Name: דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: למד את פרוטוקול הדקלולריזציה של קומפלקס הלב-ריאות בעכבר ליצירת שילדות מטריצה חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי ואנטומי ברזולוציית תת-מיקרון לחקר רפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופ' איוונה נובאק וד"ר נין מיין כריסטנסן (המרכז להנפשה ביולוגית מתקדמת (CAB), אוניברסיטת קופנהגן) על מתן גישה למיקרוסקופ. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ו- JTE); מלגת דוקטורט מקרן לונדבק (R286-2018-621; מר); מועצת המחקר השוודית (2017-03389; CDM); האגודה השבדית לסרטן, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, ו- 190007; CDM); סיוע גרמני לסרטן (דויטשה קרבשילפה; RR); והאגודה הדנית לסרטן (R204-A12454; ר.ר).

כל ההליכים הכלולים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית המסדירה את הרפואה הניסיונית באוניברסיטת קופנהגן ומסכימה עם החקיקה הדנית והאירופאית. כדי להדגים פרוטוקול זה, השתמשנו בעכברים נקבות BALB / cJ של 8-12 שבועות של עכבר נקבה MMTV-PyMT של גיל 11 שבועות.
הערה: הימנעות מזיהום חיידקי של פיגום ECM המוקלר מעניקה את תוצאות ההדמיה הטובות ביותר ומאפשרת אחסון מדגם לטווח ארוך. לכן חשוב לשמור על כל הצעדים סטריליים. ככזה, כל המכשירים והחומר הכירורגי, כולל תפר, מיקרו-תפר, פתרונות, צינורות, מחברי Luer וצנתרים, חייבים להיות סטריליים. משטחים, כולל מגש פוליסטירן, חייבים להיות מחוטאים עם 70% אתנול, ואת זלוף רצוי להתבצע תחת מכסה המנוע זרימה למינאר. כל ההליכים מתקיימים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
1. מיקרוכירורגיה שלאחר המוות
<ol><li>המתת חסד העכבר באמצעות תא CO2 .<ol>
<li>מניחים את העכבר לתוך תא 4 ליטר, ולהתחיל למלא עם 100% CO2, החל מ 0.2 L / min במשך 2 דקות, הגדלת עד להגיע לזרימה של 0.8 L / min לאחר 3 דקות. העכבר צריך ליפול מחוסר הכרה במהלך 2 הדקות הראשונות, ולאחר מכן הנשימה צריכה להיפסק (בדרך כלל סביב 5 דקות, אבל הזרימה יכולה להישמר לפי הצורך). אשר את המוות לפני שתמשיך לשלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לגלח את בית החזה, הבטן ואת הגב של העכבר עם קוצץ השיער ולחטא עם 70% אתנול. גילוח מפחית מאוד את מספר הממצאים בשל נוכחות של שיער או על דגימות עבור הדמיה או ניתוח ביוכימי.</li>
	<li>הצמד את העכבר למגש פוליסטירן, המרחיב את חזיתו ואת אחוריו, כמו גם את ראשו וזנבו. מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ המיקרו-כירורגיה.</li>
	<li>באמצעות מספריים דפוס ישר מאיו ליצור גישה כירורגית עם חתך עורי פועל מהאזור התת-קרקעי לבטן התחתונה ולניתח תת עורית כדי לחשוף את דופן בית החזה ואת הצפק.</li>
	<li>באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים, חתכו את שרירי החזה העיקריים ואת שרירי החזה הקטנים לאורך החלל הבין-קוסטלי השישי משני צידי דופן בית החזה.</li>
	<li>באמצעות מספריים בדפוס ישר, לחתוך את החזה לאורך החתכים הקודמים, ולאחר מכן להשלים כריתת חזה על ידי חיתוך ציר החזה לאורך הציר הארוך שלה, ולאחר מכן לרומם ולהצמיד את שני הצדדים של דופן בית החזה כדי לחשוף את קומפלקס הלבו-ריולאומי.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים זעירים עגולים (או מלקחיים זעירים של דומונט), מוציאים את התימוס ורקמת השומן שמסביב על ידי משיכתם בעדינות מההחזקות שלהם. זה יחשוף את כלי השיט העיקריים.</li>
	<li>באמצעות cautery, לצרוב את וריד קאווה היורד, באמצעות מספריים דפוס ישר, לחתוך את הוושט.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים זעירים חדים, להפריד את הוורידים brachiocephalic ואת brachiocephalic, השאיר עורקים עורקים תת-בריקליים נפוצים מן הרקמה הבסיסית כדי להקל על קשירה וצרוב.</li>
	<li>באמצעות מחזיק מחט מיקרו, מיקרו-מלקחיים חדים ותפרים במקום תפר 9-0 מעל הופעתו של brachiocephalic, השאיר עורקים עורקים נפוצים והעורקים התת-בריחיים השמאליים.</li>
	<li>לצרוב את הוורידים brachiocephalic.</li>
	<li>להפריד את בלוטות הרוק submandibular לאורך קו האמצע כדי לחשוף את שרירי הצוואר ואת קנה הנשימה. להפריד את השרירים כדי לחשוף את הרצועה cricothyroid. באמצעות מיקרו מספריים, לפתוח כניסה על ידי חתך הרצועה.</li>
	<li>הציגו קטטר 27 גרם קנה הנשימה ולדחוף בעדינות עד קנה הנשימה מסתעף לתוך הסימפונות (כלומר, עד ההתנגדות לצנתר נפגש, ולאחר מכן לסגת 3 מ"מ). תיזהר לא לשבש את הסימפונות. בעזרת תפר 6-0, מניחים 3 תפרים סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצנתר.</li>
	<li>תחלק את העכבר בגובה החוליה ה-12 של בית החזה. באבי העורקים היורד פועל באופן הקדמי לעמוד השדרה ויש לחלק אותו כאן יחד עם עמוד השדרה. תבדיל את החצי התחתון.</li>
	<li>מצטבטים בדיעבד את העורקים ודוחפים את הצנתר עד שהוא מגיע לקשת של בירי העורקים. בעזרת תפר 9-0, מניחים 4 תפרים סביב העורקים, החל מ-5 מ"מ מתחת לקצה הצנתר.</li>
</ol>2. דפלולריזציה
<ol><li>חבר את העכבר למערכת משאבה באמצעות צינורות סיליקון ומחברי Luer. לטבול עם מים deionized ב 200 μL / דקה במשך 15 דקות. שמור על קצב זרימה זה במהלך הפחתה.</li>
	<li>שנה את חומר הזילוף ל-0.5% נתרן דאוקסיכולאט (DOC) מדולל במים דה-יון ולפרוף בן לילה.</li>
	<li>שנה את חומר זלוף ל 0.1% נתרן דודסיל סולפט (SDS) מדולל במים deionized ו perfuse במשך 8 שעות.</li>
	<li>יש לטפטף מים דה-יונים למשך הלילה כדי לשטוף את ה-SDS וה-DOC למשך 24 שעות.</li>
	<li>יש לכרות את הלב והריאות המנושלים על ידי חתך את זיקותיו לבית החזה באמצעות מספריים מעוקלות ולאחסן בצינור קריו סטרילי עם מים דה-יונים עם 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו 0.3 מיקרומטר נתרן אזיד ב 4 °C. פיגומי ECM ניתן לאחסן לפחות במשך 12 שבועות1. אם הפיגומים ישמשו לניתוח ביוכימי (למשל, ספקטרומטריית מסה), הצמדה להקפאה בחנקן נוזלי.</li>
</ol>3. חיסונים
<ol><li>תכנן את ההדמיה: קבע נוגדנים ראשוניים (או נוגדנים) ואת השילוב של נוגדנים משניים מצומדים פלואורסצנטית כדי להתאים זה לזה ולהתאים את קווי הלייזר של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.</li>
	<li>לחסום את המדגם על ידי טבילה אותו cryotube המכיל 6% (v / v) סרום חמור - 3% (w / v) אלבומין סרום בקר (BSA) לילה.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן ראשוני (או נוגדנים) בסרום חמור 3% ב- PBS למשך 24 שעות.</li>
	<li>לשטוף 5 פעמים במשך 1 שעות בכל פעם ב 0.05% tween 20 ב PBS (PBST).</li>
	<li>לדגור את המדגם עם נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי (או נוגדנים) בסרום חמור 3% ב- PBS למשך 24 שעות.</li>
	<li>לשטוף 5 פעמים במשך שעה אחת ב 0.05% (PBST). המתן שעה בין כל שטיפה.</li>
	<li>מוסיפים מים דה-יוניזציה ומאחסנים במרחק של 4 מעלות צלזיוס מאור ישיר. בשלב זה, הפיגומים מוכנים לתמונה.</li>
</ol>4. הדמיה
<ol><li>מניחים את המדגם בצלחת עם תחתית זכוכית ולחים אותה עם שתי טיפות של פתרון אחסון (PBS או מים דה-יוניים).</li>
	<li>הכן את המטרה. אנו ממליצים להשתמש במטרה טבילת מים.</li>
	<li>בדוק את המדגם באמצעות אור פלואורסצנטיות.</li>
	<li>עבור לבקרת מחשב. הפעל לייזרים ולהתאים את עוצמת הלייזר, צמצם חור הסיכה, גלאים אורכי גל, רווח, רזולוציה וזום. הגדר את המספר ואת גודל השלב עבור z-stack ולהתחיל רכישה. אנו ממליצים להשתמש עירור לייזר מולטי פוטוני כדי להגביר את חדירת הרקמות ולמזער את פיזור האור, ההלבנה ונזק לרקמות.</li>
</ol>5. הכתמת המטוקסילין-אאוזין
<ol><li>Excise 1 אונת ריאות מעכבר מורדם.</li>
	<li>מניחים ב 10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ cryomold לכסות אותו עם כ 500 μL של תרכובת OCT.</li>
	<li>להקפיא על קרח יבש (-70 °C (70 °F) ולשמור על המדגם בטמפרטורה זו.</li>
	<li>Excise אונה אחת ריאה decellularized מעכבר מעובד על פי שלב 2.5.</li>
	<li>מניחים בקריומולד עם שטח הפנים הגדול ביותר למטה ולכסות אותו עם תרכובת OCT כפי שצוין בשלב 5.2.</li>
	<li>יש להקפיא על קרח יבש (-70 מעלות צלזיוס) ולשמור על הדגימה בטמפרטורה זו עד שיידרש אחרת. ניתן לאחסן את הדגימה למשך 12 שבועות לפחות.</li>
	<li>בלוקים רקמה קפואה סעיף ב -20 °C בקריוסטט עם עובי 5 מיקרומטר ומניחים חלקים על שקופיות זכוכית דבק ולאחסן ב -80 °C (80 °F).</li>
	<li>יש ליטול את השקופיות לטמפרטורת החדר עד לייבוש האוויר (כ-20 דקות).</li>
	<li>זמן קצר לטבול PBS ולתקן על ידי טבילת השקופיות ב 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 15 דקות. לשטוף פעם אחת PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן פעמיים במים מזוקקים במשך 5 דקות.</li>
	<li>תוכלו לטבול בתמיסת המטוקסילין של מאייר למשך 10 דקות. הפעם ניתן אופטימיזציה על פי מקור רקמה והכנת כתמים.</li>
	<li>לשטוף בצנצנת קופלין מתחת מים מזוקקים זורמים במשך 10 דקות.</li>
	<li>לטבול בפתרון אאוזין במשך 7 דקות. הפעם ניתן אופטימיזציה על פי מקור רקמה והכנת כתמים.</li>
	<li>טובלים ב-50% אתנול כדי להסיר עודף אאוזין ומתייבשים תוך זמן קצר בטבילה ב-70% אתנול, וב-96% וב-100% אתנול למשך 30 שניות. טובלים בקסילן מספר פעמים.</li>
	<li>יש למרוח כמה טיפות של הרכיבה על DPX בינונית ומניחים כיסוי זכוכית.</li>
	<li>השאר שקופיות להתייבש לילה מתחת למכסה המנוע הכימי.</li>
	<li>סרוק שקופיות בסורק שקופיות.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טכניקות Decellularization המבוססות על תסיסה רקמה לשנות מבנה ECM, מה שהופך אותם לא מתאים לניתוח מבנה ECM4. דטרמינוליזציה זלוף, באמצעות מסלול אנטומי כגון אב העורקים של קנה הנשימה, מאפשר להגיע למיטה נימי, או alveoli סופני, ומאפשר את המסירה של סוכנים decellularizing ברחבי האיבר. השימוש zwitterionic, אניוני ולא יוני דטרגנטים כדי decellularize רקמה מדווח4,5,6, עם זאת, נתרן דודציל סולפט (SDS, אניוני) ליניארי קול...

ה- ECM היא רשת תלת ממדית העשויה מחלבונים וגליקנים המתאימה לכל התאים באורגניזם רב-תאי, המעניקה לאיברים את צורתם ומווסתת את התנהגות התאים לאורך החיים1. מהפריית ביצית ואילך, תאים בונים ומשפצים את ה- ECM, והם נשלטים בקפדנות על ידי זה. מטרת פרוטוקול זה היא לפתוח דרך לנתח ולמפה את עכבר ECM, שכן עכברים הם האורגניזם המודל הנפוץ ביותר בפתופיזיולוגיה של יונקים.
ההתפתחות של שיטה זו הונעה על ידי הצורך לאפיין ולבודד ECM2 יליד גרורות הקשורים גרורות. כמו גידולים חסרים כלי דם אנטומיים נאותים ועכברים הם אורגניזמים קטנים יחסית, הליכים מיקרוכירורגיים תוכננו כדי להצטמצם בנסיגה של אב העורקים, תוך בידוד זרימת הכלי העיקרי המוביל לגידול (למשל, ורידים ריאתיים), ובכך למקד את זרימת ריאגנט ומאפשר דפלולרציה של הגידול. שיטה זו מייצרת פיגומי ECM עם מבנה שמור2 שניתן לחסן ולדמות, ומאפשרת מיפוי מבנה ECM בפירוט תת-מיקרון. כדי לבצע פרוטוקול זה, יש צורך לרכוש מיומנויות כירורגיות ומיקרוכירורגיות (ניתוח, מיקרו-uturing וצנתור) שעשויים לייצג מגבלה פוטנציאלית לשימוש בו. למיטב ידיעתנו, שיטה זו מייצגת את הארגון החדיש ביותר עבור ניתוח הדמיית מבנה ECM מקורי2,3.

<table><tbody><tr><td><חזק>מיקרו-כירורגיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 תפר, מחט חתך משולש (ויקריל)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 מיקרו-תפר (Safil)</td><td>B בראון</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של אדסון</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של אדסון עם שיניים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרו-מחט Castroviejo</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>מס' 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 תא אוורור להמתת חסד של עכבר</גופן></td><td></td><td></td><td></td></tr>מים <tr><td>נטולי יונים (Milli-Q IQ 7000, מערכת מים מעבדה Ultrapur)&nbsp;</td><td>מגש</td><td></td> פוליסטירן חד פעמי של Merck ZIQ7000T0 <td></td></tr><tr><td>(~30 ופעמים; 50 ס"מ)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה (Greenough, עם צוואר אווז דו-זרועי)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מרית דו-צדדית</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים של Dumont (שניים)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים של Dumont עם 45&deg; טיפים (שניים)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>קוצץ שיער</td><td>אוסטר</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט הלסי (עם לסתות טונגסטן קרביד)</td><td>Fine Science</td><td>Tools 12500-12</td><td></td></tr><tr><td>קטטר תוך-ורידי 24 מד (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>קטטר תוך-ורידי 26 מד (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מאיו (חתך קשה, ישר)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים עם קצות טבעתיים (שניים)</td><td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-קפיציים (Vannas, מעוקלים)</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>מחטים (מד 27; Microlance)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>מגבת נייר (סטרילית) או מפית כירורגית&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים משוננים (CeramaCut, ישר)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>מרית (Freer-Yasargil)</td><td>מזרקי Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>(1 מ"ל; מזרקי 3021001</td><td></td><td></td> <td>פלסטיפאק</td></tr><tr><td>BD (10 מ"ל; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לגיד (Walton)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד שרקנים IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 חמור נגד ארנב IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA (אלבומין שבר בקר V, כיתה סטנדרטית, ליופיליזציה)&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי קולגן IV (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>מארח: ארנב</td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, 10&, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>מארח:</td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי פריוסטין עז (מתנה אדיבה ממנואל קוך. RRID:AB2801621)</td><td></td><td></td> <td>מארח: שרקן ניסיונות</td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי עם להב מס' 11 (יח '10)</td> <td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr> <tr><td>סרום (סרום חמור רגיל) &nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>חזק>הדמיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; גלאים (גלאי היברידי (Leica, דגם HyD S) וצינורות פוטו-מכפיל (PMTs; )&nbsp;</td><td>לייקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; מקור אור פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>לייקה</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; מיקרוסקופ (מיקרוסקופ מולטיפוטון הפוך)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; אובייקטיבי (כחול למבדה, 20&times;, 0.70 צמצם מספרי (NA) IMM UV)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; שני פוטונים Ti&ndash; לייזר ספיר (ספקטרה-פיזיקה, מודל Mai Tai DeepSee)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; לייזר אור לבן (WLL)&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DECELLULARIZATION</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול (אלכוהול מוחלט 99.9%); יש להתאים את האלכוהול האבסולוטי ל-70% (נפח/נפח) באמצעות מים נטולי יונים&nbsp;</td><td></td> מים נטולי יונים 1680766 <td></td><td>שזיפים</td></tr><tr><td>(Milli-Q IQ 7000, מערכת מי מעבדה אולטרה-טהורים)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>אביזרי גברים Luer-to-tubing (1/8 אינץ')</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, פי 10;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית (עם 12 ערוצים)</td> צינורות סיליקון <td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>(עם תעודת זהות של 2 מ"מ ו-4 מ"מ OD)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט (DOC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td><חזק>H& E STAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>96% שזיף אתנול</td><td></td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>שזיף</td><td>אתנול מוחלט</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (24x50 מ"מ; 1000 יח')</td> <td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds ביניים (15 x 15 x 5 מ"מ; 100 יח')</td> <td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX הרכבה בינונית</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Eosin Y אלכוהולית 0.5%</td> <td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוטום נוצה נירוסטה, C35 (50 יח')</td> <td>Pfm רפואי</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> שקופיות Fisherbrand Superfrost Plus (25 x 75 מ"מ; 144 יח')</td> <td>Thermofisher</td><td></td><td></td>6319483</tr><tr><td>מאיירס המטוקסילין</td><td>סיגמא</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT תרכובת</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>סורק שקופיות (Nanozoomer)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

אנו מציגים כאן פרוטוקול דפלולרציה ללב העכבר ולריאות. הוא מייצר פיגומי ECM מבניים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח טופולוגיה והרכב ECM. הוא מבוסס על הליך מיקרו-כירורגי שנועד לצנתר את קנה הנשימה ואת אב העורקים של עכבר מורדם כדי לשוטט בלב ובריאות עם חומרים מנטרלים. קומפלקס קרדיו-ריאות decellularized לאחר מכן ניתן לחסן כדי לחשוף את המיקום של חלבוני ECM מבניים. ניתן להשלים את כל ההליך ב-4 ימים.
פיגומי ECM הנובעים מפרוטוקול זה נקיים מעיוותים ממדיים. היעדר תאים מאפשר בדיקה מבנית של מבני ECM עד לרזולוציית תת-מיקרון בתלת-ממד. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמה בריאה וחולנית מעכברים בגיל 4 שבועות, כולל מודלים עכבר של פיברוזיס וסרטן, פתיחת הדרך כדי לקבוע ECM שיפוץ הקשורים למחלות לב ריאה.

דפלולרציה לב-ריאה לאחר השלמת הפרוטוקול בהצלחה, הלב והריאות, כמו גם רקמת נספח כגון קשת העורקים, יהיו נקיים מתאים. ניתן לאמת את ההקטוקסילין-אאוזין (איור 1) של פיגומי ECM המראים הסרה של הגרעינים בהשוואה לרקמה המקורית. פיגומים אלה שומרים על מידותיהם של איברים טריים ומבנה ECM המסיס שלו שלם2. איור 2 מציג ייצוג סכמטי של השלבים הכירורגיים העיקריים הנדרשים כדי לתבל בהצלחה את קומפלקס הלבו-ריאתי ש...

פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

פרוטוקול זה הוא השער למטריצה החוץ-תאית. זה המורכבות והמבנה שלו עד לסולם תת מיקרון. אז היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת להשיג מטריצה חוץ תאית ששומרת על השלמות המבנית שלה ובכך פותחת את הדרך לניתוח ביוכימי ואנטומי.בהדגמת ההליך יהיו אלחנדרו מאיורקה ג'ילאני, רפאל רויטן ומריה ראפיבה, שנמצאים כרגע במעבדה שלי וכריס מדסן שהיה במעבדה שלי והמשיך את העבודה באוניברסיטת לונד. התחל על ידי גילוח בית החזה, הבטן והחלק האחורי של העכבר המתת חסד עם קוצץ שיער. לחטא את האזור עם 70% אתנול.לאחר מכן הצמידו את העכבר למגש פוליסטירן, המרחיב את ארבע הגפיים האחוריות הקצות שלו, כמו גם את ראשו וזנבו. מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ המיקרו-כירורגיה. באמצעות מספריים דפוס ישר מאיו, לעשות חתך עורי פועל מאזור הלסת התחתונה לבטן התחתונה ולנתח תת עורית כדי לחשוף את דופן בית החזה ואת הצפק.לאחר מכן השתמש במספריים מיקרוכירורגיים כדי לחתוך את שרירי החזה העיקריים והדקטריים לאורך החלל הבין-צילומי השישי משני צידי דופן דופן בית החזה. חותכים את החזה לאורך החתכים הקודמים עם מספריים דפוס ישר. לאחר מכן להשלים כריתת החזה על ידי חיתוך ציר החזה לאורך צירו הארוך.הגבהו והצמידו, משני צידי דופן בית החזה כדי לחשוף את תסביך הלב-ריאה. השתמש במלקחיים מיקרו עגולים כדי לחתוך את התימוס ואת רקמת השומן שמסביב על ידי משיכה עדינה שלהם את ההחזקות שלהם. ולחתוך את הוושט עם מספריים זעירות.להפריד את הוורידים brachiocephalic ואת העורק brachiocephalic עם מלקחיים מיקרו חדים. לאחר מכן להפריד את העורק הראשי המשותף השמאלי ואת העורקים התת-בריקליים השמאליים מן הרקמה הבסיסית כדי להקל על קשירה וצרוב. השתמש מחזיק microneedle מלקחיים מיקרו חדים תשעה הו תפר להניח תפרים מעל הופעתה של brachiocephalic עזב עורקים נפוצים והעורקים התת-בריקליים שמאל, לצרוב את הוורידים brachiocephalic.באמצעות מספריים מיקרו, לפתוח כניסה על ידי חתך הרצועה. הכניסו קטטר 27 מד לתוך קנה הנשימה ולדחוף בעדינות עד קנה הנשימה מסתעף לתוך הסימפונות, דואג לא לשבש את הסימפונות. בעזרת תפר של שישה O, מניחים שלושה תפרים סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצנתר.קטע את העכבר בגובה החוליה החזה ה -12, אב העורקים היורד פועל בקו הקדמי לעמוד השדרה ויש לחלק אותו כאן יחד עם עמוד השדרה. מצמצם בנסיגה את בן העורקים ולדחוף את הצנתר עד שהוא מגיע לקשת של בכושר העורקים. בעזרת תפר, מניחים ארבעה תפרים סביב באבי העורקים, החל מחמישה מילימטרים מתחת לקצה הצנתר.חבר את העכבר למערכת משאבה באמצעות צינורות סיליקון ומחברים נמוכים יותר. יש לטפס עם מים דה-תיוניים ב-200 מיקרוליטרים לדקה במשך 15 דקות. לאחר מכן לשנות את סוכן זלוף ל 0.5%DOC, מדולל במים deionized ולפרפר בן לילה.למחרת, לשנות את סוכן זלוף ל 0.1%SDS מדולל במים deionized, ולפרוט במשך שמונה שעות. לאחר מכן לעיין במים דה-יונים במשך 24 שעות כדי לשטוף את ה- SDS וה- DOC.לאחסן את הרקמה בצינור קריו סטרילי במים deionized עם 1% פניצילין סטרפטומיצין ו 0.3 מיקרומולר נתרן אזיד בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע כתמי אימונו, לחסום את המדגם על ידי דגירה אותו בצינור הקפאה המכיל 6% סרום חמור ו 3% BSA לילה. ואז לדגור עם נוגדן ראשוני בסרום חמור 3% ב PBS במשך 24 שעות.לאחר הדגירה לשטוף את המדגם חמש פעמים PBST במשך שעה אחת לכל לשטוף. לדגור על המדגם עם נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי בסרום חמור 3% ב- PBS במשך 24 שעות. ואז לחזור על הכביסות ב PBST.מוסיפים את המים היונים ומאחסנים את המדגם במרחק של ארבע מעלות צלזיוס מאור ישיר. כדי לדמיין את המדגם, מניחים אותו בצלחת תחתונה מזכוכית ולח אותו עם שתי טיפות של פתרון אחסון. הגדר את המטרה ולבדוק את המדגם באמצעות אור פלואורסצנטיות.עבור לבקרת מחשב, הפעל לייזרים והתאם את עוצמת הלייזר, צמצם חור הסיכה, אורך הגל של הגל, הרווח, הרזולוציה וההזום. הגדר את המספר ואת גודל השלב עבור מחסנית Z ולאחר מכן להתחיל רכישה. מוציאים אונת ריאה אחת מעכבר מורדם ומניחים אותה בתבנית קריו 10 על 10 על 5 מ"מ.לכסות אותו עם כ 500 קילומטר microliters של תרכובת OCT ולהקפיא אותו על קרח יבש. שמור על הדגימה בטמפרטורה הזאת. Excise אונת ריאות אחת decellularized מעכבר מעובד, למקם אותו בתבנית קריו עם שטח הפנים הגדול ביותר למטה לכסות אותו עם תרכובת OCT.להקפיא את המדגם על קרח יבש ולשמור אותו בטמפרטורה זו עד שנדרש אחרת. ניתן לאחסן את הדגימה למשך 12 שבועות לפחות. השתמש cryostat כדי סעיף בלוקים רקמה קפואה לחמישה מקטעי מיקרומטר במינוס 20 מעלות צלזיוס.ומניחים את המקטעים על שקופיות זכוכית דבק. מעבירים את השקופיות לטמפרטורת החדר עד שהאוויר מתייבש. לטבול בקצרה את השקופיות PBS, ואחריו 4%paraformaldehyde ב- PBS במשך 15 דקות.לשטוף פעם אחת PBS, ולאחר מכן פעמיים במים מזוקקים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לטבול את השקופיות בפתרון המטוקסילין של מאייר במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלנד תחת מים מזוקקים זורמים במשך 10 דקות לטבול בתמיסת אאוזין במשך שבע דקות.טובלים בקסילן מספר פעמים. יש למרוח כמה טיפות של הרכיבה על DPX בינונית ולהניח פתק כיסוי מזכוכית. השאר את השקופיות להתייבש לילה מתחת למכסה המנוע הכימי ולאחר מכן לסרוק אותם בסורק שקופיות.לאחר השלמת הפרוטוקול בהצלחה, הלב והריאות ורקמת NX יהיו נקיים מתאים. Decellularization יכול להיות מאומת על ידי המטוקסילין אאוזין כתמים של פיגומי ECM. הפיגומים שומרים על מידותיהם של איברים טריים ומבנה ה- ECM הניתן להתגלות שלו אינו נפגע.פיגומי ECM הראו חמיאות מוגברת וחבובות אור. שימוש בפרוטוקול זה עם שלב מיקרוסקופ ממונע מאפשר הדמיה תלת ממדית של דגימות הרכבה שלמות ברזולוציית תת מיקרון. זה חיוני כדי להתרחק זרימה לכיוון האיברים של עניין כדי להשיג decellurization אחיד מלא.הניתוח המיקרו-כירורגי וקשירת כלי הדם חייבים להיות יעילים. ובאותו הזמן לכבד את רקמות היעד כדי לשמור על מבנה VCM מקומי. בעקבות הליך זה, הפיגומים יועשרו לחלבוני ECM מבניים וניתן להשתמש בהם לספקטרומטריית מסה או להנדסת רקמות.טכניקה זו סוללת את הדרך למיפוי ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ-תאית.

decellularization-of-the-murine-cardiopulmonary-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים שיטה לייצור מטריצה חוץ-תאית דה-תאית או פיגומים ECM על ידי יישום זילוח מקדים של דטרגנטים דרך כלי הדם. לאחר מכן ניתן להשתמש בפיגומי ECM המבניים כדי לנתח עיצוב מחדש של ECM הקשור למחלת לב-ריאה.

Decellularization קומפלקס לב ריאה: טכניקה עבור decellularizing הלב והריאות מ מודל Murine

שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

דה-סלולריזציה של איברים שלמים מייצרת פיגומים ביולוגיים טבעיים שעשויים לשמש לרפואה רגנרטיבית. מוצג תיאור של מודל פרימטים לא אנושי של התחדשות ריאות שבו ריאות שלמות עוברות דה-סלולריזציה ולאחר מכן נזרעות עם תאי גזע בוגרים ותאי אנדותל בביו-ריאקטור המאפשר זרימת כלי דם ואוורור מדיה נוזלית.

דה-סלולריזציה של ריאות פרימטים לא אנושיים ורסלולריזציה באמצעות ביו-ריאקטור מיוחד לאיברים גדולים

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

מטריצה חוץ-תאית הלב (ECM) היא רשת מורכבת של מולקולות שננהל את מפתח בתהליכי רקמות ואיברים שתישא את שיפוץ פיזיולוגיים לאורך החיים. Decellularization מתוקננת לב העובר, למבוגרים היתרי השוואתי ניסיוני של שתי רקמות בהקשר תלת-ממד על-ידי לכידתו ארכיטקטורה מקורית ומאפיינים ביו-מכני.

דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית

שיטה זו מאפשרת decellularization של איבר מוצק מורכבים באמצעות פרוטוקול פשוט המבוסס על שוק אוסמוטי זלוף של יונית סבון עם הפרעה מטריצות איבר מינימלי. היא כוללת טכניקה decellularization הרומן מלב אנוש בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בזמן אמת זרימה dynamics וסלולר יצוא פסולת.

Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך

באופן קלאסי, האנדוקרדיום של פרימורדיום המסתם העוברי של העכבר נותח באמצעות חתכים רוחביים, קורונליים או סגיטליים. הגישה החדשנית שלנו להדמיה דו-ממדית של האנדוקרדיום באזורים וולוולוגניים מאפשרת קוטביות מישורית וניתוח סידור מחדש של התאים של האנדוקרדיום במהלך התפתחות המסתם.

פנים אל פנים הכנה לכרית אנדוקרדיאלית לניתוח מורפוגנזה מישורית בעוברי עכברים

פרוטוקול זה מדגים בידוד מונחה מיקרוסקופיה וצביעה אימונופלואורסצנטית של ורידים ריאתיים מורינים. אנו מכינים דגימות רקמה המכילות את אטריום שמאל, ורידים ריאתיים, ואת הריאות המתאימות ומכתימים אותם עבור טרופונין T לב ו Connexin 43.

מיקרודיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של שרוולי שריר הלב בוורידי ריאה מורין

מאמר זה מתאר כיצד ליצור ריאות עכבר מהונדסות ביולוגית באמצעות שיטות דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה. הוא גם מפרט השתלת ריאות אורתוטופית לאחר מכן.

השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

למד את פרוטוקול הדקלולריזציה של קומפלקס הלב-ריאות בעכבר ליצירת שילדות מטריצה חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי ואנטומי ברזולוציית תת-מיקרון לחקר רפואה רגנרטיבית.

דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין

גלה סרטונים נוספים