PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

פרוטוקול זה לטיהור האנזים טריפטופן סינתאז מסלמונלה טיפימוריום הוא מהיר, פשוט וקצר. פיצול אמוניה גופרתית וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מאפשרים לטהר את סוג הבר ואת קומפלקס הטריפטופן סינתאז המוטנטי ביום אחד. ניתן ליישם טכניקה זו לטיהור חלבונים קשורים אחרים מכיוון שפיצול אמוניה גופרתית וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל משמשים בדרך כלל לטיהור חלבונים שאינם מתויגים.

כדי להתחיל, שיבש את גלולת התא על ידי סוניקציה על אמבט מי קרח במשרעת של 80% למשך 20 מחזורים באמצעות פולסים של 10 שניות ומנוחה של 20 שניות. צנטריפוגה של התא ליזאט ב-30,000 פעמים גרם למשך 30 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, ולשאוף את הסופרנטנט מבלי לעקור את הגלולה. מסננים את השבר העל-טבעי המובהר בעזרת פילטר של 0.45 מיקרומטר בטמפרטורת החדר.

הוסף לאט כמויות קטנות של אמוניום גופרתי לתסנין עד שמגיעים לרוויה של 20%. בצע פיצול אמוניום גופרתי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, וערבב בעדינות את התמיסה למשך 10 דקות, תוך הקפדה על הימנעות מבועות. צנטריפוגה שוב את התמיסה למשך 10 דקות, והעבירו את הסופרנטנט לבקבוק נקי לשימוש נוסף.

השעו בעדינות את הגלולה ב-20 מיליליטר של מאגר דגימה, והכינו דגימה להפעלת SDS-PAGE. הוסף אמוניום גופרתי לסופרנטנט עד שמגיעים לרוויה של 30%, ומערבבים את התמיסה, הימנעות מבועות. צנטריפוגה שוב את התמיסה למשך 10 דקות, והעבירו את הסופרנטנט לבקבוק נקי לשימוש נוסף.

השעו בעדינות את שבר הגלולה של 40% שהתקבל ב-10 מיליליטר של מאגר דגימה שני, והכינו דגימה להפעלת SDS-PAGE. לאחר מכן מיקרו-צנטריפוגה של דגימת החלבון של 40% ב-10,000 פעמים גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, והעמיסו את הסופרנטנט שהתקבל על עמודת HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR מאוזנת בעבר המחוברת למכשיר כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. העריכו את שברי השיא שנאספו ואת שברי האמוניום סולפט על ג'ל 12%SDS-PAGE צבוע בכחול מבריק של Coomassie.

רכז את סוג הבר או קומפלקס אלפא-שתיים בטא-שתיים סלמונלה טיפימוריום טריפטופן סינתאז עם מסנן צנטריפוגלי של 100 קילודלטון על ידי סיבוב ב-3,000 פעמים גרם, בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את החלבון המרוכז לצינור טרי של שני מיליליטר, ושוב צנטריפוגה ב -10, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות כדי להסיר אגרגטים. לאחר קביעת ריכוז החלבון של הדגימה, הכינו 0.5 מיליליטר ב-20 עד 25 מיליגרם למיליליטר.

הבזק הקפיא אותם בחנקן נוזלי, ואחסן אותם במינוס 80 מעלות. הכינו תמיסת מלאי של חמישה מיליליטר של 200 מילי-מולרי זרע במים, ואחסנו אותה ב-500 מיקרוליטר בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות. לאחר מכן הכינו תמיסת מלאי של 50 מיליליטר של 30% פוליאתילן גליקול 8,000 במים, ושמרו 25 מיליליטר בבקבוק חרוטי צנטריפוגה חד פעמי של 50 מיליליטר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

הכינו תמיסות מלאי של 25 מיליליטר של צזיום כלוריד ונתרן כלורי מולארי אחד, כל אחת במים, ושמרו אותן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הכן שלוש סטים של תמיסות מלאי של 50 מיליליטר של bicine מולארי אחד, וטיטר אותו עם צזיום הידרוקסיד או נתרן הידרוקסיד כדי לקבל תמיסות חוצץ ב-pH 7.6, 7.8 ו-8. שמור על 25 מיליליטר של התמיסות בארבע מעלות צלזיוס.

הפשירו דגימה של קומפלקס אלפא-2 בטא-2 סלמונלה טיפימוריום טריפטופן סינתאז באמבט קרח. ואז מיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של 10, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. העבירו את שבר הסופרנטנט השקוף לצינור צנטריפוגה נקי.

העריכו את ריכוז החלבון של הסופרנטנט, ודללו את המינון ל-15 מיליגרם למיליליטר עם 50 מילי-מולרי bicine cesium hydroxide או bicine sodium hydroxide של pH 7.8, המכיל 50 מילי-מולרי צזיום או נתרן כלורי. הכן 500 מיקרוליטר של פתרונות מאגר לשלוש צלחות טיפה יושבות 24 בארות בצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר. שנה את הריכוז של PEG 8, 000 וספרמין, ושנה את ה-pH של המאגר כמתואר בכתב היד הטקסטואלי עבור כל סט.

מכסים את הצינורות, ומערבלים במרץ למשך 10 שניות, לפני שצנטריפוגה אותם ב -10, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להסיר בועות אוויר. יש להוציא 500 מיקרוליטר מתמיסה זו בכל מאגר. הוצא חמישה מיקרוליטר של תמיסת חלבון ב-15 מיקרוגרם לליטר לכל טיפת ישיבה היטב באמצעות מיקרופיפטה P-10.

לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר מכל תמיסת מאגר מתאימה לטיפת החלבון. הימנע מבועות אוויר במהלך הערבוב, ואל תבצע פיפטה למעלה ולמטה. לבסוף, מכסים את הצלחת בנייר דבק שקוף, ומאחסנים אותה בחום של 25 מעלות.

הגבישים מופיעים תוך יומיים עד חמישה ימים וגדלים לממדיהם המלאים תוך שבועיים. פרוטוקול זה שימש לשיבוט תת-יחידת אלפא ותת-יחידת הבטא של סינתאז סלמונלה טיפימוריום טריפטופן לווקטור pET SUMO ששונה. תוצאות מייצגות של SDS-PAGE של שתי רצועות חזקות המתאימות לחלבון היתוך טריפטופן סינתאז His6-SUMO-alpha ו-His6-SUMO-beta מוצגות כאן.

כל חלבון טוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לחומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית ומשקעי אמוניום גופרתי, ואחריו מחשוף תג His-SUMO, הסרת עקבות תג His-SUMO ומדידת ריכוז חלבון. פרופיל הפליטה של תת-יחידת אלפא, תת-יחידת בטא וקומפלקס אלפא-שתיים בטא-2 סלמונלה טיפימוריום טריפטופן סינתאז ב-SEC, וטוהר חלקי השיא שלהם מוצגים כאן. לאחר יצירת צורות מוטנטיות של קומפלקס הטריפטופן סינתאז, נעשה שימוש בפיצול אמוניום גופרתי כדי להסיר את החלבונים המזהמים ממערכת הביטוי ההטרולוגית.

פרופיל פליטה מייצג עם מיקום פליטה יחסי של קומפלקס אלפא-2 בטא-2 סלמונלה טיפימוריום טריפטופן סינתאז בעמודת כרומטוגרפיה של אי הכללה מוצג כאן. טוהר שברי השיא שלא נכללו נותח באמצעות SDS-PAGE לפני האיגום. גבישים בודדים גדולים הושגו באמצעות אופטימיזציה של התגבשות עדינה על ידי שינוי ריכוזי PEG 8, 000 וזרעים ו-pH של מאגר הביצינים.

גבישים בעלי מורפולוגיות שונות הופיעו תוך יומיים עד חמישה ימים וגדלו לגודל מלא תוך שבועיים. אימות מפות צפיפות האלקטרונים למבנה הגבישי של קומפלקס סינתאז מסוג אלפא-שתיים בטא-שתיים סלמונלה טיפימוריום טריפטופן הובהר לאחר חידוד מבנה הגביש. בעת ביצוע פרוטוקול זה, השלם את שלבי הטיהור הראשוניים בטמפרטורת החדר בהקדם האפשרי כדי למנוע אובדן פעילות טריפטופן סינתאז.

מבני הגביש של המוטאנטים צפויים לספק תובנות חדשות לגבי המנגנון והתפקידים שממלאים שאריות מפתח בסינתזה של L-טריפטופן.