החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

הפרוטוקול יעיל ורב-תכליתי ביותר. ניתן ליישם אותו כמעט על כל חלבון ממברנה, וכל הליך הייצור מסתיים תוך יום. ניתן לייצב את חלבוני הממברנה המסונתזים כבר בתרגום משותף על ידי ליגנדים שסופקו.

נמנעים לחלוטין ממגעי דטרגנטים, והחלבונים מוכנסים ומתקפלים ישירות בסביבות ממברנה מסופקות ומותאמות. גישות מבניות, אפיון פונקציונלי ויצירת נוגדנים הם תחומי יישום עיקריים. הטכניקה פשוטה יותר בניתוח השפעות השומנים על קיפול ותפקוד חלבון הממברנה.

ביום השלישי של התרבות, חסנו 10 ליטר מדיום YPTG סטרילי של 37 מעלות צלזיוס בכור מיכל מעורבב בנפח 15 ליטר עם 100 מיליליטר תרבית מוקדמת. ומטפחים את החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 500 סיבובים לדקה באוורור גבוה. כדי למנוע קצף מוגזם, הוסף אנטי קצף סטרילי.

כאשר התאים מגיעים לשלב אמצע היומן, הוסיפו 300 מיליליטר אתנול לתרבית ודגרו על התאים ב-42 מעלות צלזיוס עם 500 סיבובים לדקה באוורור גבוה למשך 45 דקות נוספות. בתום הדגירה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה, והשתמשו במרית ופיפטה כדי להשעות את התאים לחלוטין ב-300 מיליליטר של מאגר S30A. צנטריפוגה את החיידקים המרחפים פעמיים, שטיפת הכדור עם 300 מיליליטר S30A טרי לכל כביסה.

לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את התאים בנפח 1.1 של מאגר S30B. טען את המתלים לתא לחץ צרפתי מקורר מראש ושבש תאים במד של 1,000 פאונד לאינץ' מרובע פעם אחת. כדי להסיר רכיבים לא יציבים ולשחרר את ה-mRNA מהריבוזומים, התאם את הליזאט ל-0.4 נתרן כלורי מולרי ודגר את הדגימה למשך 45 דקות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס.

כדי להרכיב את ננו-דיסקי החלבון של פיגום הממברנה, מערבבים את תמיסת MSP1E3D1 עם תמיסת השומנים ומוסיפים DPC לריכוז סופי של 0.1%התאם את התגובה לנפח הסופי המתאים לפי הטבלה ודגר את התגובות למשך שעה ב-21 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה. בתום הדגירה, הרטיבו מראש את הממברנה של קלטת דיאליזה עם מאגר היווצרות דיסק והשתמשו במזרק כדי להעמיס את תערובת ההרכבה לקלטת. לאחר מכן, דיאליזה של התגובה כנגד שלושה נפחים של חמישה ליטר של מאגר היווצרות דיסק למשך 10 עד 20 שעות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב לפני העברת התערובת ליחידות סינון צנטריפוגליות מאוזנות של מאגר היווצרות דיסק עם חתך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון.

לאחר מכן רכז את התגובה לפחות 300 מיקרומולר על ידי צנטריפוגה באמצעות קורא UV-Vis כדי למדוד את הריכוז. כדי להכין תגובת חילופי תאים רציפה של שלושה מיליליטר, יש לאזן את הממברנה של קלטת דיאליזה של שלושה מיליליטר ב-100 מילי-מולרי טריס-אצטט. והשתמש במזרק כדי להעביר את תערובת התגובה לקלטת.

בעזרת מזרק, הסר עודפי אוויר מתא תערובת התגובה והנח את הקסטה לתא הדיאליזה. מלאו את החדר ב -60 מיליליטר תערובת האכלה והניחו את המכסה על החדר. לאחר קיבוע המכסה למקומו, דגרו את החדר למשך 12 עד 16 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ב -200 סיבובים לדקה.

כדי להכין מערך תגובה נטול תאים של 60 מיקרוליטר לבדיקת יוני מגנזיום, הוסף 60 מיקרוליטר של 3X Master Mix הטרי שלנו לתערובת התגובה ו-825 מיקרוליטר לתערובת ההזנה. וממלאים את תערובת ההאכלה במים. לאחר המערבולת, הוסף 825 מיקרוליטר של תערובת הזנה לכל אחת משלוש בארות של מיקרופלטה של 24 בארות.

חותכים צינורות דיאליזה תאית מחודשת עם חתך משקל מולקולרי של 10 עד 14 קילו-דלטון לחתיכות בגודל של כ-25 על 20 מילימטר, ומאחסנים את החלקים במים בתוספת 0.05% נתרן אזיד. לפני הרכבת מיכל ללא תאים להחלפת תאים, השתמש ברקמה כדי להסיר עודפי מים מממברנות הדיאליזה, והנח חתיכת ממברנה אחת על כל מיכל. תקן את הממברנות בעזרת טבעת פוליטטרפלואורואתילן והעביר את מיכל המיני לבאר אחת של תערובת האכלה.

הוסף את הרכיבים המולקולריים הגבוהים לתערובת התגובה, כפי שמצוין בטבלה, וערבב על ידי פיפטינג. הוסף 60 מיקרוליטר של תערובת תגובה למיכל התגובה, הקפד להימנע מבועות אוויר. ועטפו שתי יריעות בגודל שמונה על 10 סנטימטרים של סרט תרמופלסטי איטום סביב צלחת 24 הבארות.

מקבעים את מכסה צלחת הבאר במקומו בעזרת סרט ומניחים את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס ב -200 סיבובים לדקה עם תסיסה למשך 12 עד 16 שעות. למחרת בבוקר, השתמש בקצה פיפטה כדי לחדור דרך קרום הדיאליזה במיכל נטול התאים המיני ולשאוף את תערובת התגובה. העבירו את תערובת התגובה לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות חדשות כדי להסיר משקעים.

לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. כאן מוצגת השפעה מייצגת של כוונון עדין של תרכובות תגובה על התפוקה הסופית או האיכות של חלבוני הממברנה המסונתזים. בניתוח זה, הסינתזה הכוללת והמסת הננו-דיסק של הקולטן האדרנרגי T-beta-one היו דומים תחת כל הרכבי הממברנה שנותחו.

לעומת זאת, זוהתה שונות גבוהה בהרבה באיכות הקולטן המסונתז המצמד לחלבון G, כאשר הפעילות הנמוכה ביותר התקבלה עם שומני DMPC ו-POPC, והגבוהה ביותר שנצפתה כאשר יושמו DOPG ו-POPG. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהמטען של קבוצת ראש השומנים כמו גם הגמישות של שרשרת חומצות השומן הם מודולטורים חשובים לקיפול ולפעילות של חלבון קרום התא הזה. ריכוז הננו-דיסק הסופי יכול להיות גם גורם חשוב לאיכות חלבון הממברנה.

לדוגמה, אם ריכוז הננו-דיסק מוקרן בטווח של 3.75 עד 60 מיקרומולר, מתקבלת מסיסות מלאה של הקולטן המצמד לחלבון G בכ-30 ננו-דיסקים מיקרו-מולאריים, מה שנותן יחס של 1 ל-3 חלבון ממברנה לננו-דיסק. לעומת זאת, ניתן להשיג מסיסות מלאה של פרוטאורודופסין עם כ-10 ננו-דיסקים מיקרו-מולאריים, מה שנותן יחס של 10 ל-1 פרוטאורודופסין לננו-דיסק. פיפטינג מדויק ורכיבים איכותיים הם בהחלט חובה.

שלבים קריטיים להכנת ליזאט הם קצירת התאים בשלב אמצע העץ ויישום שלב המלח הגבוה. הטכניקה מפחיתה באופן דרסטי את המורכבות של סינתזת חלבון הממברנה. מטרות מאתגרות בעבר מסונתזות ביעילות, ומכאן מאפשרות לעבוד על מבנים מולקולריים של חלבונים רלוונטיים מבחינה פרמצבטית שלא נחקרו עד כה.