Name: מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד שיטה חדשה למדידת זרימת דם בשבלול עכברים באמצעות חלון כלי פתוח ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. טכניקה זו מאפשרת מחקר מפורט של דינמיקת זרימת הדם בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi), וקרן המחקר הרפואי מאוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (OHSU) (X.Shi).

הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדותי. כל ההליכים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (מספר אישור IACUC: TR01_IP00000968).
1. הכנת תאי הדם המסומנים בפלואורסצנט
<ol><li>הרדמת העכברים התורמים (עכברי C57BL/6J זכרים בני ~6 שבועות) באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של תמיסת הרדמה קטמין/קסילזין (5 מ"ל/ק"ג, ראו טבלת חומרים). הערה: פרוטוקול הרדמה זה אמין מאוד ושומר על לחץ דם סיסטמי.</li>
	<li>הניחו את העכבר על גבו, פתחו את העור וחשפו את חלל החזה באמצעות פינצטה ומספריים לנתח. חותכים לפתוח את הסרעפת, לתפוס בבסיס עצם החזה באמצעות מספריים מהדק, לחתוך דרך הצלעות ולהרים כדי לחשוף את הלב. לאסוף 1 מ"ל של דם בהפרין (15 IU / mL דם) על ידי ניקור לב, צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (60 °F). להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם לאחר איסוף הדם.</li>
	<li>הסר את הפלזמה, לשטוף את גלולת תאי הדם עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), וצנטריפוגה 3x ב 3000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>תייג את תאי הדם עם 1 מ"ל של 20 mM DiO או Dil ב- PBS, ודגירה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר23,24.</li>
	<li>צנטריפוגה ולשטוף את תאי הדם המסומנים עם 1 מ"ל של PBS, צנטריפוגה 3x ב 3000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (60 °F), ו להשעות את גלולת התא ב 30% hematocrit עם ~ 0.9 מ"ל של PBS (נפח סופי ~ 1.3 מ"ל) לפני ההזרקה.</li>
</ol>2. ניתוח ליצירת חלון פתוח 25
<ol><li>הכינו את כלי הניתוח הסטריליים ואת פלטפורמת ההדמיה, והניחו כרית חימום מתחת לווילון (איור 1A). הרדימו את העכברים (עכברי C57BL/6J זכרים בני ~6 שבועות) כמתואר בשלב 1.1, ובדקו את עומק ההרדמה על ידי מעקב אחר רפלקס כפות הרגליים וטונוס השרירים הכללי. מניחים את החיה על כרית החימום החמה, ושומרים על הטמפרטורה הרקטלית ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הניחו את זנב החיה במערכת ניטור CODATM לניטור לחץ דם ודופק (ראו טבלת חומרים). רשום את לחץ הדם הסיסטולי של החיה, לחץ הדם הדיאסטולי ולחץ הדם הממוצע (MBP) במצב המרדים. הערה: לא נראה הבדל ב- MBP של בעלי חיים במצב מורדם ולא מורדם (107 ± 11 מ"מ כספית לעומת 97 ± 7 מ"מ כספית). קצב הלב של בעלי החיים יציב תחת הרדמה, אם כי נמוך יותר (עדיין בטווח התקין) מאשר במצב שאינו מורדם (357 ± 12 פעימות לדקה לעומת 709 ± 3 פעימות לדקה). יש לצפות לפעימות לב מוגברות מעט אצל בעלי חיים הממוקמים באיפוק26.</li>
	<li>פתח את הבולה הטימפנית השמאלית באמצעות גישה צידית וגחונית תחת מיקרוסקופ סטריאו (ראה טבלת החומרים), והשאר את הממברנה הטימפנית ואת המערכות ללא פגע21.<ol><li>בצעו חתך לאורך קו האמצע של צוואר החיה כשראשה משותק וממוקם כדי למזער את התנועה (איור 1B). הסר את הבלוטה התת-מנדיבולרית השמאלית ואת הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי ו cauterize. הערה: יש להזריק בופרנורפין באופן תת עורי במינון של 0.05 מ"ג/ק"ג כדי להפחית את הכאב במהלך הניתוח.</li>
		<li>אתר וחשוף את הבולה הגרמית על ידי זיהוי שריר הסטרנוקלידומסטואיד ועצב הפנים המשתרע קדמית לכיוון הבולה.</li>
		<li>פתח את הבולה הגרמית עם מחט של 30 G, והסר בזהירות את העצם המקיפה אותה באמצעות פינצטה כירורגית כדי לספק מבט ברור על עורק השבלול והעורק הסטפטיאלי, כאשר השוליים המדיאליים שלה מונחים על קצה גומחת החלון העגולה, וקורסים קדמיים-עליונים לכיוון החלון הסגלגל (איור 1C, D). הערה: טרכאוטומיה מבוצעת כדי לשמור על דרכי הנשימה ללא הפרעה ויש לעשות זאת רק כאשר לבעל החיים יש בעיה נשימתית במהלך ניתוח. באופן כללי, רוב בעלי החיים תחת הרדמה יש נשימה חלקה. עם זאת, אם בעלי חיים קיבלו טרכאוטומיה במהלך הניתוח, אין להשתמש בזרימת הדם המוקלטת לצורך השוואה כלשהי.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בלהב סכין קטן (אזמל #16 טחון בהתאמה אישית) כדי לגרד את עצם הדופן הצדדית בסיבוב האמצעי-גבוה של שבלול העכבר, כ-1.25 מ"מ מהפסגה, עד שנקודה דקה נסדקה. הסירו את שבבי העצם בעזרת ווי תיל קטנים (איור 1E).</li>
	<li>כסה את חלון כלי השיט בכיסוי חתוך כדי שמירה על תנאים פיזיולוגיים תקינים וספק תצוגה אופטית להקלטת תמונות כלי השיט. הערה: יש לבצע את כל ההליכים בזהירות. בנוסף לניטור טמפרטורת הגוף, יש לעקוב אחר הסימנים החיוניים של החיה, כולל לחץ דם ודופק, לאורך כל הניתוח.</li>
</ol>3. הדמיה של CoBF תחת FIVM
<ol><li>בצע חתך של ~1 ס"מ לאורך הווריד הספנוס הימני כדי לחשוף את כלי הדם (איור 1F).</li>
	<li>החדירו 100 μL של תמיסת FITC-dextran (2000 kDa, 40 מ"ג/מ"ל ב-PBS) ו-100 μL של תרחיף תאי דם (30% המטוקריט) ברצף לתוך החיה דרך הווריד הספנוסי (איור 1G) כדי לאפשר הדמיה של כלי הדם ומעקב אחר מהירות זרימת הדם.</li>
	<li>שימו לב לזרימת הדם בזמן אמת ישירות על צג וידאו 5 דקות לאחר ההזרקה. דמיינו את כלי הדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה למרחק עבודה ארוך (W.D.) (W.D. 30.5 מ"מ, צמצם מספרי 10x, 0.26) ובית מנורה המכיל מסנן עירור מרובה פסים ומסנן פליטה תואם (Table of Materials). הקלט את הסרטון באמצעות מצלמת התקן דיגיטלית בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה (Table of Materials) במהירות של 2 פריימים לשנייה). רכוש יותר מ-350 תמונות לסרטון כדי להבטיח ניתוח מוצלח של מהירות הזרימה. הערה: ניתן לצלם את כלי הדם של הרצועה הספירלית ושל כלי הדם של סטריה על ידי התאמת המיקוד האופטי (וידאו משלים 1).</li>
</ol>4. ניתוח וידאו
<ol><li>מדוד את קוטר כלי השיט באמצעות תוכנה מתאימה (Table of Materials), וקבע את המרחק בין שתי נקודות קבועות על פני כלי השיט בתמונות שנרכשו.</li>
	<li>חשב את מהירות זרימת הדם ממסגרות וידאו שצולמו על-ידי מעקב אחר תנועת תאי הדם המסומנים במרחק המרחבי בין מיקומי תמונה27.<ol><li>פתח את הווידאו של זרימת הדם בתוכנה (פיג'י [ImageJ] שימש בפרוטוקול זה), וקבע את קנה המידה של התמונות.</li>
		<li>עקוב אחר תאי הדם המוכתמים ב- DiO שנבחרו באמצעות פונקציית המעקב. השתמש במרחק שהתאים עברו ובמרווח הזמן בין מסגרות תמונה בסרטון לצורך חישוב אוטומטי של מהירות הזרימה.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב הזרימה הנפחית (F) לפי המשוואה הבאה: F = V × A. (V: מהירות; A: שטח חתך של כלי השיט).</li>
</ol>5. חשיפה לרעש
<ol><li>מניחים את החיות בכלובי רשת תיל. חשוף אותם לרעש פס רחב ברמת לחץ קול של 120 dB בתא חשיפה לקול למשך 3 שעות ולמשך 3 שעות נוספות למחרת. הערה: משטר חשיפה לרעש זה, הנמצא בשימוש שגרתי במעבדה זו, גורם לאובדן קבוע של רגישות לשבלול28.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li>
<li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li>
<li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+%5Bcorrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li>
<li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li>
<li>Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li>
<li>Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound-induced+cochlear+ischemia%2Fhypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Noise+and+Health%22%5BJournal%5D)">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17(1999).</li>
<li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hearing%22%5BJournal%5D)">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).</li>
<li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li>
<li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+%28ALDF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li>
<li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laser+Doppler%3A+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li>
<li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li>
<li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li>
<li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology & Neurotology. 27 (2), 144(2006).</li>
<li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978(2018).</li>
<li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%22%5BJournal%5D)">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li>
<li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li>
<li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li>
<li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041(2012).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow%3A+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li>
<li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li>
<li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+platelets+from+mouse+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803(2019).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li>
<li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular%2C+renal%2C+and+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li>
<li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652(2011).</li>
<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li>
<li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מדגים כיצד ניתן לדמיין נימים בדופן הצידית של השבלול (ובסטריה וסקולריס) של מודל עכבר באמצעות תיוג פלואורופור בהכנה של חלון כלי פתוח תחת מערכת FIVM. מודל העכבר נמצא בשימוש נרחב ומועדף כמודל יונקים לחקר בריאות האדם ומחלותיו. הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה אפשרית להדמיה וחקירה של CoBF בדופן הצידית של העכבר (במיוחד בסטריה וסקולריס) באמצעות חלון כלי פתוח תחת מערכת FIVM השיטה מספקת רזולוציה מספקת לקביעת מהירות זרימת הדם ונפחו באמצעות תאי דם המסומנים בפלואורסצנציה כעוקבים (כפי שמוצג באיור 3 ובאיור</st...

תפקוד תקין של המיקרו-סירקולציה בדופן השבלול הלטרלי (המהווה את רוב הנימים ברצועה הספירלית ובסטריה וסקולריס) חשוב ביותר לשמירה על תפקוד השמיעה1. CoBF לא תקין מעורב בפתופיזיולוגיה של הפרעות רבות באוזן הפנימית, כולל אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש, הידרופס באוזן ופרסביקוזיס 2,3,4,5,6,7,8,9. הדמיה של CoBF תוך-חיוני תאפשר הבנה טובה יותר של הקשרים בין תפקוד השמיעה לפתולוגיה של כלי הדם בשבלול.
למרות שהמורכבות והמיקום של השבלול בתוך העצם הטמפורלית מונעים הדמיה ומדידה ישירה של CoBF, פותחו שיטות שונות להערכת CoBF, כולל זרימת לייזר-דופלר (LDF)10,11,12, הדמיית תהודה מגנטית (MRI)13, מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית (FIVM)14, מיקרואנדוסקופיה פלואורסצנטית (FME)15, הדמיית ניגודיות של כתמי לייזר אנדוסקופיים (LSCI)16 וגישות המבוססות על הזרקת סמנים מסומנים ומיקרוספרות מתויגות רדיואקטיבית לזרם הדם (מיקרואנגיוגרפיה אופטית, OMAG)17,18,19,20., עם זאת, אף אחת משיטות אלה לא אפשרה מעקב מוחלט בזמן אמת אחר שינויים ב- CoBF in vivo, למעט FIVM. FIVM, בשילוב עם חלון כלי בדופן השבלול הצדדית, היא גישה שנעשה בה שימוש ואומתה בחזירי ים בתנאי ניסוי שונים על ידי מעבדות שונות 14,21,22.
שיטת FIVM הוקמה בהצלחה לחקר השינויים המבניים והתפקודיים במיקרו-סירקולציה של שבלול בעכבר באמצעות פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן כאמצעי ניגוד וצבע פלואורסצנטי - או DiO (3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט, ירוק) או דיל (1,1-דיוקטדציל-3,3,3,3,3-טטרה-מתילינדוקרבוציאנין פרכלורט, אדום) - לתיוג מוקדם של תאי דם, הדמיה של כלי דם ומעקב אחר מהירות זרימת הדם. במחקר הנוכחי תואר הפרוטוקול של שיטה זו להדמיה וכימות של שינויים ב-CoBF בעכבר בתנאים רגילים ופתולוגיים (כגון לאחר חשיפה לרעש). טכניקה זו מעניקה לחוקר את הכלים הדרושים כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של CoBF הקשורים לתפקוד לקוי של השמיעה ולפתולוגיה בסטריה וסקולריס, במיוחד כאשר היא מיושמת בשילוב עם מודלים זמינים של עכברים מהונדסים.

<table><tbody><tr><td>0.9% נתרן כלורי</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1966-02</td><td>0.6 מ"ל (עבור 1 מ"ל)</td></tr><tr><td>1,1&פריים;-דיוקטדציל-3,3,3&פריים;,3&פריים;-טטרה-מתילינדוקרבוציאנין פרכלוראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>468495</td><td>20 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>3,3&prime;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&prime;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292</td><td>20 &micro; מערכת</td></tr><tr><td>מוניטור M CODA קנט</td><td>מדעי</td><td></td><td>CODA Monitor, לניטור לחץ דם ופעימות לב</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורת DC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>מדידת קוטר כלי</td></tr><tr><td>FITC-dextan (2000 kDa)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000s</td><td>40 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>הזרקת נתרן הפרין, USP MDV</td><td>Mylan</td><td>NDC 67457-374-12</td><td>5000 יחידות USP/מ"ל</td></tr><tr><td>Katathesia (100 מ"ג/מ"ל)</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0702-1</td><td>0.2 מ"ל (עבור 1 מ"ל)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אובייקטיבי</td><td>Mitutoyo</td><td>378-823-5</td><td>דגם: M Plan Apo NIR 10x</td></tr><tr><td>ORCA-ER מצלמה</td><td>דגם</td><td></td><td>: C4742-80-12AG</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>2085387</td><td></td></tr><tr><td>קסיזאין (100 מ"ג/מ"ל, 5x מדולל לשימוש )</td><td>לויד</td><td>LPFL04821</td><td>0.2 מ"ל (עבור 1 מ"ל)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו זום</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>דגם: SZ61, מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr></tbody></table>

מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

התמרת קול היא תובענית מבחינה מטבולית, והתפקוד התקין של המיקרו-ווסקולטורה בדופן הצידית הוא קריטי לשמירה על הפוטנציאל האנדו-שבלולי, הובלת יונים ומאזן נוזלים. דווח כי צורות שונות של הפרעות שמיעה מערבות מיקרו-סירקולציה לא תקינה בשבלול. חקירת האופן שבו פתולוגיה של זרימת הדם השבלולית (CoBF) משפיעה על תפקוד השמיעה היא מאתגרת בשל היעדר שיטות חקירה אפשריות והקושי בגישה לאוזן הפנימית. חלון כלי פתוח בדופן השבלול הצדדית, בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית, שימש לחקר שינויי CoBF in vivo, אך בעיקר בחזירי ים ורק לאחרונה בעכבר. מאמר זה והסרטון הנלווה אליו מתארים את שיטת חלון כלי הדם הפתוח להמחשת זרימת הדם בשבלול העכבר. הפרטים כוללים 1) הכנת תרחיף תאי הדם המסומנים בפלואורסצנט מעכברים; 2) בניית חלון כלי פתוח למיקרוסקופיה תוך-חיונית בעכבר מורדם, ו-3) מדידת מהירות זרימת הדם ונפחו באמצעות הקלטה לא מקוונת של ההדמיה. השיטה מוצגת בפורמט וידאו כדי להראות כיצד להשתמש בגישת החלון הפתוח בעכבר כדי לחקור שינויים מבניים ותפקודיים במיקרו-סירקולציה של השבלול בתנאים רגילים ופתולוגיים.

לאחר חשיפה כירורגית של נימי השבלול בדופן הצידית (איור 1), תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה של תאי דם המסומנים ב-Dil בכלי דם המסומנים ב-FITC-dextran הייתה אפשרית דרך חלון כלי פתוח. איור 2A הוא תמונה מייצגת שצולמה תחת FIVM שמראה את הנימים של השבלול העכבר-אמצע המפנה לרוחב. הלומינה של כלי אלה נראית לעין על ידי הפלואורסצנציה של FITC-dextran מעורבב עם פלזמה. תאי דם המסומנים בנפרד המופצים ברשת כלי הדם נראים בביר...

גישה של חלון כלי דם פתוח באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים מספקת רזולוציה מספקת למדידת זרימת דם שבלולית (CoBF). השיטה מאפשרת לחקור שינויים מבניים ותפקודיים ב- CoBF בעכבר בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

אספקת דם תקינה לשבלול חשובה ביותר למחלת השבלול מנייר, במיוחד לשמירה על פוטנציאל השבלול הפנימי, שהוא הכוח המניע החיוני לתנועת תאי שיער. פונקציה זו של זרימת הדם קשורה קשר הדוק עם צורות שונות של אובדן שמיעה. הבנה טובה יותר של זרימת הדם בשבלול תאפשר ניהול יעיל יותר של הפרעות שמיעה הנובעות מתפקוד לקוי של זרימת הדם.עם זאת, מדידת זרימת דם ישירה היא מאוד מאוד מאתגרת בשל הקושי להעריך את האוזן הפנימית. טכניקות להערכת זרימת הדם של שבלול עדיין נמצאות בפיתוח. כאן אנו מדגימים את אחת השיטות האחרונות שהוקמו במעבדה שלנו חלון שרירים פתוח בהתאמה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה כדי לצמצם את זרימת הדם של שבלול במינים קטנים של בעלי חיים כגון עכבר.ליישום טכניקה זו עם מודלים של מסה טרנסגנטית יש פוטנציאל לקידום המחקר כדי לפענח את הקשרים בין תפקוד השמיעה לבין הפתולוגיה הקשורה לזרימת דם שבלול בסיכון תוך-וסקולרי. הנהלים שלנו צריכים להתנהל בזהירות. בנוסף לדימום רגעי בגוף, יש לעקוב אחר הסימנים החיוניים של בעל החיים, כולל לחץ דם ודופק, במהלך הניתוח.התחל על ידי איסוף כמילימטר אחד של דם בהפרין על ידי ניקור לב. צנטריפוגה הדם ב 3000 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הפלזמה, ולאחר מכן לשטוף את כדור תא הדם עם מיליליטר אחד של PBS שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה ב 3000 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.תייג את תאי הדם עם מיליליטר אחד של 20 micromolar DiO או Dil ב- PBS, ודגרה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את תאי הדם המסומנים עם מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה שלוש פעמים ב 3000 פעמים G במשך שלוש דקות. יש להשהות את גלולת התא בהמטוקריט 30% עם כ-0.9 מיליליטר PBS לפני ההזרקה.הכינו מכשירי ניתוח סטריליים ופלטפורמת הדמיה והניחו כרית חימום מתחת לווילון. עקוב אחר הרפלקס המסכן וטונוס השרירים הכללי של העכברים המורדמים כדי לבדוק את עומק ההרדמה. הניחו את בעל החיים על כרית החימום החמה וזנבו במערכת המוניטור לניטור לחץ דם ודופק.לשמור על הטמפרטורה הרקטלית ב 37 מעלות צלזיוס ולרשום את לחץ הדם הסיסטולי של החיה, לחץ הדם הדיאסטולי, ולחץ דם ממוצע במצב מורדם. פתח את הבולה הטימפנית השמאלית באמצעות גישה צידית וגחונית תחת מיקרוסקופ סטריאו והותיר את הממברנה הטימפנית ואת המערכות ללא פגע. בצע חתך לאורך קו האמצע של צוואר החיה כאשר ראשה משותק כדי למזער את התנועה.הסר את הבלוטה התת-מנדיבולרית השמאלית ואת הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי ולצרוב. אתר וחשוף את הבולה הגרמית על ידי זיהוי שריר הסטרנוקלידומסטואיד ועצב הפנים המשתרע קדמית לכיוון הבולה. פתח את הבולה הגרמית עם מחט 30 מד והסר בזהירות את העצם שמסביב באמצעות פינצטה כירורגית כדי לספק תצוגה ברורה של עורק השבלול והסטפדיאלי כאשר השוליים המדיאליים שלו מונחים על קצה גומחת החלון העגול וגורמים לעליונות קדמית לכיוון החלון הסגלגל.השתמשו בלהב סכין קטן כדי לגרד את עצם הדופן הצידית בסיבוב האמצעי של שבלול העכבר במרחק של כ-1.25 מילימטרים מהפסגה, עד לסדיקת נקודה דקה. הסר את שבבי העצם עם ווים חוט קטן. כסה את חלון כלי השיט בכיסוי חתוך כדי שמירה על תנאים פיזיולוגיים תקינים וספק תצוגה אופטית להקלטת תמונות כלי השיט.בצע חתך של סנטימטר אחד לאורך הווריד הספנוס הימני כדי לחשוף את כלי השיט. החדירו ברצף 100 מיקרוליטרים כל אחד מתמיסת FITC-Dextran ואת תרחיף תאי הדם לחיה דרך הווריד הספנוסי כדי לאפשר הדמיה של כלי הדם ומעקב אחר זרימת הדם. שימו לב לזרימת הדם בזמן אמת על צג וידאו חמש דקות לאחר ההזרקה.דמיינו את כלי הדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה למרחק עבודה ארוך ובית מנורה המכיל מסנן עירור מרובה פסים ומסנן פליטה תואם. הקלט את הווידאו באמצעות מצלמת התקן מצומדת טעינה דיגיטלית בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה שרכשה יותר מ-350 תמונות לכל סרטון. כדי להבטיח ניתוח מוצלח של מהירות הזרימה.מדוד את קוטר כלי השיט באמצעות תוכנה מתאימה וקבע את המרחק בין שתי נקודות קבועות על פני כלי השיט בתמונות שנרכשו. פתח את הווידאו של זרימת הדם בתוכנה ולהגדיר את קנה המידה של התמונות. עקוב אחר תאי הדם המוכתמים ב- DiO שנבחרו באמצעות פונקציית המעקב.לאחר מכן השתמש במרחק שהתאים עברו ובמרווח הזמן בין מסגרות תמונה בסרטון לצורך חישוב אוטומטי של מהירות הזרימה. חשב את הזרימה הנפחית באמצעות המשוואה שניתנה בכתב היד של הטקסט. כדי ליצור את מודל החשיפה לרעש לפני הקלטת זרימת הדם, הניחו את בעלי החיים בכלובי רשת תיל וחשפו אותם לרעש פס רחב ברמת לחץ קול של 120 דציבלים בתא חשיפה לקול למשך שלוש שעות.ואז לשלוש שעות נוספות למחרת. הקלט את זרימת הדם שבועיים לאחר החשיפה לרעש. לאחר חשיפה כירורגית של נימי השבלול בדופן הצדדית, תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה של תאי דם המסומנים ב-DiL בכלי הדם המסומנים ב-FITC Dextran בוצעה דרך חלון כלי פתוח.תאי דם המסומנים ב-DiL בכלי סטריה המסומנים ב-FITC Dextran מוצגים כאן. תאי דם המסומנים ב- FITC Dextran מראים כי צפיפות כלי הדם של הרצועה הספירלית דלילה יותר מזו של כלי הדם הצפוף יותר של Stria vascularis. IVM ברזולוציה גבוהה מראה את דפוסי זרימת הדם בקבוצות בקרה ורעש שנחשפו.ניתן לראות את הדפוס המופרע של זרימת הדם בקבוצות החשופות לרעש. אנומליות כללו קוטר כלי שיט מופחת ושונות מוגברת בקוטר כלי השיט. מהירויות זרימת הדם בקבוצות הבקרה והרעש שנחשפו חושבו על ידי מעקב אחר שורשי תאי הדם המסומנים ב-DiO.מהירות הדם והנפח בקבוצת הרעש שנחשפה היו נמוכים באופן משמעותי מאשר בקבוצת הביקורת. הקמה מוצלחת של חלון כלי הדם הפתוח דורשת רמה גבוהה של מיומנות כירורגית. יש להקפיד על הסרת העצם של דופן השבלול לרוחב.

measurement-strial-blood-flow-mouse-cochlea-utilizing-an-open-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שיטה צדדי חדש להסתכלות של microcirculation מוצג. זה נחשב מתאים תצפית ארוכת טווח, ועל בשילוב עם התערבויות ביולוגיות pharmacophysiological או המולקולרית.

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

קליפתיים זרימת הדם דינמיקה ניתן ללמוד in vivo על ידי הדמיה צבעי ניאון dextran מוזרק לווריד הזנב של מכרסמים עם מיקרוסקופיה 2-פוטון. סרט הווידאו הזה מראה כיצד דם תמונה הדינמיקה לזרום הניאוקורטקס של עכברים באמצעות הכנה זכוכית מכוסה, חלון גולגולתי.

שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

סרטון זה מדגים את טכניקת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי התוך-חיוני לחקר היווצרות פקקת במודל עכבר. העכבר מוזרק עם פוליסכריד עם תווית פלואורופור כדי לפקח על זרימת הדם. עם הארה עם אור בעוצמה גבוהה, אינדוקציה פוטוטוקסית של פציעה בכלי הדם של האוזן מובילה להיווצרות פקקת, אשר אושרה על ידי הדמיה של החסימה בזרימת הדם.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך חיוני לחקר היווצרות פקקת מיקרו-וסקולרית

מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ 'מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיונית בבעלי חיים כדי להמחיש ולמדוד את קוטר כלי הדם ברשתית, מהירויות זרם הדם וזרימת הדם הכוללת ברשתית.

מדידות מיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני של זרימת הדם ברשתית בעכברים

מאמר זה מדווח על שיטה מפורטת למדידה דינמית וכימות של מהירות זרימת הדם בתוך כלי דם בודדים של כלי הדם בכבד העכבר באמצעות הדמיית מיקרוסקופיה תוך-חיונית בשילוב עם מתודולוגיה ספציפית לרכישת וניתוח תמונה.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

הדמיה חיה של תאי הדם המסומנים במחזור העין יכולה לספק מידע על דלקת ואיסכמיה ברטינופתיה סוכרתית וניוון מקולרי הקשור לגיל. פרוטוקול לתווית תאי דם ותמונה תאים שכותרתו במחזור הרשתית מתואר.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

כלי דם ברשתית עכבר מעניינים במיוחד בהבנת המנגנונים של היווצרות תבניות כלי דם. פרוטוקול זה מודד באופן אוטומטי את הקוטר של כלי הדם ברשתית העכבר מתמונות פונדוס אנגיוגרפיה פלואורסצנטית במרחק קבוע מהדיסק האופטי.

מדידת קוטר כלי הדם ברשתית מתמונות אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של עכבר

למד שיטה חדשה למדידת זרימת דם בשבלול עכברים באמצעות חלון כלי פתוח ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. טכניקה זו מאפשרת מחקר מפורט של דינמיקת זרימת הדם בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית

גלה סרטונים נוספים