Name: החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למד שיטה לסינתזה משותפת של חלבוני ממברנה בננו-דיסקים מוכנים מראש ללא שימוש בדטרגנטים. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מבני ותפקודי של חלבונים תרופתיים חשובים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למענק דויטשה פורשונגסגמיינשאפט (DFG) BE1911/8-1, לפרויקט LOEWE GLUE, ולמרכז המחקר המשותף תחבורה ותקשורת על פני ממברנות (SFB807) על התמיכה הכספית.

<ol><li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li>
<li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li>
<li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li>
<li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li>
<li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li>
<li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+expression%3A+no+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li>
<li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters%2C+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li>
<li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein%2C+forming+soluble+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li>
<li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors%3A+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li>
<li>Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor%2Fnanodisc+complexes+with+different+lipid+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li>
<li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li>
<li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li>
<li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li>
<li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li>
<li>Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li>
<li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li>
<li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li>
<li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li>
<li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li>
<li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li>
<li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E.+coli+S30+lysate+proteome%3A+A+prototype+for+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li>
<li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li>
<li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4%3A+Linkages+in+substrate+binding%2C+spin+state%2C+uncoupling%2C+and+product+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li>
<li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li>
<li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes%3A+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מתוארות ההגדרות והאסטרטגיות למיטוב ביטוי ה- CF והכנסת התרגום המשותף של חברי פרלמנט פונקציונליים לננו-דיסקים. הציוד הנדרש כולל ביוריאקטור, מכשיר עיתונות צרפתי או דומה, קורא UV/VIS ופלואורסצנציה, כלי תגובה CF המתאימים למערך תצורה דו-תאי, ואינקובטור מבוקר טמפרטורה. ציוד סטנדרטי נוסף הוא צנטריפוגות לקצירת תאי E. coli וכן צנטריפוגות שולחניות המגיעות לפחות 30,000 x גרם להכנת ליזטים S30. אם S80-S100 lysates צריך להיות מוכן, ultracentrifuges נחוצים. הציוד הרשום זמין באופן קבוע במעבדות ביוכימיות ואין צורך בהשקעו...

חלבוני ממברנה (MPs) הם מטרות מאתגרות במחקרי ייצור חלבונים בשל חוסר המסיסות שלהם בסביבות מימיות. פלטפורמות ייצור MP קונבנציונליות מורכבות ממערכות מבוססות תאים כגון E. coli, שמרים או תאים אאוקריוטים. חברי הפרלמנט הרקומביננטיים המסונתזים מופקים מקרום התא או מקופלים מחדש מגופי הכללה1. לאחר סילוק חומרי ניקוי, חברי פרלמנט יכולים להיות מועברים לסביבות ממברנה מתאימות על ידי פרוטוקולים שנקבעו במבחנה מחדש. מלבד שלפוחיות וליפוזומים, שחזור MP לממברנות מישוריות בצורה של חלקיקי ננו-דיסקים2 או סליפרו3 הפכו לטכניקות שגרתיות בתקופה האחרונה. עם זאת, כל האסטרטגיות הללו מרמזות על מגע דטרגנט עם חברי פרלמנט שיכול לגרום לערעור יציבות, דיסוציאציה של אוליגומרים, ואפילו אובדן מבנה החלבוןופעילותו 4. לפיכך, בדיקה לאיתור תנאי סילוק ושיקום אופטימליים של חומרי ניקוי יכולה להיות מייגעת ולגזול זמןרב 5.
האופי הפתוח של מערכות נטולות תאים (CF) מאפשר לתגובת הביטוי להיות מסופקת ישירות עם ממברנות מוכנות מראש עם הרכב שומנים מוגדר. במצב ביטוי מבוסס שומנים זה (L-CF), לחברי הפרלמנט המסונתזים יש הזדמנות להכניס במשותף לתוךה-bilayers 6,7 שסופקו (איור 1). ננו-דיסקים המורכבים מחלבון פיגום ממברנה (MSP) סביב דיסק דו-שכבתי של שומנים מישוריים8 נראים מתאימים במיוחד לאסטרטגיה זו 9,10. ננו-דיסקים יכולים להיות מורכבים באופן שגרתי במבחנה עם מגוון של שומנים שונים, הם יציבים מאוד, ומלאי יכול להיות מרוכז עד 1 mM. עם זאת, ביטוי MSP ב E. coli וטיהור שלה הוא הכרחי. כאסטרטגיה חלופית, MSP יכול לבוא לידי ביטוי יחד עם MP היעד בתגובות CF המסופקות עם ליפוזומים11,12,13. תבניות דנ"א הן עבור MSP והן עבור MP מתווספות לתגובה, ו-MP/nanodiscs יכולים להיווצר עם הביטוי. בעוד שייצור MSP נמנע, אסטרטגיית הביטוי המשותף דורשת כוונון קפדני של ריכוזי תבנית הדנ"א הסופיים וניתן לצפות לשינויים גבוהים יותר ביעילות ייצור הדגימה.
ההחדרה המשותפת של חברי פרלמנט לממברנות של ננו-דיסקים מוכנים מראש היא מנגנון לא פיזיולוגי ועדיין לא ידוע במידה רבה, שאינו תלוי במכונות טרנסלוקון וברצפי אותות13,14,15,16. הגורמים העיקריים המשפיעים על יעילות ההחדרה הם סוג חלבון הממברנה וכן הרכב השומנים של הממברנה המסופקת, עם העדפה תכופה לשומנים טעונים שלילית15,17. מכיוון שהממברנות הננו-דיסקיות מוגבלות יחסית בגודלן, כמות משמעותית של שומנים משתחררת עם הכנסת MP18. וריאציה של גודל ננו-דיסקים מאפשרת החדרה וכוונון של קומפלקסי MP אוליגומריים גבוהיםיותר 15,18. בין היתר, הוצגה הרכבה נכונה של קומפלקסים הומוליגומריים עבור תעלת היונים KcsA, עבור משאבת היונים פרוטאורהודופסין (PR) ועבור הטרנספורטר הרב-דרגי EmrE15,18. חברי פרלמנט צפויים להיכנס לממברנה הננו-דיסקית הסימטרית משני הצדדים בתדר שווה יחסית. לפיכך יש לקחת בחשבון כי מונומרים או אוליגומרים שונים המוחדרים לננו-דיסקית אחת עשויים להיות בעלי כיוונים מנוגדים. עם זאת, הטיה בכיוון יכולה להיגרם על ידי מנגנוני החדרה שיתופיים כפי שדווחו להיווצרות של הקסמרים יחסי ציבור וטטרמרים KcsA18. הטיה נוספת בכיוון MP עשויה לנבוע ממתגי התמצאות של חברי פרלמנט שהוכנסו, ככל הנראה בשפת הממברנות הננו-דיסקיות.
ייצור ליזטים של CF מזני E. coli הוא טכניקה שגרתית אמינה וניתן לבצע אותה כמעט בכל מעבדה ביוכימית19,20. יש לקחת בחשבון כי מלבד היווצרות גשר דיסולפידים, רוב השינויים האחרים שלאחר התרגום נעדרים אם MP מסונתז באמצעות E. coli lysates. בעוד שזה עשוי ליצור דגימות הומוגניות יותר למחקרים מבניים, ייתכן שיהיה צורך לשלול השפעות פוטנציאליות על תפקודן של מטרות MP בודדות. עם זאת, הייצור היעיל של דגימות באיכות גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCR)14,21,22, טרנספורטרים אאוקריוטים 23 או מכלולים הטרומריים גדולים 24 בליזאטים של E. coli CF מצביע על התאמתם אפילו למטרות מורכבות. ניתן לקבל כמויות בקנה מידה מכין (≈ 1 מ"ג/מ"ל) של דגימה עם תצורת שני תאים ללא תאים רציפים (CECF), המורכבת מתערובת תגובה (RM) ותא תערובת הזנה (FM). נפח ה-FM עולה על נפח RM פי 15 עד פי 20 ומספק מאגר של תרכובות אנרגיה בעלות משקל מולקולרי נמוך ומבשרי19. תגובת הביטוי מוארכת אפוא למספר שעות והתפוקה הסופית של יעד ה- MP גדלה. תאי ה-RM וה-FM מופרדים על ידי קרום דיאליזה עם ניתוק של 10-14 kDa. שני התאים דורשים עיצוב מיוחד של מיכל התגובה CECF (איור 1). קלטות דיאליזה מסחריות כמיכלי RM בשילוב עם מיכלי פרספקס מותאמים המחזיקים את ה- FM הם דוגמאות מתאימות. ניתן לתמרן עוד יותר את תשואות MP על ידי שינוי יחסי RM:FM או על ידי החלפת ה- FM לאחר תקופה מסוימת של דגירה.
תפוקה ואיכות של MP דורשות לעתים קרובות אופטימיזציה אינטנסיבית של פרמטרי התגובה. יתרון חשוב של ביטוי CF הוא האפשרות לשנות ולדייק כמעט כל תרכובת בהתאם לדרישות האישיות של חבר פרלמנט. אסטרטגיה פשוטה היא להתמקד תחילה בשיפור התפוקה של MP על ידי יצירת פרוטוקול ייצור בסיסי ולאחר מכן לייעל את איכות MP על ידי כוונון עדין של התגובה ותנאי הקיפול. היעדר תהליכים פיזיולוגיים בליזאטים של CF ומורכבותם המופחתת גורמים לשיעורי הצלחה גבוהים לייצור יעיל של חברי פרלמנט25. שיקולים שגרתיים לתכנון תבנית דנ"א ואופטימיזציה של ריכוז היונים Mg 2+ מספיקים ברוב המקרים כדי להשיג תשואות משביעות רצון26. בהתאם למצב הביטוי, אופטימיזציה של איכות MP יכולה לגזול זמן רב, מכיוון שיש לסנן מגוון גדול יותר של פרמטרים14,17,22.
כדי לבסס את פלטפורמת ביטוי ה-CF המתוארת, פרוטוקולים נחוצים לייצור E . coli CF lysate (i), T7 RNA פולימראז (ii), ננודיסקים (iii) ותרכובות התגובה הבסיסיות של CECF (iv) (איור 1). נגזרות זן E . coli K12 A1927 או BL21 משמשות לעתים קרובות להכנת ליזטים יעילים מסוג S30 (צנטריפוגה ב-30,000 x גרם). מלבד ליזטים מסוג S30, ניתן להשתמש בליזאטים מקבילים הצנטריפוגים בכוחות g אחרים (למשל S12). הליזאטים נבדלים זה מזה ביעילות הביטוי ובמורכבות הפרוטאום. הפרוטאום של ליזאט S30 שהוכן על ידי הפרוטוקול המתואר נחקר בפירוט28. הפרוטאום S30 עדיין מכיל כמה חלבוני ממברנה חיצונית שיורית שיכולים לתת בעיות רקע בעת ביטוי וניתוח של תעלות יונים. עבור מטרות כאלה, מומלץ להשתמש ב- S80-S100 lysates. שינוי רב ערך במהלך הכנת ליזאט הוא אינדוקציה של תגובת SOS על ידי הלם חום משולב ואספקת אתנול בשלב הגדילה באמצע לוג של התאים. הליזטים HS30 המתקבלים מועשרים במלווים וניתן להשתמש בהם בתערובות עם ליזטים S30 לקיפול MPמשופר 22. ביטוי CF בליזאטים של E. coli מופעל כתהליך שעתוק/תרגום מצומד עם תבניות דנ"א המכילות מקדמים הנשלטים על ידי T7 RNA פולימראז (T7RNAP). האנזים יכול להיות מיוצר ביעילות בתאי כוכב BL21(DE3) הנושאים את פלסמיד pAR121929.
שני עותקים של MSP1E3D1 מורכבים לננו-דיסק אחד בקוטר של 10-12 ננומטר, אך הפרוטוקול המתואר להלן עשוי לעבוד גם עבור נגזרות MSP אחרות. עם זאת, ננו-דיסקים גדולים יותר מאלה שנוצרו עם MSP1E3D1 נוטים להיות פחות יציבים, בעוד שננו-דיסקים קטנים יותר שנוצרו עם נגזרות MSP כגון MSP1 עשויים שלא להכיל קומפלקסים גדולים יותר של חברי פרלמנט או MP. ניתן להרכיב ננו-דיסקים של MSP1E3D1 במבחנה עם מגוון גדול של שומנים שונים או תערובות שומנים. ננודיסקים מוכנים מראש הם בדרך כלל יציבים במשך > שנה אחת ב -80 מעלות צלזיוס, בעוד היציבות עשויה להשתנות עבור רכיבי שומנים שונים. לצורך סינון השפעות השומנים על קיפול ויציבות של MP, יש צורך להכין מערך מקיף של ננודיסקים המורכבים ממגוון מייצג של תערובות ליפידים/שומנים. השומנים הבאים עשויים לתת בחירה התחלתית טובה: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-פלמיטויל-2-אולאויל-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ו-1-פלמיטואיל-2-אולאויל-גליצרו-3-פוספוקולין (POPC).
מתואר פרוטוקול להכנת תגובת CECF של 3 מ"ל. שינוי קנה מידה נוסף למעלה או למטה ביחס של 1:1 אפשרי. עבור תצורת CECF הדו-תארית, יש להכין RM המכיל את כל התרכובות ו- FM המכיל רק את התרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך. מכשירי דיאליזה מסחריים של 3 מ"ל עם 10-14 kDa MWCO יכולים לשמש כמכולות RM, אשר ממוקמות לאחר מכן במיכלי פרספקס בהתאמה אישית המחזיקים את ה- FM (איור 1D)30. היחס של RM:FM הוא 1:20, ולכן 60 מ"ל של FM צריכים להיות מוכנים ל-3 מ"ל RM. איכות, ריכוז או סוג של מספר רכיבים יכולים להיות קריטיים לתפוקה הסופית ו/או לאיכות של ה-MP המסונתז (טבלה 1). תבניות DNA צריכות להיות מוכנות על פי ההנחיות שפורסמו ואופטימיזציה קודונית של מסגרת הקריאה של היעד יכולה לשפר עוד יותר באופן משמעותי את תפוקת המוצר26. עבור תגובת CECF בקנה מידה הכנה, מתואר פרוטוקול מבוסס לייצור יחסי ציבור. כדי לקבוע פרוטוקולי ביטוי עבור חברי פרלמנט חדשים, בדרך כלל יש צורך לבצע מסכי אופטימיזציה של תרכובות מסוימות (טבלה 1) כדי לשפר את התפוקה והאיכות. עבור יוני Mg2+ , קיים ריכוז אופטימלי ממוקד היטב שלעתים קרובות מראה שונות משמעותית עבור תבניות דנ"א שונות. תרכובות אחרות של תגובת CF, כגון אצוות חדשות של T7RNAP או ליזטים מסוג S30, עשויות לשנות עוד יותר את הריכוז האופטימלי של Mg2+ . לדוגמה, מסך Mg 2+ טיפוסי בטווח של ריכוז14-24 mM ובשלבים של 2 mM מתואר. כל ריכוז מוקרן בכפילויות ובתגובות CECF בקנה מידה אנליטי. כמיכל תגובה של CECF, מיכלי פרספקס Mini-CECF בהתאמה אישית30 המחזיקים את ה-RM משמשים בשילוב עם מיקרו-לוחות סטנדרטיים של 24 בארות המחזיקים את ה-FM (איור 1B). לחלופין, ניתן להשתמש במחסניות דיאליזה מסחריות בשילוב עם מיקרו-לוחות באר בעומק 96 או התקני דיאליזר מסחריים אחרים בתצורות מתאימות (איור 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (מלח נתרן) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (ארה"ב)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (ארה"ב)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (מלח נתרן) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (ארה"ב)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (מלח נתרן) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (ארה"ב)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (ארה"ב)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (מלח נתרן) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (ארה"ב)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-אמינו-2-(הידרוקסימתיל)- פרופן-1,3-דיול (טריס)</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[3H]-דיהידרואלפרנולול הידרוכלוריד</td><td>כימיקלים אמריקאים בעלי תווית רדיו (ארה"ב)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>אצטיל פוספט ליתיום אשלגן מלח (ACP)</td><td>Merck ( גרמניה)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP)</td><td>סיגמא אולדריץ' (גרמניה)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>אלפרנולול הידרוכלוריד</td><td>מרק (גרמניה)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>חומר עמודת כרומטוגרפיה של חילופי אניונים: Q-sepharose&reg;</td><td>סיגמא-אולדריץ' (גרמניה)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>אוטוקלאב מסוג GE 446EC-1</td><td>Gettinge (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (גרמניה); סורוול RC-5C; Thermo Scientific (גרמניה); מיקרו 22 ר'; Hettich (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה כולית</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבות 500 מ"ל צלוחיות מבולבלות, 2 ליטר צלוחיות מבולבלות</td><td>Schott Duran (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5'-triphosphate מלח דיסודיום</td><td>Sigma-Aldrich (גרמניה)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז מונוהידראט</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>די-אשלגןמימן פוספט טריהידרט</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרום צינורות דיאליזהTM מעבדות ספקטרה/פורTM 12-14 kD MWCO צינורות RC סטנדרטיים</td><td>פישר סיינטיפיק (גרמניה)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פולינית מלח סידן הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ' (גרמניה)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>משבש תאי לחץ</td><td>צרפתי SLM; Amico Instruments (ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5'-טריפוספט מלח ד-נתרן (GTP</td><td>)סיגמא-אולדריץ' (גרמניה)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>עמודת IMAC: HiTrap IMAC HP 5 מ"ל</td><td>GE מדעי החיים (גרמניה)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל-ובטא;-D-תיוגלקטופירנוסיד (IPTG)</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-אלנין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-ארגינין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-אספרגין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה אספרטית</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-גליצין</td><td>Carl Roth (גרמניה)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Carl רוט (גרמניה)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-איזולאוצין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-ליזין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-מתיונין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-פרולין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-פנילאלנין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-סרין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-תראונין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-טריפטופן</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-טירוזין</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 יחידות דיאליזה</td><td>Scienova (גרמניה)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-חומצה אתנו-סולפונית (HEPES)</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (ארה"ב)</td><td>תא F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת יציקת ג'ל PAGE: מערכות יציקה ידניות Mini Protean</td><td>Biorad (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח ג'ל PAGE: Power Pac 3000</td><td>Biorad (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפטון/פפטון מקזאין</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית: ip-12</td><td>Ismatec (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספואנול פירובט מלח מונופוטסיום</td><td>סיגמא אולדריץ' (גרמניה)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>פירובט קינאז</td><td>רוש (גרמניה)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>מונה נצנוץ: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (פינלנד)כדורי</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SDS</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא-אולדריץ' (גרמניה)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>קארל רוט (גרמניה)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Nanodrop</td><td>Peqlab (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר/קורא פלואורסצנטי Spark&reg;</td><td>טקאן (שוויץ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)רוש</td> <td>(גרמניה)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה סוניפיקטור</td><td>Labsonic U, B. Braun (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אורידין 5'-טריפוספט מלח טרי-נתרן (UTP)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (גרמניה)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 נוגד קצף</td><td>סיגמא-אולדריץ' (גרמניה)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>קרל רוט (גרמניה)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

מערכות ביטוי ללא תאים מאפשרות תכנון מותאם אישית של סביבות תגובה כדי לתמוך בקיפול פונקציונלי של אפילו חלבונים מורכבים כגון חלבוני ממברנה. ההליכים הניסיוניים להחדרה וקיפול של חלבוני ממברנה לתוך ממברנות מוכנות ומוגדרות המסופקות כננו-דיסקים מודגמים. הפרוטוקול נטול דטרגנטים לחלוטין ויכול לייצר מיליגרם של דגימות מטוהרות תוך יום אחד. דגימות חלבון/ננו-דיסקים של הממברנה המתקבלות יכולות לשמש למגוון מחקרים פונקציונליים ויישומים מבניים כגון התגבשות, תהודה מגנטית גרעינית או מיקרוסקופיית אלקטרונים. מתוארת הכנה של רכיבי מפתח בסיסיים כגון ליזטים ללא תאים, ננודיסקים עם ממברנות מעוצבות, פתרונות מלאי קריטיים וכן הרכבה של תגובות ביטוי דו-תאיות ללא תאים. מאחר שדרישות הקיפול של חלבוני ממברנה יכולות להיות מגוונות ביותר, המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא אפנון של פרמטרים ושלבי תגובה החשובים לאיכות הדגימה כגון תרכובות תגובה בסיסיות קריטיות, הרכב ממברנה של ננו-דיסקים, חמצון-חיזור וסביבת מלווה, או עיצוב תבניות DNA. התהליך כולו מודגם עם סינתזה של פרוטאורהודופסין וקולטן מצומד לחלבון G.

ההשפעה של תרכובות תגובה של כוונון עדין על התפוקה הסופית או האיכות של חברי פרלמנט מסונתזים מודגמת. גישה שגרתית נפוצה היא להתאים את הריכוז האופטימלי של Mg2+ בתגובות CF על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כניטור נוח של יעילות המערכת. לדוגמה, GFP סונתז מווקטור pET-21a(+) בריכוזי Mg 2+ בין 14ל-24 mM (איור 2). ניתוח SDS-PAGE זיהה את הריכוז האופטימלי של Mg 2+ ב-20 mM (איור 2A), אשר תואם היטב למדידות פלואורסצנטיות משלימות (עירור ב-485 ננומטר, מדידת פליטה ב-535 ננומטר) ...

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

הפרוטוקול יעיל ורב-תכליתי ביותר. ניתן ליישם אותו כמעט על כל חלבון ממברנה, וכל הליך הייצור מסתיים תוך יום. ניתן לייצב את חלבוני הממברנה המסונתזים כבר בתרגום משותף על ידי ליגנדים שסופקו.נמנעים לחלוטין ממגעי דטרגנטים, והחלבונים מוכנסים ומתקפלים ישירות בסביבות ממברנה מסופקות ומותאמות. גישות מבניות, אפיון פונקציונלי ויצירת נוגדנים הם תחומי יישום עיקריים. הטכניקה פשוטה יותר בניתוח השפעות השומנים על קיפול ותפקוד חלבון הממברנה.ביום השלישי של התרבות, חסנו 10 ליטר מדיום YPTG סטרילי של 37 מעלות צלזיוס בכור מיכל מעורבב בנפח 15 ליטר עם 100 מיליליטר תרבית מוקדמת. ומטפחים את החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 500 סיבובים לדקה באוורור גבוה. כדי למנוע קצף מוגזם, הוסף אנטי קצף סטרילי.כאשר התאים מגיעים לשלב אמצע היומן, הוסיפו 300 מיליליטר אתנול לתרבית ודגרו על התאים ב-42 מעלות צלזיוס עם 500 סיבובים לדקה באוורור גבוה למשך 45 דקות נוספות. בתום הדגירה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה, והשתמשו במרית ופיפטה כדי להשעות את התאים לחלוטין ב-300 מיליליטר של מאגר S30A. צנטריפוגה את החיידקים המרחפים פעמיים, שטיפת הכדור עם 300 מיליליטר S30A טרי לכל כביסה.לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את התאים בנפח 1.1 של מאגר S30B. טען את המתלים לתא לחץ צרפתי מקורר מראש ושבש תאים במד של 1,000 פאונד לאינץ' מרובע פעם אחת. כדי להסיר רכיבים לא יציבים ולשחרר את ה-mRNA מהריבוזומים, התאם את הליזאט ל-0.4 נתרן כלורי מולרי ודגר את הדגימה למשך 45 דקות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס.כדי להרכיב את ננו-דיסקי החלבון של פיגום הממברנה, מערבבים את תמיסת MSP1E3D1 עם תמיסת השומנים ומוסיפים DPC לריכוז סופי של 0.1%התאם את התגובה לנפח הסופי המתאים לפי הטבלה ודגר את התגובות למשך שעה ב-21 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה. בתום הדגירה, הרטיבו מראש את הממברנה של קלטת דיאליזה עם מאגר היווצרות דיסק והשתמשו במזרק כדי להעמיס את תערובת ההרכבה לקלטת. לאחר מכן, דיאליזה של התגובה כנגד שלושה נפחים של חמישה ליטר של מאגר היווצרות דיסק למשך 10 עד 20 שעות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב לפני העברת התערובת ליחידות סינון צנטריפוגליות מאוזנות של מאגר היווצרות דיסק עם חתך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון.לאחר מכן רכז את התגובה לפחות 300 מיקרומולר על ידי צנטריפוגה באמצעות קורא UV-Vis כדי למדוד את הריכוז. כדי להכין תגובת חילופי תאים רציפה של שלושה מיליליטר, יש לאזן את הממברנה של קלטת דיאליזה של שלושה מיליליטר ב-100 מילי-מולרי טריס-אצטט. והשתמש במזרק כדי להעביר את תערובת התגובה לקלטת.בעזרת מזרק, הסר עודפי אוויר מתא תערובת התגובה והנח את הקסטה לתא הדיאליזה. מלאו את החדר ב -60 מיליליטר תערובת האכלה והניחו את המכסה על החדר. לאחר קיבוע המכסה למקומו, דגרו את החדר למשך 12 עד 16 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ב -200 סיבובים לדקה.כדי להכין מערך תגובה נטול תאים של 60 מיקרוליטר לבדיקת יוני מגנזיום, הוסף 60 מיקרוליטר של 3X Master Mix הטרי שלנו לתערובת התגובה ו-825 מיקרוליטר לתערובת ההזנה. וממלאים את תערובת ההאכלה במים. לאחר המערבולת, הוסף 825 מיקרוליטר של תערובת הזנה לכל אחת משלוש בארות של מיקרופלטה של 24 בארות.חותכים צינורות דיאליזה תאית מחודשת עם חתך משקל מולקולרי של 10 עד 14 קילו-דלטון לחתיכות בגודל של כ-25 על 20 מילימטר, ומאחסנים את החלקים במים בתוספת 0.05% נתרן אזיד. לפני הרכבת מיכל ללא תאים להחלפת תאים, השתמש ברקמה כדי להסיר עודפי מים מממברנות הדיאליזה, והנח חתיכת ממברנה אחת על כל מיכל. תקן את הממברנות בעזרת טבעת פוליטטרפלואורואתילן והעביר את מיכל המיני לבאר אחת של תערובת האכלה.הוסף את הרכיבים המולקולריים הגבוהים לתערובת התגובה, כפי שמצוין בטבלה, וערבב על ידי פיפטינג. הוסף 60 מיקרוליטר של תערובת תגובה למיכל התגובה, הקפד להימנע מבועות אוויר. ועטפו שתי יריעות בגודל שמונה על 10 סנטימטרים של סרט תרמופלסטי איטום סביב צלחת 24 הבארות.מקבעים את מכסה צלחת הבאר במקומו בעזרת סרט ומניחים את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס ב -200 סיבובים לדקה עם תסיסה למשך 12 עד 16 שעות. למחרת בבוקר, השתמש בקצה פיפטה כדי לחדור דרך קרום הדיאליזה במיכל נטול התאים המיני ולשאוף את תערובת התגובה. העבירו את תערובת התגובה לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות חדשות כדי להסיר משקעים.לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. כאן מוצגת השפעה מייצגת של כוונון עדין של תרכובות תגובה על התפוקה הסופית או האיכות של חלבוני הממברנה המסונתזים. בניתוח זה, הסינתזה הכוללת והמסת הננו-דיסק של הקולטן האדרנרגי T-beta-one היו דומים תחת כל הרכבי הממברנה שנותחו.לעומת זאת, זוהתה שונות גבוהה בהרבה באיכות הקולטן המסונתז המצמד לחלבון G, כאשר הפעילות הנמוכה ביותר התקבלה עם שומני DMPC ו-POPC, והגבוהה ביותר שנצפתה כאשר יושמו DOPG ו-POPG. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהמטען של קבוצת ראש השומנים כמו גם הגמישות של שרשרת חומצות השומן הם מודולטורים חשובים לקיפול ולפעילות של חלבון קרום התא הזה. ריכוז הננו-דיסק הסופי יכול להיות גם גורם חשוב לאיכות חלבון הממברנה.לדוגמה, אם ריכוז הננו-דיסק מוקרן בטווח של 3.75 עד 60 מיקרומולר, מתקבלת מסיסות מלאה של הקולטן המצמד לחלבון G בכ-30 ננו-דיסקים מיקרו-מולאריים, מה שנותן יחס של 1 ל-3 חלבון ממברנה לננו-דיסק. לעומת זאת, ניתן להשיג מסיסות מלאה של פרוטאורודופסין עם כ-10 ננו-דיסקים מיקרו-מולאריים, מה שנותן יחס של 10 ל-1 פרוטאורודופסין לננו-דיסק. פיפטינג מדויק ורכיבים איכותיים הם בהחלט חובה.שלבים קריטיים להכנת ליזאט הם קצירת התאים בשלב אמצע העץ ויישום שלב המלח הגבוה. הטכניקה מפחיתה באופן דרסטי את המורכבות של סינתזת חלבון הממברנה. מטרות מאתגרות בעבר מסונתזות ביעילות, ומכאן מאפשרות לעבוד על מבנים מולקולריים של חלבונים רלוונטיים מבחינה פרמצבטית שלא נחקרו עד כה.

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Nanodiscs הם חלקיקי discoid קטנים המשלבים חלבונים בממברנה לתיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. אנו מספקים פרוטוקול חזותי המציג את שילוב צעד אחר הצעד של טרנספורטר MalFGK2 לתוך דיסק.

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

מקור: Gilmore, S. F., et al. ייצור בקנה מידה נטול תאים ותוספת אדג'ובנטית לחלבון ממברנה חיצונית ראשי רקומביננטי מ-Chlamydia muridarum לפיתוח חיסון. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את הסינתזה נטולת התאים של אנטיגנים של חלבון ממברנה מיוצב ננו-דיסק באמצעות מערכת כפולה. המכשיר שומר על תנאים אופטימליים לסינתזה יעילה של חלבונים, קיפול נכון ואינטגרציה יציבה בננו-דיסקים.

סינתזה של אנטיגנים של חלבון ממברנה מיוצב ננו-דיסק באמצעות מערכת נטולת תאים

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

כאן אנו מתארים ייצור ואפיון של חומרים ביו-אקטיביים המכילים ננו-דיסקים. ננודיסקים של Amphotericin B נלקחים כדוגמה לתיאור הפרוטוקול בצורה מדורגת.

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

כאן, מתואר פרוטוקול ליצירת תבניות חלבון מווסתות אור והפיכות עם דיוק מרחבי-זמני גבוה בקרומי שומנים מלאכותיים. השיטה מורכבת מפוטואקטיבציה מקומית של החלבון iLID (דימר משופר המושרה באור) המשותק על קרומי המודל אשר, תחת אור כחול, נקשר לחלבון השותף שלו ננו (SspB מסוג פראי).

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מחקר זה מתאר את ההליך לשיקום חלבון הממברנה הרגיש לחומצה ב-TWIK, ערוץ K+ 2 (משימה 2) לננו-דיסקים. ההרכבה המוצלחת אושרה על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרון חד-חלקיק, שהניב ממוצעים דו-ממדיים מוגדרים היטב.

טכניקה לייצוב חלבוני ממברנה בננו-דיסקים

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

למד שיטה לסינתזה משותפת של חלבוני ממברנה בננו-דיסקים מוכנים מראש ללא שימוש בדטרגנטים. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מבני ותפקודי של חלבונים תרופתיים חשובים.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

גלה סרטונים נוספים