חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים

הפרוטוקול הבא מציג כיצד להגדיר ניסוי Neutron Spin Echo כדי למדוד את פונקציית פיזור הביניים ולחקור את הדינמיקה של חלבונים בתמיסה. היתרון העיקרי של ספקטרוסקופיית הד הספין של נויטרונים הוא יכולתה לבחון סידור מחדש של תחומי חלבונים ותת-תחומים בסולם הזמן של פיקו לננו-שניות,שהוא טווח ההילוך האיטי בחלבונים בסביבתם הכמעט טבעית, ובתמיסת החלבון הצפופה. Neutron Spin Echo רגיש גם לתצורה איזוטופית, המאפשרת מחקרים מאוד ספציפיים וממוקדים באמצעות התאמת ניגודיות.

תובנות על דינמיקה של תחום החלבונים הן חלק מרכזי במחקר הביופיזי במשימה הקשה המתמשכת להעביר את תנועות התחום של החלבונים עם הפונקציונליות הביולוגית שלהם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מיושם באופן כללי על כל מדידת Neutron Spin Echo המבוצעת בספקטרומטר SNS-NSE, ללא קשר לבחירת הדגימות שלך, אם אחת מהן נשארת בתחום החומרים החומר הרך. כדי להגדיר את הניסוי התחל על ידי בחירת עובי טעינת דגימת התא, בהתבסס על ריכוז דגימת החלבון, הטמפרטורה הדרושה למדידה וכמות התמיסה הזמינה.

נקו את התא עם חומר ניקוי כלים ללא פוספט, מים שעברו דה-יוניזציה ו-70% דיאטנול. מייבשים את התא בתנור הסעה. מעמיסים ארבעה מיליליטרים של תמיסת חלבון לתוך התא, וסוגרים עם כובעים.

השתמש בסרט שעווה או בחומר איטום כלשהו כדי לאטום את תאי הדגימה. טען ארבעה מיליליטרים של חיץ דיאליזה למיכל זהה לזה של דגימת החלבון והאטימה. העברת דגימות לקו הקרן.

סגור את התריס, והיכנס לאזור המערה של מתחם הספקטרומטר. הרכיבו את תא הדגימה על מחזיק דגימת האלומיניום על ידי הידוק הברגים ולוחות האחיזה. הרכיבו את דגימת הגרפיט ואת דגימת אבקת תחמוצת האלומיניום המועמסת במיכל זהה לזה של דגימת החלבון.

הניחו את אותו מחזיק על ידי החלקה עדינה שלו לתוך פחית מערכת כפיית הטמפרטורה. סגור את מכסה המערכת מכריח הטמפרטורה, והגדר את הטמפרטורה לערך הרצוי על ידי גישה למסך האינטראקטיבי של מערכת כפיית הטמפרטורה. הרכיבו את מצלמת הנייטרונים ליישור הדגימות לקרן.

כדי לאסוף את נתוני הספקטרוסקופיה של Neutron Spin Spin Echo, יישרו את הדגימה בקרן הנייטרונים באמצעות מצלמת הנייטרונים, וארבעת מפתחי הדגימה הבלתי תלויים. פתח את מקור הנייטרונים של Spallation, את תוכנת איסוף הנתונים של Neutron Spin Echo Spectroscopy, ואסוף סטטיסטיקות דגימה על ידי הרצת סריקות סטייה עבור זוויות הפיזור ואורך הגל הרצויים. הגדר את פרמטרי המדידה בהתבסס על הנתונים הסטטיסטיים שנאספו עבור כל דגימה על-ידי עריכת פקודות המאקרו של המדידה שסופקו על-ידי מדען המכשיר המסייע.

התחל לסרוק על ידי הקלדת שם הפרוטוקול במנחה הפקודה ורכישת הדים עבור המדגם. היכנס לאשכול הניתוח מרחוק של Neutron Sciences עם אישורי המשתמש של ORNL ולחץ על לחצן ההפעלה. בספריית המשתמש, פתח חלון מסוף והקלד את פקודת הגדרת התוכנה.

לאחר מכן, הקלד את פקודת הסביבה. צור תיקיה להפחתת הנתונים בספריית הבית והעתק את קבצי ה- Script ופקודות המאקרו שסופקו מהספרייה המשותפת. ערוך, שנה את שמו ושמור את מאקרו ההפחתה המסופק בהתאם.

הקלד drspine"במנחה הפקודה והקש Enter כדי להתחיל את סביבת הפחתת התוכנה. הקלד את שם מאקרו ההפחתה במבקש הפקודות בסביבת התוכנה והקש Enter. ערוך את סקריפט Python שסופק על-ידי מדען המכשירים המסייעים עם שמות נתוני הקובץ המופחתים.

ערוך את הפונקציה כך שתתאים מהספריה שסופקה. הקלד את שם קובץ ה- Script הערוך במבקש הפקודות והקש Enter כדי לקרוא, להתאים ולהתוות נתוני NSE מופחתים. פונקציית פיזור הביניים שנמדדה על ידי NSE עבור חלבוני IgG ו-MBP מראה סטייה ברורה מתהליך הרפיה פשוט דמוי דיפוזיה בסולם הזמן הקצר של ארבע שנים, מה שמעיד על הנגישות של הדינמיקה הפנימית של חלבונים על ידי NSE, ועל הצורך במודל מורכב יותר לתיאור התהליכים הדינמיים הנצפים.

התוצאות של חישובי פונקציות פיזור ביניים שהותקנו על ידי מודלים אטומיים של שני החלבונים באמצעות מודלים שפותחו על ידי היו בקנה אחד עם נתוני NSE הניסוייים. התוצאות הוכיחו כי ניתן לייחס דינמיקה איטית יותר שנצפתה בזמנים פרוותיים ארוכים יותר לתהליכי הדיפוזיה התרגומיים והסיבוביים הכוללים, בעוד שניתן לייחס את הדינמיקה שנצפתה בסקאלות הזמן הקצרות לדינמיקה של תחומי חלבונים. דבר אחד שחשוב לזכור הוא הצורך בדגימות מוכנות ונקיות למדידות NSE.

לדוגמה טובה עבור ספין אקו יש יחס היפוך גבוה משלוש, שהוא היחס בין פיזור קוהרנטי לפיזור לא קוהרנטי של המדגם. כמו כן, במהלך הכנת הדגימה וטעינת הדגימה לתאי ה-NSE, יש לשמור על תמיסת הדגימה בטוחה ונקייה מכל זיהום צולב כימי או ביולוגי. מטעמי בטיחות יש לנסות את הכניסה למתחם הספקטרומטר רק לאחר סגירת התריס, והותר זמן נוסף של חצי שעה לקירור קרינה של המארז.

פיזור נויטרונים בזווית קטנה מומלץ להעריך את הצורה והמבנה של חלבונים בתמיסה מרוכזת. זה יכול להיעשות לפני או במקביל לניסוי NSE. שיטות נוספות כמו פיזור אור דינמי ומדידות צמיגות מספקות מידע על הדיפוזיה התרגומית ועל האינטראקציה ההידרודינמית בתוך תמיסת החלבון המרוכזת, ומומלצות גם הן.