ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

כל חלבוני הממברנה הם מטרות חשובות בגילוי תרופות. הייצור בקנה מידה גדול ביותר של חלבוני ממברנה נותר צוואר בקבוק לביצוע מחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים של חלבוני ממברנה. ניתן להשתמש בשיטה זו לסינתזה יעילה של חלבוני ממברנה במבחנה ולהכנת פרוטאוליפוסומים מטוהרים תוך זמן קצר עם אחוזי הצלחה גבוהים.

לאחר הוספת הריאגנטים המתאימים, כולל פלסמיד הביטוי נטול התאים ליצירת תערובת תגובת שעתוק, מערבבים את תוכן הצינור על ידי היפוך עדין או הקשה ומבצעים סיבוב מהיר במיקרו-צנטריפוגה. לאחר הסיבוב, דגרו את תערובת תגובת השעתוק למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן ערבוב ומדרגת סיבוב למטה. כדי להכין את מאגר התרגום, יש לדלל את תמיסת המלאי במים טריים טהורים במיוחד.

לתרגום בקנה מידה קטן, השתמש בכוסות דיאליזה של 100 מיקרוליטר שטופות במים טהורים במיוחד כדי להסיר את הגליצרול מקרום הדיאליזה. הוסף מיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד לצינור חדש של 1.5 מיליליטר והכנס דיאליזה בקנה מידה קטן לתוך הצינור. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד לכוס לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.

להכנת ליפוזומים, העבירו תמיסת שומנים המכילה 50 מיליגרם שומנים לבקבוק אידוי. הניחו את הבקבוק במאייד סיבובי כדי לאדות את הממס. כאשר נוצרה שכבת שומן דקה ומפוזרת באופן שווה על פני תחתית הבקבוק, העבירו את הבקבוק למייבש ואקום בלחץ שלילי למשך הלילה כדי להסיר את הממס לחלוטין.

למחרת בבוקר, הסר את הצלוחיות מהמייבש ובדוק את השכבה הדקה של השומנים. הוסף מיליליטר אחד של מאגר תרגום לבקבוק וסובב את הבקבוק כדי לפזר את המאגר על סרט השומנים הדק. לאחר חמש דקות, סוניקציה של הבקבוק משנה את הזווית מדי פעם כדי לאפשר לתמיסה לגעת בכל משטח סרט השומנים.

הפסק סוניקציה כאשר השומן מופשט לחלוטין מהבקבוק ומתלה הליפוזום הופך אחיד. לאחר מכן העבירו את תרחיף הליפוזום לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. לפני ביצוע תרגום חלבון במבחנה, יש לצוף שפופרת של תמצית נבט חיטה מאחסון של מינוס 80 מעלות על מים בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות כדי להפשיר את החומר במהירות.

עם הפשרת התמצית, מערבבים מיד את תכולת הצינור בהיפוך עדין. לאחר מכן סובב והנח את הצינור על קרח. הוסף את תמצית נבט החיטה, mRNA וליפוזומים ליצירת תערובת תגובת תרגום.

מערבבים את תכולת הצינור על ידי היפוך עדין או הקשה ומבצעים סיבוב מהיר במיקרוצנטריפוגה. כדי לבצע תרגום חלבון במבחנה בקנה מידה קטן, הסר את המים מכוס הדיאליזה והצינור בקנה מידה קטן והוסף מיליליטר אחד של מאגר תרגום לצינור ו-300 מיקרוליטר לכוס. קח 60 מיקרוליטר של תערובת תגובת תרגום.

הכנס את קצה הפיפטה למאגר התרגום בכוס הדיאליזה. לאחר מכן מזריקים את התערובת לאט ובעדינות. תערובת התגובה עם צפיפות גבוהה יותר שוקעת באופן ספונטני לתחתית הכוס ויוצרת שכבה.

מכסים את הכוס במכסה כדי למנוע אידוי. כדי לבצע תרגום בקנה מידה גדול, הוסף 22 מיליליטר של מאגר תרגום לצינור של 25 מיליליטר והנח דיאליזה של שני מיליליטר לתוך הצינור. הוסף שני מיליליטר של מאגר תרגום לכוס הדיאליזה.

קח 500 מיקרוליטר מתערובת תגובת התרגום, הזריק לאט ובעדינות את התערובת למאגר התרגום בכוס. דגרו את התגובות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס. למחרת מערבבים היטב את התגובה בכוס הדיאליזה על ידי פיפטינג ומעבירים את תרחיפי הפרוטאוליפוזום הגולמיים לצינורות חדשים.

כדי לטהר את הפרוטאוליפוזומים, משקעים את הפרוטאוליפוזום בתרחיפים הגולמיים על ידי צנטריפיקציה. לאחר מכן שטפו את הפרוטאוליפוזום על ידי השעיה בנפח המתאים של מאגר PBS קר כקרח שלוש פעמים. לאחר הכביסה, השעו היטב את כדורי הפרוטאוליפוסום בנפח קטן של PBS ומדדו את נפח המתלה באמצעות מיקרופיפטה.

לאחר מכן הוסף PBS כדי לכוונן את עוצמת ההשעיה. העבירו כל תרחיף לצינור מיקרו חדש. כדי להגדיר ניתוח דפי SDS, הוסף 70 מיקרוליטר מים ו-40 מיקרוליטר של מאגר דגימת דפי SDS מרוכז שלושה פעמים ל-10 מיקרוליטר מכל תרחיף פרוטאוליפוזום.

הגדר ג'ל עמוד SDS בשיפוע של 5 עד 20% בתא אלקטרופורזה. טען את הג'ל בשני מיקרוליטר של סמן גודל החלבון שלושה, שישה ו-12 מיקרוליטר מכל דגימת פרוטאוליפוזום ו-10 מיקרוליטר של תקני אלבומין בסרום בקר. לאחר טעינת הדגימות, הפעל את האלקטרופורזה ולאחר מכן צביעת הג'ל בצבע Coomassie Brilliant Blue.

לבסוף, יש להסיר את צבע הג'ל במים חמים בניעור עדין ולסרוק את תמונת הג'ל. באמצעות פרוטוקול זה כפי שהודגם, ניתן לייצר בקלות מגוון חלבוני ממברנה עם שלושה סלילי טרנסממברנה או יותר כפרוטאוליפוזומים תוך זמן קצר. בשיטת דיאליזה דו-שכבתית זו, ניתן לבצע ביעילות אספקה רציפה של מצעים והסרת תוצר הלוואי הן בחלק העליון והן בחלק התחתון של תערובת התגובה לאורך תקופה ארוכה, מה שמוביל ליעילות תרגום מצוינת.

שיטת הדיאליזה הדו-שכבתית מביאה לעלייה של פי 4 עד 10 בפרודוקטיביות בהשוואה לשימוש בשיטות הדו-שכבתיות או הדיאליזה בלבד. איסוף הפרוטאוליפוזומים המסונתזים על ידי צנטריפיקציה וטיהורם החלקי עם מאגר כביסה מקצר מאוד את תהליך הטיהור של חלבוני הממברנה. מערכת נטולת תאים זו קלה לתפעול וניתנת להרחבה גבוהה.

זה יכול לשמש גם לייצור חלבוני זיכרון שקשה לבטא בשיטות אחרות. שיטה זו מועילה מאוד לחקירות וניסויים המשתמשים או מכוונים לחלבוני ממברנה כגון חלבון אנטי-ממברני, ייצור נוגדנים, SPR, Elisa ו-AlphaScreen.