Name: חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: חקור דינמיקת חלבונים בספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים לחקר תנועות דומיינים בחלבונים בטווחי זמן פיקו עד ננו-שניות. שיטה זו מאפשרת תצפית בסביבה כמעט טבעית ומספקת תובנות לקשר בין תנועות חלבונים לתפקוד ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה השתמש במשאבים ב-Spallation Neutron Source (מעבדות BL-15, BL-6, ביולוגיה וכימיה), משרד DOE של מתקן משתמשי המדע המופעל על ידי המעבדה הלאומית אוק רידג'. מחקר זה השתמש גם במשאבים בכור MLZ-FRM2 גרצ'ינג (KWS-2, פיניקס-J-NSE) וב-JCNS1 ב-Forschungszentrum Jülich GmbH, גרמניה. המחבר מודה לד"ר ראלף ביהל ולד"ר אנדריאס שטדלר על עזרתם במידול ותרומתם למחקר חלבוני IgG ו-MBP, לד"ר פיוטר א. ז'ולניירצ'וק לתמיכה בהפחתת נתונים של NSE, לד"ר צ'אנגוו דו על התמיכה במדידות SANS, ולרונדה מודי וד"ר קווין לתמיכה במעבדת הביוכימיה של SNS.

העבודה הנוכחית מאפיינת שני חלבונים: חלבון נוגדן אנושי רגיל IgG, ו- MBP המופרע במהותו. הצורה הליופילית של החלבונים התקבלה ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת דגימת חלבון
<ol><li>הכינו חיץ נתרן פוספט של 50 mM + 0.1 M NaCl על ידי שקילה והמסה של הריאגנטים המוצקים המתאימים במים כבדים (D2O) (ראו טבלת חומרים). זהו ממס המאגר המנוקד עבור IgG.<ol>
<li>התאם את ה- pH של פתרון המאגר ל- 6.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן חיץ נתרן פוספט + 6 MM 20 mM אוריאה על ידי שקילה והמסה של הרכיבים המוצקים המתאימים במים כבדים (D2O). זהו ממס המאגר המנוקד עבור MBP.<ol>
<li>התאם את ה- pH של פתרון המאגר ל- 4.7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סנן את ממסי המאגר באמצעות מסנני גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>שקלו והמיסו את האבקות המטוהרות של החלבון ליופיליזציה בממסים המומתים עבור החלבונים המתאימים (שלבים 1.1.-1.2.) בריכוז גבוה של חלבונים (כ-50 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>טען את תמיסת החלבון בסלסלות דיאליזה עם ממברנות דיאליזה של 3.5 K MWCO, ודיאליזה כנגד המאגר המסונן למשך 24 שעות ב- 10 °C עבור MBP ו- 25 °C עבור IgG (ראה טבלת חומרים) על ידי ניעור קל של הצינורות כדי ליצור שיפוע דיפוזיה.</li>
	<li>דיללו את תמיסת החלבון באמצעות מאגר הדיאליזה בסדרת ריכוזים: 1, 2, 5, 10 ו-50 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>קבע את הריכוזים המדויקים באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>2. אפיון מדגם ראשוני על ידי פיזור אור דינמי (DLS)
<ol><li>טען 80 μL של כל תמיסת חלבון מסדרת הריכוזים שהוכנה לעיל (שלב 1.6.) לתוך התא החד-פעמי DLS (ראה טבלת חומרים) וקבע את מקדמי הדיפוזיה, בממוצע מעל 10 רכישות.</li>
	<li>שרטטו את מקדמי הדיפוזיה התרגומיים כפונקציה של ריכוז חלבונים והתמחו בריכוז אפסי.</li>
	<li>טען כל תמיסת חלבון מסדרת הריכוזים לצינורות הנימיים של ויסקומטר (ראה טבלת חומרים) ומדוד את הצמיגות הדינמית.</li>
	<li>התווה את הצמיגות הדינמית הנמדדת כפונקציה של ריכוז החלבון והתאמץ לריכוז אפסי. הערה: האקסטרפולציה של דיפוזיה DLS לריכוז אפס מניבה את הערך של דיפוזיה תרגומית עבור חלבון אחד בודד. האקסטרפולציה של צמיגות דינמית לריכוז אפס חייבת להניב את ערך הצמיגות הדינמי שנמדד באופן ניסיוני עבור תמיסת החיץ.</li>
</ol>3. אוסף של פיזור בזווית קטנה (נויטרונים או רנטגן)
<ol><li>מדוד פיזור נויטרונים בזווית קטנה (SANS) ו/או פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS) (ראו טבלת חומרים) על ארבעה ריכוזי חלבונים, רצוי 2 מ"ג/מ"ל, 5 מ"ג/מ"ל, 10 מ"ג/מ"ל ו-50 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>נרמלו את ספקטרום SANS ו-SAXS לפי ריכוז החלבון.</li>
	<li>התאם את גורם צורת החלבון P(Q) לספקטרום SANS ו-SAXS באמצעות תוכנת אופטימיזציה של אנסמבל31 ו/או SasView32 .</li>
	<li>חישוב גורם המבנה S(Q, c) על ידי חלוקת אות SANS ו-SAXS ב-P(Q) עבור כל ריכוז. הערה: קוראים המעוניינים כיצד למדוד ולפרש נתוני פיזור בזווית קטנה כתמיכה במדידות NSE מוזמנים לעיין ביסודיות בהפניות 23,28,31,32,33.</li>
</ol>4. מדידת NSE
<ol><li>הגדר לניסוי והרם את הדגימה בהתאם לשלבים הבאים.<ol>
<li>בחר את עובי התא לטעינת דגימה בהתבסס על ריכוז תמיסת החלבון, הטמפרטורה הדרושה למדידה וכמות התמיסה הזמינה. הערה: המחקר הנוכחי השתמש במיכלי קוורץ שקופים של מטעין עליון של 40 מ"מ x 30 מ"מ x 4 מ"מ.</li>
		<li>נקו את התא שוב ושוב, לסירוגין בין חומר ניקוי כלים ללא פוספט (ראו טבלת חומרים), מים שעברו דה-יוניזציה ו-70% אתנול.</li>
		<li>מייבשים את התא בתנור הסעה; אין לחרוג מ-80 מעלות צלזיוס עבור תאי הקוורץ.</li>
		<li>טען 4 מ"ל של תמיסת חלבון לתוך התא וסגור עם כובעים. השתמש בסרט שעווה או בחומר איטום כלשהו (ראה טבלת חומרים) כדי לאטום את תאי הדגימה. הערה: במחקר הנוכחי, נעשה שימוש ב-4.8 מ"ל של תמיסה במינון של כ-50 מ"ג/מ"ל כדי להשיג עוצמת פיזור מספקת.</li>
		<li>טען 4 מ"ל של מאגר דיאליזה לתוך מיכל זהה לזה של דגימת החלבון והאטימה.</li>
		<li>העבירו דגימות לקו הקרן, סגרו את התריס ונכנסו לאזור המערה של מתחם הספקטרומטר34.</li>
		<li>הרכיבו את תא הדגימה על מחזיק דגימת האלומיניום על ידי הידוק הברגים ולוחות האחיזה (איור 2, לוח שמאלי). הערה: ניתן להרכיב שני תאי דגימה בו-זמנית, בהתחשב בכך שאותו פרוטוקול מדידה נחוץ עבור כל הדגימות.</li>
		<li>הרכיבו את דגימת הגרפיט ו/או דגימת אבקת Al2O3 המועמסת במיכל זהה לזה של דגימת החלבון. אלה הם תקנים המסופקים על ידי התמיכה בקו הקרן SNS-NSE.</li>
		<li>מקם את מחזיק הדגימה על ידי החלקה עדינה שלו לתוך פחית מערכת כפיית הטמפרטורה (TFS, ראה טבלת חומרים). הערה: TFS היא סביבת הדגימה הנפוצה ביותר ב-SNS-NSE, והיא מזרימה אוויר יבש לתוך מיכל הדגימה כדי להשיג את הטמפרטורה הרצויה (איור 2, לוחות אמצעיים וימניים).</li>
		<li>סגור את מכסה ה- TFS והגדר את הטמפרטורה לערך הרצוי על-ידי גישה למסך האינטראקטיבי של ה- TFS.</li>
		<li>הרכיבו את מצלמת הנייטרונים (ראו טבלת חומרים) ליישור הדגימות לקרן.</li>
		<li>טאטאו את מתחם המכשירים, התפנו, סגרו את הדלתות ופתחו את תריס הקורה. הערה: תאים לדוגמה מסופקים על-ידי התמיכה בקו הקרן של SNS-NSE. לתאי דגימה זמינים ולספריית סביבת הדגימה, עיין בדף האינטרנט של קו הקרן SNS-NSE 7,35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אסוף את נתוני NSE בהתאם לשלבים הבאים.<ol>
<li>יישר את הדגימה בקרן הנייטרונים באמצעות מצלמת הנייטרונים וארבעת מפתחי הצמצם של הדגימה הבלתי תלויה.</li>
		<li>פתח את תוכנת איסוף הנתונים SNS-NSE36 ואסוף נתונים סטטיסטיים לדוגמה על ידי הפעלת סריקות עקיפה עבור זוויות הפיזור ואורך הגל הרצויים.</li>
		<li>הגדר את פרמטרי המדידה בהתבסס על הנתונים הסטטיסטיים שנאספו עבור כל דגימה על-ידי עריכת פקודות המאקרו של המדידה שסופקו על-ידי מדען המכשירים המסייע.</li>
		<li>התחל לסרוק על-ידי הקלדת שם הפרוטוקול במבקש הפקודה וקבל הדים עבור הדגימה.</li>
		<li>התחל לסרוק ולרכוש הדים גם עבור הייחוס האלסטי והממס האגור. בצע פעולת תריס קרן לסירוגין עבור שינוי הדגימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig02.jpg"> איור 2: מערכת מדידת NSE. לוח שמאלי: דגימות תמיסת חלבון במיכל קוורץ המורכבות עם ברגים ולוחות על מחזיק דגימת האלומיניום (Al). בעל דגימת Al מציע את האפשרות להרכיב שתי דגימות בו זמנית בתוך סביבת הדגימה. לוח אמצעי: ניתן להרכיב את דגימת מערכת כפיית הטמפרטורה (TFS) בשלב הדגימה שחלון קרן הנייטרונים נמצא בצד ימין, בעוד שמצלמת הנייטרונים המשמשת ליישור נראית בצד שמאל. לוח ימני: הצבת מחזיק הדגימה עם שתי דוגמאות לתוך הדגימה יכולה לעבוד עם חלונות סיליקון (Si). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
5. הפחתת נתוני NSE
הערה: SNS-NSE מצויד בתוכנה ייעודית בשם DrSpine (הפחתת נתונים עבור ספין-הד)37,38 הזמינה באשכול הניתוח מרחוק של ORNL Neutron Sciences, מדריך למשתמש מהיר ותמיכה מובנית בעזרה.
<ol><li>היכנס לאשכול ניתוח מרחוק של מדעי הנייטרונים (ראה טבלת חומרים) עם אישורי המשתמש של ORNL, ולחץ על לחצן הפעל הפעלה .</li>
	<li>הגדר את תוכנת הפחתת הנתונים בהתאם לשלבים הבאים.<ol>
<li>בספריית המשתמש, פתח חלון מסוף והקלד: מקור / SNS / תוכנה / nse / וכו '/ setup_nse.sh.</li>
		<li>לאחר מכן, הקלד: drspine_create_env.sh.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צור תיקיה להפחתת הנתונים בספריית הבית והעתק את קבצי ה- Script ופקודות המאקרו שסופקו מהספרייה המשותפת.</li>
	<li>ערוך, שנה את שמו ושמור את מאקרו ההפחתה המסופק בהתאם.</li>
	<li>הקלד drspine במנחה הפקודה והקש Enter כדי להפעיל את סביבת הפחתת התוכנה.</li>
	<li>הקלד "שם מאקרו ההפחתה" שנערך בשלב 5.4. במבקש הפקודות בסביבת התוכנה והקש Enter.</li>
</ol>6. התאמת נתונים של NSE
<ol><li>ערוך את סקריפט הפיתון "stapler-drspine.py", שסופק על ידי מדען המכשיר המסייע, עם שמות נתוני הקובץ המופחתים. הערה: סקריפט הפייתון זמין באופן חופשי למשתמשי הכלי.</li>
	<li>ערוך את הפונקציה כך שתתאים מהספריה שסופקה.</li>
	<li>הקלד את שם הסקריפט הערוך "stapler-drspine.py" במבקש הפקודות והקש Enter כדי לקרוא, להתאים ולהתוות נתוני NSE מופחתים. הערה: מדען המכשירים יספק תבנית למאקרו ההפחתה ולסקריפט הפיתון "stapler-drspine.py" שיכול לקרוא ולהתאים לנתונים המופחתים של NSE. נתוני ה- NSE המופחתים הסופיים הם בפורמט ASCII וניתן לקרוא אותם על ידי תוכנות מועדפות שונות.</li>
</ol>

<ol><li>Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitter%2C+J+%22Neutron+Scattering+in+Biology%3A+Techniques+and+Applications%22">Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications</a>. , New York. (2006).</li>
<li>Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+spin-echo+and+TOF+reveals+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physical+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).</li>
<li>Inoue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+domain+fluctuations+on+50-ns+timescale+enable+catalytic+activity+in+phosphoglycerate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).</li>
<li>Callaway, D. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+activation+of+nanoscale+dynamics+in+a+disordered+protein+alters+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+internal+friction+by+osmolyte+interaction+in+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).</li>
<li>Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+neutron+spectroscopy-a+tool+for+the+investigation+of+dynamics+of+polymers+and+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Physique%22%5BJournal%5D)">High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter.</a> Comptes Rendus Physique. , (2007).</li>
<li>Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRichter%2C+D+%22Polymer+Science%3A+A+Comprehensive+Reference%2C+10+Volume+Set%22">Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set</a>. , (2012).</li>
<li>Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+CC+%22Single+Crystal+Neutron+Diffraction+From+Molecular+Materials%22">Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials</a>. , World Scientific. Singapore. (2000).</li>
<li>Marshall, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+W+%22Theory+of+thermal+neutron+scattering%22">Theory of thermal neutron scattering</a>. , Oxford University Press. (1971).</li>
<li>Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering &#34;Theory&#34. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf">https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf</a> (2004).</li>
<li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+in+polymer+physics%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering in polymer physics.</a> Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).</li>
<li>Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+Scattering+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering for biology.</a> Neutron Scattering in Biology. , (2006).</li>
<li>SNS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sna">https://neutrons.ornl.gov/sna</a> (2020).</li>
<li>HFIR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/hfir">https://neutrons.ornl.gov/hfir</a> (2020).</li>
<li>CNCS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/cncs">https://neutrons.ornl.gov/cncs</a> (2020).</li>
<li>Perticaroli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+hydration+water+in+protein+%28green+fluorescent+protein%29+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).</li>
<li>Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigidity%2C+secondary+structure%2C+and+the+universality+of+the+boson+peak+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins.</a> Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flexibility+change+in+cytochrome+p450cam+substrate+binding+determined+by+neutron+scattering%2C+NMR%2C+and+molecular+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation.</a> Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).</li>
<li>Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASIS%3A+A+new+backscattering+spectrometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+News%22%5BJournal%5D)">BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS.</a> Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).</li>
<li>Mamontov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+diffusion+processes+measured+in+living+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microscopic diffusion processes measured in living planarians.</a> Scientific Reports. 9, 8708(2018).</li>
<li>Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+flexibility+in+pig+immunoglobulin+G+studied+by+neutron+spin-echo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique.</a> Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).</li>
<li>Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+protein+domain+motion+in+Taq+polymerase+revealed+by+neutron+spin-echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).</li>
<li>Biehl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+correlated+interdomain+motion+in+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase.</a> Physical Review Letters. 101, 138102(2008).</li>
<li>Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+nanoscale+allosteric+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).</li>
<li>Bu, Z., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+propagation+of+long-range+allosteric+signals+by+nanoscale+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 100 (3), 223(2011).</li>
<li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+a+compact+state+of+a+multidomain+protein%2C+the+mercuric+ion+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase.</a> Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).</li>
<li>Longeville, S., Stingaciu, L. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+diffusion+and+the+dynamics+of+oxygen+capture+by+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells.</a> Scientific Reports. 7, 10448(2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+induction+due+to+free+larmor+precession%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Nuclear induction due to free larmor precession.</a> Physical Review. 77, 297(1950).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+echoes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Spin echoes.</a> Physical Review. 80, 580(1950).</li>
<li>Svergun, D. I., Koch, M. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+studies+of+biological+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution.</a> Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).</li>
<li>Sasview. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sasview.org">https://www.sasview.org</a> (2020).</li>
<li>Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+Q-range+small-angle+neutron+scattering+diffractometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS.</a> Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-resolution+neutron+spin-echo+spectrometer+for+the+SNS+with+%CF%84+%E2%89%A5+1+%C2%B5s%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs.</a> Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).</li>
<li>SNS-NSE web page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/nse">https://neutrons.ornl.gov/nse</a> (2022).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spin-echo+spectrometer+at+the+Spallation+Neutron+Source+%28SNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research%2C+Section+A%3A+Accelerators%2C+Spectrometers%2C+Detectors+and+Associated+Equipment%22%5BJournal%5D)">The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS).</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).</li>
<li>Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+data+extraction+from+neutron+time-of-flight+spin-echo+raw+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data.</a> Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).</li>
<li>Dr Spine hub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine">https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine</a> (2022).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).</li>
<li>FZJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs">https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs</a> (2022).</li>
<li>KWS2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://miz-garching.de/kws-2">https://miz-garching.de/kws-2</a> (2022).</li>
<li>Moorhouse, M., Barry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+databank%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+Biocomputing+and+Perl%22%5BJournal%5D)">The protein databank.</a> Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).</li>
<li>Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ensemble+modelling+of+flexible+macromolecules+using+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering.</a> IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCNS+neutron+spin-echo+spectrometer+J-NSE+at+the+FRM+II%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II.</a> Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107(2008).</li>
<li>Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+internal+protein+dynamics+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy.</a> Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).</li>
<li>Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+internal+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Slow internal protein dynamics in solution.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103(2014).</li>
<li>Hinsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+modeling+toolkit%3A+A+new+approach+to+molecular+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations.</a> Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).</li>
<li>Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion.</a> Physical Review. 36 (5), 823(1930).</li>
<li>Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion+II%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion II.</a> Reviews of Modern Physics. 17, 323(1945).</li>
<li>Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+domain+motion+and+long-range+allostery+in+signaling+proteins-a+view+from+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+scattering+function+for+macromolecules+in+solution+probed+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo.</a> Physical Review E. 95, 020501(2017).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-time+dynamics+of+proteins+in+solutions+studied+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).</li>
</ol>

המחבר מצהיר שאין אינטרסים כלכליים מתחרים ואין ניגודי עניינים. תוכן כתב היד מבוסס על ההרצאה שהציג המחבר בבית הספר לביולוגיה מבנית של HANDS-Neutron בין השנים 2019-2021.

ספקטרוסקופיית NSE מספקת תצוגה ייחודית ומפורטת של הדינמיקה של חלבונים, שטכניקות ספקטרוסקופיות אחרות אינן יכולות לייצר. מדידות על פני סולם זמן ממושך מספקות תצפיות הן על הדיפוזיה התרגומית והן על הדיפוזיה הסיבובית של החלבונים, כפי שמוצג כאן. הדינמיקה הסגמנטלית ותנודות פנימיות אחרות חושפות את עצמן כדעיכה חזקה של פונקציית הפיזור הקוהרנטית S(Q, t) בסולם זמן קצר ומופרדות היטב מתהליכי ההרפיה הדיפוזיהיים הכוללים. המגבלות העיקריות של טכניקת NSE הן זמן המדידה המורחב ונפחי הדגימה הגדולים הדרושים לרכישת אות סטטיסטי טוב. זה יכ...

<table><tbody><tr><td>תמיסת חלבון בקר</td><td>MBP Sigma-Aldrich</td><td>M1891</td><td>אבקה ליופילית משוחזרת ב&nbsp; D2O</td></tr><tr><td>D2O - מים כבדים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>מוצר מס' 151882</td><td>מים דיונים</td></tr><tr><td></td><td>נוזליים בבית</td><td></td> <td>לתאי כביסה / ניקוי</td></tr><tr><td>מכשיר DLS</td><td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&uuml; </td><td>מכשיר פיזור אור lich-דינמי</td><td></td></tr> <tr><td>תקני פיזור אלסטי</td><td>SNS-NSE, ORNL-Al</td><td></td><td>2O3&nbsp; ואבקות גרפיט</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>65350-M</td><td>70% אתנול לניקוי תאים</td></tr><tr><td>תמיסת חלבון</td><td>IgG Sigma-Aldrich</td><td>I4506</td><td>אבקה ליופילית משוחזרת ב&nbsp; D2O</td></tr><tr><td>מכשיר KWS-2</td><td>תחנת JCNS ב-MLZ,&nbsp; Garching,</td> <td>גרמניה-מכשיר</td> <td>נויטרונים זווית קטנה</td></tr><tr><td>Liquinox חומר ניקוי כלים מעבדה</td><td>נוזלי Alconox-Phosphate</td><td></td> <td>מנקה כלי זכוכית</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>מוצר מס' S9390</td><td>מלח דיסודיום פוספט הפטהידראט</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>מוצר מס' S9888</td><td>נתרן כלורי NaH</td></tr><tr><td>2PO4&middot; H2O</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>מוצר מס' S9638</td><td>מונוסודיום פוספט מונוהידראט</td></tr><tr><td>מלח ננו-טיפה ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו מדעי</td><td>מספר קטלוגי:&nbsp; ND-2000</td><td>NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>מצלמת יישור</td><td>נויטרונים NeutronOptics, מצלמת גרנובל</td><td></td><td>NOG210222 100 x 100 מ"מ עם חיישן CMOS Sony IMX249</td></tr><tr><td>Parafilm M - פרפילם שעווה</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td><td>סרט מעבדה לכל מטרה במתקן קרטון</td></tr><tr><td>Phoenix-J-NSE ספקטרומטר</td><td>JCNS outstation ב-MLZ,&nbsp; Garching,</td> <td>גרמניה-ספקטרומטר נויטרונים</td><td></td></tr> <tr><td>SasView</td><td>https://www.sasview.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SAXSpace, מכשיר אנטון פאר</td><td>FZ-J&uuml; </td><td></td><td>lich-זווית קטנה</td></tr><tr><td>מכשיר רנטגן ממברנות דיאליזה Slide-A-Lyzer Thermo</td><td>Scientific</td><td>88400-88405</td><td>Slide-A-Lyzer מיני מכשירי דיאליזה צינורות של 3.5 K MWCO</td></tr><tr><td>SNS ניתוח מרחוק אשכול</td><td>מדעי נויטרונים ניתוח מרחוק (sns.gov)</td><td>https://analysis.sns.gov</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר SNS-NSE</td><td>ORNL, אוק רידג', טנסי, ארה"ב-ספקטרומטר</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>נויטרוניםמסנני מזרק סטריליים</td><td>VWR</td><td>N.A. PN:28145-501</td><td>0.2 &micro; מסנני גודל נקבוביות m</td></tr><tr><td>מערכת אילוץ טמפרטורה (TFS)</td> <td>SP מדעי</td><td>מספר חלק 100004055</td><td>ציוד סביבה לדוגמא</td></tr><tr><td>אוריאה -d4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>מוצר מס' 176087</td> מד <td>צמיגות מלח אוריאה</td></tr><tr><td></td><td>FZ-J&uuml; ליץ</td><td>'-</td><td>נופל כדור ויסקומטר</td></tr></tbody></table>

חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

הפעילות והתפקוד של רוב חלבוני גוף האדם קשורים לשינויים קונפיגורטיביים של תת-דומיינים שלמים בתוך המבנה הגבישי של החלבון. המבנים הגבישיים בונים את הבסיס לכל חישוב המתאר את המבנה או הדינמיקה של חלבון, רוב הזמן עם מגבלות גיאומטריות חזקות. עם זאת, הגבלות אלה מהמבנה הגבישי אינן קיימות בתמיסה. מבנה החלבונים בתמיסה עשוי להיות שונה מהגביש עקב סידור מחדש של לולאות או תת-דומיינים בסולם הזמן של פיקו לננו-שניות (כלומר, משטר הזמן הפנימי של דינמיקת חלבונים). העבודה הנוכחית מתארת כיצד ניתן לגשת להילוך איטי על צירי זמן של כמה עשרות ננו-שניות באמצעות פיזור נויטרונים. בפרט, האפיון הדינמי של שני חלבונים אנושיים עיקריים, חלבון בעל הפרעה פנימית חסר מבנה משני מוגדר היטב וחלבון נוגדן קלאסי, מטופל על ידי ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים (NSE) בשילוב עם מגוון רחב של שיטות אפיון מעבדה. תובנות נוספות על הדינמיקה של תחום החלבונים הושגו באמצעות מודלים מתמטיים כדי לתאר את נתוני הנייטרונים הניסיוניים ולקבוע את ההצלבה בין תנועות חלבונים מפוזרות ופנימיות משולבות. מיצוי התרומה הדינמית הפנימית לפונקציית פיזור הביניים המתקבלת מ-NSE, כולל ציר הזמן של התנועות השונות, מאפשר ראייה נוספת של התכונות המכניות של חלבונים בודדים ורכות החלבונים בסביבתם הכמעט טבעית בתמיסת החלבון הצפופה.

חלבון IgG מסרום אנושי וחלבוני MBP בקר הוכנסו מחדש בריכוזים גבוהים (כ-50 מ"ג/מ"ל) במאגרי בסיס O D2. מכיוון שהחלבונים הומסו בריכוזים גבוהים, התמיסות שהתקבלו היו תמיסות חלבונים צפופות. הדינמיקה שנחשפה באמצעות NSE סובלת מהסביבה הצפופה שבה שוכנים החלבונים (אינטראקציות של גורמי מבנה והשפעות הידרודינמיקה)5,28,39. DLS בוצע בסדרת ריכוזים עבור כל חלבון כדי להסביר את השפעות הצפיפות. האקסטרפולציה לריכוז אפס של מקדמי הדיפוזיה התרג...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לחקר המבנה והדינמיקה של שני חלבוני מודל שיש להם תפקיד חשוב בבריאות האדם. הטכניקה משלבת אפיון ביופיזי עם ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים כדי לגשת לדינמיקה בזמן ובקני המידה של האורך הרלוונטיים לתנועות אינטרדומיין של חלבונים.

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

הפרוטוקול הבא מציג כיצד להגדיר ניסוי Neutron Spin Echo כדי למדוד את פונקציית פיזור הביניים ולחקור את הדינמיקה של חלבונים בתמיסה. היתרון העיקרי של ספקטרוסקופיית הד הספין של נויטרונים הוא יכולתה לבחון סידור מחדש של תחומי חלבונים ותת-תחומים בסולם הזמן של פיקו לננו-שניות,שהוא טווח ההילוך האיטי בחלבונים בסביבתם הכמעט טבעית, ובתמיסת החלבון הצפופה. Neutron Spin Echo רגיש גם לתצורה איזוטופית, המאפשרת מחקרים מאוד ספציפיים וממוקדים באמצעות התאמת ניגודיות.תובנות על דינמיקה של תחום החלבונים הן חלק מרכזי במחקר הביופיזי במשימה הקשה המתמשכת להעביר את תנועות התחום של החלבונים עם הפונקציונליות הביולוגית שלהם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מיושם באופן כללי על כל מדידת Neutron Spin Echo המבוצעת בספקטרומטר SNS-NSE, ללא קשר לבחירת הדגימות שלך, אם אחת מהן נשארת בתחום החומרים החומר הרך. כדי להגדיר את הניסוי התחל על ידי בחירת עובי טעינת דגימת התא, בהתבסס על ריכוז דגימת החלבון, הטמפרטורה הדרושה למדידה וכמות התמיסה הזמינה.נקו את התא עם חומר ניקוי כלים ללא פוספט, מים שעברו דה-יוניזציה ו-70% דיאטנול. מייבשים את התא בתנור הסעה. מעמיסים ארבעה מיליליטרים של תמיסת חלבון לתוך התא, וסוגרים עם כובעים.השתמש בסרט שעווה או בחומר איטום כלשהו כדי לאטום את תאי הדגימה. טען ארבעה מיליליטרים של חיץ דיאליזה למיכל זהה לזה של דגימת החלבון והאטימה. העברת דגימות לקו הקרן.סגור את התריס, והיכנס לאזור המערה של מתחם הספקטרומטר. הרכיבו את תא הדגימה על מחזיק דגימת האלומיניום על ידי הידוק הברגים ולוחות האחיזה. הרכיבו את דגימת הגרפיט ואת דגימת אבקת תחמוצת האלומיניום המועמסת במיכל זהה לזה של דגימת החלבון.הניחו את אותו מחזיק על ידי החלקה עדינה שלו לתוך פחית מערכת כפיית הטמפרטורה. סגור את מכסה המערכת מכריח הטמפרטורה, והגדר את הטמפרטורה לערך הרצוי על ידי גישה למסך האינטראקטיבי של מערכת כפיית הטמפרטורה. הרכיבו את מצלמת הנייטרונים ליישור הדגימות לקרן.כדי לאסוף את נתוני הספקטרוסקופיה של Neutron Spin Spin Echo, יישרו את הדגימה בקרן הנייטרונים באמצעות מצלמת הנייטרונים, וארבעת מפתחי הדגימה הבלתי תלויים. פתח את מקור הנייטרונים של Spallation, את תוכנת איסוף הנתונים של Neutron Spin Echo Spectroscopy, ואסוף סטטיסטיקות דגימה על ידי הרצת סריקות סטייה עבור זוויות הפיזור ואורך הגל הרצויים. הגדר את פרמטרי המדידה בהתבסס על הנתונים הסטטיסטיים שנאספו עבור כל דגימה על-ידי עריכת פקודות המאקרו של המדידה שסופקו על-ידי מדען המכשיר המסייע.התחל לסרוק על ידי הקלדת שם הפרוטוקול במנחה הפקודה ורכישת הדים עבור המדגם. היכנס לאשכול הניתוח מרחוק של Neutron Sciences עם אישורי המשתמש של ORNL ולחץ על לחצן ההפעלה. בספריית המשתמש, פתח חלון מסוף והקלד את פקודת הגדרת התוכנה.לאחר מכן, הקלד את פקודת הסביבה. צור תיקיה להפחתת הנתונים בספריית הבית והעתק את קבצי ה- Script ופקודות המאקרו שסופקו מהספרייה המשותפת. ערוך, שנה את שמו ושמור את מאקרו ההפחתה המסופק בהתאם.הקלד drspine"במנחה הפקודה והקש Enter כדי להתחיל את סביבת הפחתת התוכנה. הקלד את שם מאקרו ההפחתה במבקש הפקודות בסביבת התוכנה והקש Enter. ערוך את סקריפט Python שסופק על-ידי מדען המכשירים המסייעים עם שמות נתוני הקובץ המופחתים.ערוך את הפונקציה כך שתתאים מהספריה שסופקה. הקלד את שם קובץ ה- Script הערוך במבקש הפקודות והקש Enter כדי לקרוא, להתאים ולהתוות נתוני NSE מופחתים. פונקציית פיזור הביניים שנמדדה על ידי NSE עבור חלבוני IgG ו-MBP מראה סטייה ברורה מתהליך הרפיה פשוט דמוי דיפוזיה בסולם הזמן הקצר של ארבע שנים, מה שמעיד על הנגישות של הדינמיקה הפנימית של חלבונים על ידי NSE, ועל הצורך במודל מורכב יותר לתיאור התהליכים הדינמיים הנצפים.התוצאות של חישובי פונקציות פיזור ביניים שהותקנו על ידי מודלים אטומיים של שני החלבונים באמצעות מודלים שפותחו על ידי היו בקנה אחד עם נתוני NSE הניסוייים. התוצאות הוכיחו כי ניתן לייחס דינמיקה איטית יותר שנצפתה בזמנים פרוותיים ארוכים יותר לתהליכי הדיפוזיה התרגומיים והסיבוביים הכוללים, בעוד שניתן לייחס את הדינמיקה שנצפתה בסקאלות הזמן הקצרות לדינמיקה של תחומי חלבונים. דבר אחד שחשוב לזכור הוא הצורך בדגימות מוכנות ונקיות למדידות NSE.לדוגמה טובה עבור ספין אקו יש יחס היפוך גבוה משלוש, שהוא היחס בין פיזור קוהרנטי לפיזור לא קוהרנטי של המדגם. כמו כן, במהלך הכנת הדגימה וטעינת הדגימה לתאי ה-NSE, יש לשמור על תמיסת הדגימה בטוחה ונקייה מכל זיהום צולב כימי או ביולוגי. מטעמי בטיחות יש לנסות את הכניסה למתחם הספקטרומטר רק לאחר סגירת התריס, והותר זמן נוסף של חצי שעה לקירור קרינה של המארז.פיזור נויטרונים בזווית קטנה מומלץ להעריך את הצורה והמבנה של חלבונים בתמיסה מרוכזת. זה יכול להיעשות לפני או במקביל לניסוי NSE. שיטות נוספות כמו פיזור אור דינמי ומדידות צמיגות מספקות מידע על הדיפוזיה התרגומית ועל האינטראקציה ההידרודינמית בתוך תמיסת החלבון המרוכזת, ומומלצות גם הן.

study-of-protein-dynamics-via-neutron-spin-echo-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים להכנת מדגם, הפחתת נתונים וניתוח נתונים במחקרי הד ספין נויטרונים (NSE) של ממברנות השומנים. תיוג דיטריום נבון של שומנים מאפשר גישה לדינמיקה שונה של ממברנה על קשקשי אורך וזמן מזוסקופיים, שעליהם מתרחשים תהליכים ביולוגיים חיוניים.

ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לאפיין דינמיקה מבנית של חלבונים באופן ספציפי לשאריות. אנו מספקים פרוטוקול מעשי להקלטת NMR 15N R1 ו- R2 הרפיה ו {1H}-15N אפקט Overhauser הטרוגרעיני (hetNOE), רגיש לפיקושניות לציר הזמן של ננו-שניות.

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

Velocimetry מערכת הד חלקיק תמונה (EPIV) מסוגלת לרכוש שדות דו ממדים של מהירות בנוזלים אופטיים אטומים או באמצעות גיאומטריות אופטיות אטומות מתוארת, ומדידות אימות בזרימת צינור מדווחות.

הד Velocimetry תמונת חלקיקים

המטרה הכללית של שיטה זו היא לקבוע את המבנה האלקטרוני האנרגיה נמוכה של מוצקים בטמפרטורות נמוכות במיוחד באמצעות ספקטרוסקופיה Photoemission angle-resolved עם קרינת סינכרוטרון.

Angle-resolved ספקטרוסקופיה Photoemission בטמפרטורות נמוכות במיוחד

זיכרון הד השיפוע הוא פרוטוקול לאחסון מצבים קוונטיים אופטיים של אור בהרכבים אטומיים. זיכרון קוונטים הוא מרכיב מפתח של מהדר קוונטים, אשר יכול להאריך את הטווח של הפצת מפתח קוונטים. אנו מתארים את הפעולה של התכנית כאשר מיושמים בהרכב אטומי 3 ברמה.

Gradient Echo קוונטית זיכרון בחם אטומי החמקן

תא גזירה היא פיתחה עבור מדידות פיזור ניטרונים זווית קטנה במישור שיפוע מהירות-המהירות של גזירה ומשמש לאפיון נוזלים מורכבים. מדידות נפתרו מרחבית בכיוון שיפוע המהירות אפשריות לחקר חומרי גזירת פסים. יישומים כוללים חקירות של תפוצות colloidal, פתרונות פולימר, ומבנים עצמי התאספו.

מדידת חומר מיקרו תחת זרם באמצעות 1-2 מטוס זרימה קטן זווית ניוטרון פיזור

הושגה התקדמות בשימוש ספין הד נפתרה פיזור שכיחות מרעה (SERGIS) כטכניקת פיזור נויטרונים כדי לחקור את קשקשי אורך בדגימות לא סדירות. גבישים של [6,6]-פניל-C61-חומצה בוטירית מתיל אסתר נבדקו בטכניקת SERGIS והתוצאות אושרו על ידי מיקרוסקופיה של כוח אופטי ואטומי.

באמצעות נויטרונים ספין הד נפתרה שכיחות מרעה פיזור לחקור חומרים אורגניים תאים סולאריים

חקור דינמיקת חלבונים בספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים לחקר תנועות דומיינים בחלבונים בטווחי זמן פיקו עד ננו-שניות. שיטה זו מאפשרת תצפית בסביבה כמעט טבעית ומספקת תובנות לקשר בין תנועות חלבונים לתפקוד ביולוגי.

חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים

גלה סרטונים נוספים