ההאכלה. הניחו בצד קבוצת ביקורת של יתושים שלא ניזונו שלא תוצע להם ארוחה.

לבניית צינור GLI, מלאו צינור חרוטי של 50 מיליליטר ב -40 מיליליטר של 100% גליצרול. אטום את הצינור החרוטי הפתוח בשתי חתיכות פרפילם כדי למזער את הסיכוי לדליפה. לחלופין, החזק את הפרפילם במקומו באמצעות גומיות.

הפוך את הצינור כדי לוודא שאין חורים או פערים. כדי ליצור את מכשיר משלוח הארוחות, חותכים חור ממורכז של 2.5 סנטימטר במכסה הבורג של הצינור החרוטי באמצעות סכין גילוח חד או לאבה. מתיחה, חתיכת פרפילם באופן שווה כך שהיא תכפיל בערך את גודלה.

הפרפילם צריך להיות דק מספיק כדי שיתושים יוכלו לחדור דרכו בקלות, אך לא אמורות להיות דליפות. אטום את המשטח החיצוני של מכסה הבורג עם הפרפילם כדי לכסות את החור במלואו, והנח את המכסה בצד. חממו גם את הצינור האטום של גליצרול וגם את ארוחות הדם והמלח ואמבטיית מים בטמפרטורה של 42 עד 45 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות.

הוסף ATP לארוחה המחוממת ומערבולת ביסודיות. הכניסו שני מיליליטר מהארוחה המחוממת לתוך החדר הפנימי של מכסה הבורג והניחו עליו בעדינות את הצינור החרוטי ההפוך המלא בגליצרול. באופן חלקי, הברג את הפקק עם הארוחה על הצינור המלא בגליצרול, מספיק כדי למנוע דליפה של הארוחה או הגליצרול.

הנח את צינור הגלי המורכב על גבי מיכל היתושים, מרח פחמן דו חמצני ואפשר ליתושים גישה להאכלה למשך 15 דקות לפחות כדי להשיג שיעורי האכלה מקסימליים. לאחר ההאכלה, ניתן להשליך את מכסה צינור ה-GLI כפסולת ביולוגית או לעשות בו שימוש חוזר לאחר השרייה בתמיסת אקונומיקה באחוז נמוך ושטיפה יסודית במים. כדי ליצור עקומה סטנדרטית ייחוס, הכינו דילול סדרתי של אותה ארוחה המכילה 0.002% פלואורסצאין שהוצעה לקבוצת הניסוי של היתושים.

כדי ליצור את הפיתרון הראשון של העקומה הסטנדרטית, הוסף 50 מיקרוליטר ארוחה המכילה 0.002% פלואורסצאין ל -950 מיקרוליטר PBS ומערבולת ביסודיות. בצע דילול כפול עבור שאר פתרונות העקומה הסטנדרטיים, מערבולת הרבה לפני כל דילול. פיפטה 100 מיקרוליטר מכל אחת מתמיסות העקומה הסטנדרטיות לכל אחת משמונה הבארות בעמודה הראשונה של לוחית PCR של 96 בארות.

הוסף יתוש הדברה מורדם או קפוא אחד לכל אחת משמונה הבארות. חזור על העמודה השנייה של הלוח למדידת שכפול. הוסף 100 מיקרוליטר PBS לכל באר שנותרה עבור קבוצות הביקורת והניסוי שלא ניזונו.

כבקרה שלילית, הוסף יתוש אחד שלא ניזון לכל באר בשני העמודים הבאים של הצלחת. הוסף יתוש אחד לכל באר לבארות הנותרות מקבוצות הניסוי שהוצעו להן ארוחה. הוסף חרוזי זכוכית מוצקים בורוסיליקט שלושה מילימטר לכל באר אם משבשים רקמות עם הומוגנייזר טחנת חרוזים.

אטמו את הצלחת בזהירות ושבשו את הרקמה ואז צנטריפוגה את הצלחת ב-2000 סל"ד למשך דקה עד שתיים כדי לאסוף את הליזאט. הכינו צלחת שחורה של 96 בארות עם 180 מיקרוליטר PBS בכל באר. לאחר מכן, מוסיפים 20 מיקרוליטר ליזט לכל באר ומערבבים.

מדוד את עוצמת הפלואורסצאין באמצעות קורא צלחות עם 485 תעלות עירור ו-520 פליטה. צור את עקומת תקן הייחוס על ידי התוויית נפח הארוחה הידוע כנגד מדידת עוצמת הקרינה המתאימה. באמצעות עקומת הייחוס הסטנדרטית שנוצרה, אקסטרפולציה של נפח הארוחה שנבלע על ידי כל אחד מהיתושים בקבוצת הניסוי.

הפחיתו את קריאת עוצמת הקרינה הממוצעת של קבוצת הביקורת השלילית שלא ניזונה מקריאת עוצמת הקרינה של כל פרט בקבוצת הניסוי כדי לתקן את האוטופלואורסצנטיות של רקמות הבסיס. כדי למדוד את גודל הארוחה הפלואורסצנטית מניסוי הזנת דם, נוצרה עקומה סטנדרטית על ידי שרטוט קריאות פלואורסצנטיות מבארות הייחוס המיועדות המכילות יתוש שלא ניזון ונפח ידוע של הארוחה עם 0.002% פלואורסצאין. קריאות פלואורסצנטיות מהבארות הנותרות המכילות יתושים מקבוצת הביקורת השלילית של היתושים שלא ניזונו, או מקבוצת הניסוי של היתושים המוצעת לארוחה, מושווים לעקומה סטנדרטית זו כדי לכמת את נפח הארוחה הנצרכת.

למרות שלכל הנקבות בקבוצת הניסוי הוצעה ארוחת הדם, חלק מהיתושים ניזונו וחלקם לא. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לספק ולכמת ארוחות עם הרכבי חלבון שונים. נתונים שנאספו באמצעות ארוחות בתוספת פלואוריצין מוצגים כאן.

בוצע גם ניסוי עצמאי שבו יתושים ניזונו או לא ניזונו מהעין, לאחר שהוצעו להם ארוחות ללא פלואוריצין. פרוטוקול זה שימש לקביעת נפח הארוחות הנצרך עם תרופות המווסתות את התנהגות חיפוש היתושים. בניסויים אלה, הוצע לנקבות תמיסת מלח וארוחות ATP עם אגוניסט אנושי של שני קולטנים NPY.

טכניקה זו שימשה גם למדידת התנהגות האכלת צוף, על ידי החלפת צינור הגלי בכדור צמר גפן רווי 10% סוכרוז המכיל 0.002% פלואורסצאין, מה שמדגים שניתן להשתמש בו למדידת גדלי ארוחות קטנים או משתנים יותר שלא ניתן להבחין במדויק במדידות משקל קבוצתיות. הדבר החשוב ביותר בעת ביצוע פרוטוקול זה, הוא לארגן את הדגימות באירועים ולהניח בצד את היתושים הלא מוזנים ומ"ל אחד מכל ארוחה ליצירת העקומה הסטנדרטית. בעקבות הליך זה ניתן לצפות בהתנהגות בעלי החיים לאחר האכלת דם ולעקוב אחר העיכול.

שיטה זו מאפשרת לחוקרים להעריך שינויים בצריכת הארוחות ביתושים מהונדסים גנטית. הוא גם מספק דרך פשוטה, מהירה ולא פולשנית להעביר תרופות ליתושים ולבדוק את השפעותיהן על ההתנהגות.