Name: הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למד שלוש שיטות השתלת מח עצם בעכברים לחקירת המטופויזה השיבוטית, כולל קרינת גוף מלא, מיגון ושתל ללא הכנה מוקדמת. שיטות אלו מסייעות בהפחתת תופעות הלוואי הקרדיווסקולריות ומשפרות תוצאות ניסיוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב מענקים K. וולש (HL131006, HL138014, ו HL132564), כדי ס סנו (HL152174), איגוד הלב האמריקאי להעניק M. A. אוונס (20POST35210098), ומענק קרן הלב יפן H. Ogawa.

כל ההליכים הקשורים בנושאים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה.
1. לפני תנאים קודמים
<ol><li>מניחים את העכברים המטופל על מים בתוספת אנטיביוטיקה (5 מ"מ סולפטוקסזול, 0.86 מ"מ trimethoprim) ~ 24 שעות לפני הקרנה. זה הכרחי כדי למנוע זיהום, כמו המערכת החיסונית דוכאה לאחר הקרנה, ומתוחזק במשך 2 שבועות לאחר הקרנה. בשלב זה, להשלים עכברים עם ג'ל תזונתי/ הידרציה כדי לעודד האכלה ולמנוע ירידה במשקל והתייבשות לאחר הקרנה.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61875/61875fig01.jpg"> איור 1: תמונות המציגות הגדרות שונות של תנאים מקדים. (A)מערך הקרנת הגוף הכולל של כלוב הפאי באמצעות קרן גמא (צסיום-137): קרן הקרינה מגיעה מגב הקרינה בכיוון ציר ה-y (קרינה אופקית). (B) כלוב העכבר ההתקנה הכוללת הקרנת הגוף באמצעות רנטגן: כלוב העכבר ממוקם בתא רפלקטיבי. קרן הקרינה מגיעה מראש הקרינה בצורת חרוט (קרינה אנכית). המרחק ממקור הקרינה לכלוב הוא 530 מ"מ. (C) מגש מתכוונן בקרן רנטגן: התקנה זו משמשת להקרנה מוגנת חלקית באמצעות רנטגן. קרן הקרינה מגיעה מראש הקרינה בצורת חרוט (קרינה אנכית). המרחק ממקור הקרינה למגש הוא 373 מ"מ, והרדיוס הוא 250 מ"מ.(D)מיגון בית החזה: עכברים מורדמים מונחים על מגש. העכברים ממוקמים הפוכים זה לזה בתנוחות סופיות עם ידיים ורגליים מורחבות לחלוטין. הקצה התחתון של מגן העופרת מיושר עם עצם xiphisternum ואת הקצה העליון עם התימוס. (ה)מיגון בטן: עכברים מורדמים ממוקמים כמו בהגדרת מגן בית החזה עם הקצה התחתון של מגן העופרת מיושר עם פי הטבעת ואת הקצה העליון מתחת לסרעפת. (ו)הגדרת הקרנה מגינה על הראש באמצעות קרן גמא (צסיום-137): תפאורת העכבר המורדמת מודבקת למטה והעכבר ממוקם במרסן חרוט. מגן העופרת השחור (מסומן) מכסה את ראשו ואוזניו של העכבר. קרן הקרינה מגיעה מגב הקרינה לכיוון ציר ה-Y (קרינה אופקית). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61875/61875fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. תנאי מקדים של עכברים נמענים (אופציונלי)
<ol><li>הקרנת גוף כוללת
	<ol>
<li>מניחים עכברים נמען לתוך כלוב עוגה פרוס באופן אחיד, או כלוב עכבר בתא רפלקטיבי בתוך הרדיוס המחושב כדי לקבל את אותה מנה הקרנה; עם זאת, מומלץ לכל היותר 8 עכברים לכלוב עוגה ו-5 עכברים לכלוב עכברים כדי להבטיח הקרנה אחידה(איור 1A,B).</li>
		<li>כדי להשיג myeloablation מלא, להבטיח כי עכברים המטופל לקבל מינון קרינה כולל של 11 Gy בשני שברי Gy 5.5 מופרדים על ידי מרווח של 4-24 שעות. הערה: בעוד שניתן להשיג חריטה אופטימלית על-ידי יישום מרווח של 4 שעות בין שברים, ניתן להרחיב זאת למרווח של 24 שעות, דבר שיכול להועיל כאשר העבודה ו/או ההקרנה אינן זמינות.</li>
	</ol></li>
	<li>הקרנה מוגנת חלקית
	<ol>
<li>הרדמה העכברים המטופל על ידי הזרקה תוך-אישית של קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (5-10 מ"ג/ק"ג). האיפוק של תנועת העכבר הוא קריטי כדי להבטיח הקרנה אחידה והגנה יעילה של איברי המטרה במהלך תהליך המיגון.</li>
		<li>למיגון בית החזה והבטן, כוון את קרן הקרינה של קרינה רנטגן אנכית לעכבר (איור 1C).<ol>
<li>מקמו את העכברים המרופדים על צלחת שטוחה, ומרכזים את מקור הקרינה מלמעלה. הניחו את העכברים הפוכים זה לזה בתנוחת על-חושית עם ידיים ורגליים מורחבות במלואן(איור 1D,E). הערה: מתקן הקרנת רנטגן, עבור ניסוי זה, מאפשר כי שני עכברים בכל פעם ניתן למקם ברדיוס יעיל המאפשר הקרנה אחידה. בעוד שהרדיוס האפקטיבי מחושב על סמך המרחק בין מקור הקרינה למגש, מספר בעלי החיים שניתן להקרין בו זמנית יהיה תלוי בהקרנה הספציפית.</li>
			<li>הדקו את כפות הרגליים של העכברים על הצלחת באמצעות סרט הדבקה כדי להבטיח שהעכברים משותקים במהלך הליך ההקרנה. מקם את מיגון העופרת כך שיכסה אזורים הדורשים הגנה.</li>
			<li>למיגון בית החזה, הכינו את מגן העופרת על ידי מדידת האורך מעצם xiphisternum של העכבר אל התימוס וחישוב העובי שיספק הגנה מספקת ממקור ההקרנה. הנח את מיגון העופרת כך שהקצה התחתון יתיישר עם עצם ה- xiphisternum. הקצה העליון של מחסום העופרת יתאים ליד התימוס(איור 1D).</li>
			<li>למיגון הבטן, הכינו את מגן העופרת על ידי מדידת האורך מפי הטבעת של העכבר לסרעפת וחישוב העובי שיספק הגנה מספקת ממקור ההקרנה. הנח את מיגון ההפניה כך שהקצה התחתון יתיישר עם פי הטבעת. הקצה העליון של מגן העופרת יתאים מתחת לסרעפת (איור 1E). הערה: לוקליזציה של מגן העופרת כך שיהיה עקבי בין קבוצות עשויה להפחית וריאציה מסוימת ביחס לגודל העכברים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עבור מיגון ראש, לכוון את קרן הקרינה של הקרנת צסיום אופקית לעכבר.<ol>
<li>בזהירות להקליט את ההסתעפות של עכבר מורדם לבטן. זה מבטיח כי הזרועות לקבל מנה מלאה של הקרנה ואינם מכוסים על ידי המגן.</li>
			<li>עבור מיגון ראש, למקם את העכבר במרסן חרוט, אשר מתאים בתוך מגן עופרת. לאחר שהעכבר נמצא בתוך המרסן החרוט, החלק את המרסן לתוך החריץ בתוך מגן העופרת(איור 1F). מגן העופרת אמור לכסות לחלוטין את ראשו ואוזניו של העכבר (~ 3.2 ס"מ), ולהשאיר את שאר גופו של העכבר חשוף להקרנה. ניתן להתאים את מיקום המרסן בתוך המגן כך שיתאים לבעלי חיים בגדלים שונים על ידי החלקתו פנימה או מחוץ למגן.</li>
			<li>מניחים עכברים בתוך ההקרנה, בניצב למקור להקרנה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לחשוף עכברים לשני שברי Gy 5.5 של הקרנה (המינון הכולל של 11 Gy) מופרדים על ידי מרווח של 4-24 שעות.</li>
		<li>לאחר כל שבר הקרנה, מניחים את הכלובים עם עכברים מורדמים על מחצלות מחוממות או תחת מנורות חום אדומות כדי למנוע היפותרמיה ולסייע בהתאוששות מהרדמה. הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי לא לחמם יתר על המידה את העכבר המומר בעת שימוש במנורה מכיוון שהם אינם יכולים להימלט מהחום. כפי שתואר לעיל, המיקום של בעלי חיים ועובי מגן העופרת יכולים להיות שונים בין מחקרים המבוססים על התכונות הספציפיות של הקרינה (סוג קרינה / כיוון של קרן, וכו '). החוקרים יצטרכו להתאים את הניסויים שלהם בהתאם.</li>
	</ol></li>
</ol>3. בידוד עצמות
הערה: באופן אידיאלי, עכברים תורמים ועכברים נמענים צריכים להיות דומים בגיל, ובתוך 8-12 שבועות. שימוש בלפחות 3 עכברים כתורמים (ולא כתורם יחיד) עדיף למזער את ההטרוגניות (גם בעת שימוש בעכברים עם אותו גנוטיפ). בערך, 40 מיליון תאי מח עצם לא מופרים ניתן להשיג משש עצמות (שתי עצם הירך, שתי שוקות, ושני humeri) של עכבר אחד. השתלה של 5 מיליון תאי מח עצם לכל עכבר נמען בדרך כלל תבטיח חריטה.
<ol><li>המתת חסד עכברים תורמים על ידי נקע בצוואר הרחם ללא הרדמה (שיטה מועדפת כדי למנוע זיהום כימי של תאים) ומניחים כל עכבר על כרית סופגת.</li>
	<li>לחטא את העור באמצעות תרסיס אתנול 70%.</li>
	<li>לעשות חתך רוחבי קטן בעור מתחת לכלוב הצלעות ולהחזיק את העור בחוזקה משני צדי החתך, לקרוע בכיוונים מנוגדים לכיוון הראש והרגליים. לקלף את העור מכל הגפיים.</li>
	<li>חותכים מעל הכתפיים ומפרקי המרפק, ומסירים את השרירים המחוברים ואת רקמות החיבור בעזרת קימיפי כדי להשיג את humeri.</li>
	<li>בזהירות לפרוק את מפרקי הירך בין עצם הירך ועצמות הירך. השתמש מספריים קהה לחתוך לאורך ראש עצם הירך לנתק את הרגליים. חותכים מעל מפרק הברך כדי להפריד את עצם הירך ואת השוקה, ולהסיר בזהירות את השרירים המצורפים ואת רקמות החיבור בעזרת קימוויפ כדי לקצור את עצם הירך ואת השוקה. הערה: שים לב במיוחד כדי לשמור על אפיפיזת העצם ללא פגע במהלך שלב זה. השלך את כל העצמות השבורות עקב אובדן עקרות. עצמות הירך ועצמות עמוד השדרה ניתן לאסוף בנוסף עצם הירך, השוקה, ועצם הזרוע. כדי לאסוף עצמות עמוד השדרה, מרגמה ועלי יכול לשמש כדי למחוץ את העצמות לחתיכות לקצור את תאי מח העצם.</li>
	<li>מניחים את העצמות המבודדות מעכברים מאותו גנוטיפ לתוך צינור חרוט 50 מ"ל בהתאמה המכיל 20 מ"ל קרח קר סטרילי PBS, ולשמור אותו על הקרח עד לשימוש נוסף. שים לב במיוחד למקם את העצמות בצורה נכונה לתוך צינורות עם גנוטיפים תואמים.</li>
	<li>חזור על השלבים לעיל עבור כל בעל חיים תורם שינוי כפפות בין כל עכבר. כמו כן, מספריים נקיים ומכשירים אחרים עם 70% אתנול בין כל עכבר.</li>
</ol>4. בידוד תאי מח עצם
הערה: בצע את השלבים הבאים בארון מסוג BIOSAFETY II.
<ol><li>הכנת ערכות צינור: לעשות חור קטן בחלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 0.5 מ"ל באמצעות מחט 18 G ומניחים אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל, אשר מכיל 100 μL של PBS סטרילי קר כקרח בתחתית. הערה: כמו רק שש עצמות יכול להתאים לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, מומלץ להכין ערכות צינור מספיק כדי לעבד את כל העצמות באותו זמן.</li>
	<li>שאפו את ה-PBS והעבירו את העצמות המבודדות לצלחת סטרילית של 100 מ"מ של תרבית תאים. מחזיקים כל עצם באמצעות מלקחיים עדינים, חותכים בזהירות את האפיפיזות מכל קצה באמצעות מספריים קטנות שעוקרו במובלעת אוטומטית. מניחים את העצמות החתוכות בערכות הצינור המוכנות.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינורות ב 10,000 x g עבור 35 s ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, לאשר כי מח העצם הוסר בהצלחה מן העצמות. עצמות אמורות להיראות לבנות ושקוף עם גלולה אדומה גדולה יחסית בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השלך את צינור המיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל. הערה: אם הבדיקה החזותית לא מצליחה לזהות מח עצם בתחתית צינור 1.5 מ"ל, לחתוך את העצם שוב ולחזור על שלב 4.3.</li>
	<li>Resuspend מח העצם ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח, ולאחר מכן להעביר את השעיית התא מאותו גנוטיפ לצינור חרוט תואם 50 מ"ל.</li>
	<li>לנתק את התאים על ידי העברת אותם דרך מחט 18 G עם מזרק 10 מ"ל 10 פעמים.</li>
	<li>סנן מתלים של תא יחיד באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר. הוסיפו PBS קר כקרח לנפח סופי של 10 מ"ל, והשתמשו מחדש בתאים באמצעות שימוש עדין בסיוע פיפטה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 310 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשאוף את supernatant ו resuspend גלולת התא עם 10 מ"ל של מדיה RPMI ללא סרום. חילוף 30 μL של חומר זה לספירת תאים.</li>
	<li>לקבוע ריכוז התא עם מונה התא, ולחשב את נפח ההשעיה התא הנדרש עבור ההשתלה. לדוגמה של 100% BMT, 5 x 10 6 תאי מחעצם נדרשים עבור כל עכבר נמען. הערה: עבור BMT תחרותי, להכין סך של 5 x 10 6 תאי מח עצם הכולליםתערובת של תאים תורמים (למשל, CD45.2+) ותאים מתחרים (למשל, CD45.1+). מומלץ מאוד להכין תאי מח עצם נוספים. לדוגמה, אם קיימים 10 עכברים נמענים לכל קבוצת ניסוי, אנו מכינים בדרך כלל מספיק תאים עבור עכברים 12 נמענים.</li>
	<li>להעביר את הנפח המחושב של השעיית התא לתוך צינור חרוט חדש 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 310 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשאוף את supernatant ו resuspend התאים באמצעות כמות מחושבת של בינוני RPMI ללא סרום כדי להשיג את צפיפות התא המתאים ואת נפח. בדרך כלל, 200 μL הוא נפח אופטימלי עבור הזרקת רטרו מסלולית.</li>
</ol>5. השתלת תאי מח עצם לעכברים מוקרנים
<ol><li>יש למרדים את העכברים המטופלים עם 5% isoflurane.</li>
	<li>בעוד עכברים מורדמים, לאט להזריק 200 μL של תאי מח עצם לתוך הווריד רטרו מסלולית באמצעות מחט 28-30 G עם מזרק אינסולין.<ol>
<li>לחלופין, בצע את המסירה של התאים התורמים על ידי הזרקה תוך ורידי זנב והזרקה תוך-רפואית של הירך, עם נפח מרבי של 0.2 מ"ל ו- 25 μL, בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר התאים מוזרקים, מניחים טיפה של טיפות עיניים המכילות proparacaine על פני השטח של העין להקלה על הכאב. לאחר מכן ניתן לאפשר לחיה לחזור להכרה.</li>
</ol>6. השתלת תאי מח עצם לעכברים לא מותנים
<ol><li>יש למרדים את העכברים המטופלים על ידי שאיפה של 5% isoflurane.</li>
	<li>הזרק 5 x10 6 תאי מח עצם לא מופרים מגנוטיפ רטרו-מסלול לעכברים שאינם מוקרנים עם מזרק אינסולין 28-30 G.</li>
	<li>חזור על שלבים 6.1 ו 6.2 על פני 3 ימים רצופים, כך העכברים המטופל יושתלו עם סך של 1.5 x 107 תאי מח עצם. הערה: מכיוון שה-BMT המאמץ ללא הליך טרום-מיזוג דורש השתלת מח עצם במשך 3 ימים רצופים, יש לנסות להחליף עיניים לכל זריקה.</li>
	<li>לאחר ההזרקה, לנהל טיפה של טיפות עיניים המכילות proparacaine לעין המושפעת.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease%2C+aging%2C+and+clonal+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li>
<li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li>
<li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li>
<li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li>
<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1%CE%B2%2FNLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li>
<li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li>
<li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li>
<li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens%3A+working+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li>
<li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li>
<li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).</li>
<li>Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease%3A+the+liver-heart+axis-literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).</li>
<li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li>
<li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li>
<li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li>
<li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li>
<li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li>
<li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקרים על hematopoiesis שיבוט, תיארנו שלוש שיטות של BMT: BMT עם הקרנה גוף כולל, BMT עם הקרנה עם מיגון חלקי, ושיטת BMT פחות נפוץ שאינו כרוך מיזוג מראש (BMT מאמץ). שיטות אלה שימשו כדי להעריך את ההשפעה של hematopoiesis שיבוט על מחלות לב וכלי דם. חוקרים יכולים לשנות שיטות אלה בהתאם כדי להתאים למטרה הספציפית של המחקר שלהם.
מודלים של המטופוזיס שיבוט Hematopoiesis קלונל היא התופעה שבה תאים המוטנטים hematopoietic להתחרות עם תאים מסוג בר ולקבל דומיננטיות שיבוט לאורך זמן. כדי ליצור ...

המטופוזיס שיבוט (CH) הוא מצב אשר נצפתה לעתים קרובות אצל אנשים קשישים מתרחשת כתוצאה של גזע hematopoietic מורחב תא אב (HSPC) שיבוט נושא מוטציהגנטית 1. הוצע כי עד גיל 50, רוב האנשים ירכשו בממוצע חמש מוטציות אקסוניק בכל HSPC2, אבל רוב המוטציות האלה יגרמו לתוצאות פנוטיפיות מועטות או לא לא לאדם. עם זאת, אם במקרה אחת מהמוטציות הללו מעניקה יתרון תחרותי ל- HSPC – למשל על-ידי קידום התפשטותו, חידושו העצמי, הישרדותו או שילוב כלשהו שלו – הדבר עשוי להוביל להרחבה מועדפת של שיבוט המוטנטים ביחס ל- HSPCs האחרים. כתוצאה מכך, המוטציה תתפשט יותר ויותר דרך מערכת hematopoietic כמו HSPC מוטציה מעוררת תאי דם בוגרים, המוביל לאוכלוסייה ברורה של תאים שעברו מוטציה בתוך הדם ההיקפי. בעוד מוטציות בעשרות גנים שונים של נהג מועמד קושרו עם אירועי שיבוט בתוך מערכת hematopoietic, בין אלה, מוטציות ב- DNA מתיל טרנספראז 3 אלפא (DNMT3A) ועשרה טרנסלוקציה 11 2 (TET2) הם הנפוצים ביותר3. מספר מחקרים אפידמיולוגיים מצאו כי אנשים הנושאים מוטציות גנטיות אלה יש סיכון גבוה יותר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם (CVD), שבץ, ותמותה סיבתית3,4,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה זיהו כי קיים קשר בין CH לבין שכיחות מוגברת של CVD ושבץ, איננו יודעים אם קשר זה הוא סיבתי או אפיפנומנון משותף עם תהליך ההזדקנות. כדי לקבל הבנה טובה יותר של קשר זה, מודלים בעלי חיים נאותים כי נכון לסכם את המצב האנושי של CH נדרשים.
מספר מודלים של בעלי חיים CH הוקמו על ידי הקבוצה שלנו ואחרים באמצעות זברה, עכברים, פרימטים שאינם אנושיים8,9,10,11,12,13,14. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בשיטות שחזור hematopoietic על ידי השתלת תאים מהונדסים גנטית, לפעמים באמצעות Recombination Cre-lox או מערכת CRISPR. גישה זו מאפשרת ניתוח של מוטציה גנטית ספציפית בתאים hematopoietic כדי להעריך איך זה תורם להתפתחות המחלה. בנוסף, מודלים אלה מעסיקים לעתים קרובות תאים קוגניים או תאים כתב כדי להבחין בין ההשפעות של תאים מוטנטים מתאים נורמליים או פראיים. במקרים רבים, משטר טרום מיזוג נדרש בהצלחה לחרוט תאי גזע hematopoietic התורם.
נכון לעכשיו, השתלת מח עצם לעכברים המטופל ניתן לחלק לשתי קטגוריות עיקריות: 1) מיזוג מיאלובלטיבי 2) השתלה מותנית. מיזוג Myeloablative יכול להיות מושגת על ידי אחת משתי שיטות, כלומר, הקרנת הגוף הכולל (TBI) אוכימותרפיה 15. TBI מתבצעת על ידי החשפות הנמען למנה קטלנית של הקרנת גמא או רנטגן, יצירת הפסקות DNA או קישורים צולבים בתוך תאים המפרידים במהירות, מה שהפך אותם לבלתי הפיכים16. בוסולפן וציקלופוזפיד הן שתי תרופות כימותרפיות נפוצות המשבשות את הנישה ההמטופוביטית וגורמות באופן דומה לנזק לדנ"א לתאים המפרידים במהירות. התוצאה נטו של תנאי מקדים מיאלובלטיבי הוא אפופטוזיס של תאים hematopoietic, אשר הורס את המערכת hematopoietic של המטופל. אסטרטגיה זו לא רק מאפשרת חריטה מוצלחת של HSPCs התורם, אבל יכול גם למנוע דחיית השתל על ידי דיכוי המערכת החיסונית של המטופל. עם זאת, myeloablative תנאי מוקדם יש תופעות לוואי חמורות כגון נזק לרקמות ואיברים ותאי החיסון תושב שלהם, כמו גם הרס של נישה מח עצם יליד17. לכן, הוצעו שיטות חלופיות להתגבר על תופעות לוואי לא רצויות אלה, במיוחד לגבי נזק לאיברים בעלי עניין. שיטות אלה כוללות הקרנה מוגנת של עכברים נמענים ואת BMT מאמץ לעכברים לא מותנים9,17. הגנה על בית החזה, חלל הבטן, הראש או אזורים אחרים מפני הקרנה על ידי מיקום של מחסומי עופרת שומרת על רקמות מעניינות מוגנות מפני ההשפעות המזיקות של הקרנה ושומרת על אוכלוסיית תאי החיסון התושבים שלהם. מצד שני, BMT מאמץ של HSPCs לעכברים מותנים יש יתרון נוסף כי זה משמר את הנישה hematopoietic יליד. בכתב יד זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים והתוצאות של תחריט HSPC לאחר מספר משטרי השתלה בעכברים, במיוחד מסירת HSPC לעכברי TBI, לעכברים המוגנים חלקית מפני הקרנה, ולעכברים לא מותנים. המטרה הכוללת היא לעזור לחוקרים להבין את ההשפעות הפיזיולוגיות השונות של כל שיטה, כמו גם כיצד הם משפיעים על תוצאות ניסיוניות בהגדרה של CH ומחלות לב וכלי דם.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-121</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>1/2 סמ"ק מזרק אינסולין LO-DOSE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט (200 prfof)</td> <td>פישר כימיקלים</td><td>200559</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>BD 1 מ"ל טוברקולין מזרקים 25 גרם 5/8 אינץ 'מחט</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309626</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide מחט 18G (1.22 מ"מ X 25 מ"מ)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>395195</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>צזיום-137 Irradiator</td><td>J. L. Shepherd&nbsp;</td><td>סימן IV</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>פלקון 100 מ"מ TC-מטופל תרבית תאים צלחת</td><td>מדעי החיים</td><td>353003</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>פלקון 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>352098</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>פישרברנד מסנני תאים סטריליים, 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>Graefe מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>מספריים עדינים מוקשים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>תמיסת איזותזיה (איזופלורן)</td><td>הנרי שיין</td><td>29404</td><td>תמיסה</td></tr><tr><td>קטמין</td><td>Zoetis</td><td>043-304</td><td>הזרקה</td></tr><tr><td>מגבי משימות עדינים</td><td>Kimwipes Kimtech Science</td><td>KCC34155</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Solution RadDisk &ndash; מכרסם Irradiator דיסק</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>אספקה כללית</td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>בינוני Sulfamethoxazole ו-Trimethoprim</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>רנטגן irradiator</td><td>מקור Rad</td><td>ציוד</td> <td>RS-2000</td></tr></tbody></table>

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד hematopoiesis שיבוט

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

המטופויזיס קלונל הוא מצב נפוץ הקשור לגיל הנובע מהצטברות של מוטציות סומטיות בתאי גזע ו אבות מהמטופויטיים (HSPCs). מוטציות בגנים של הנהג, המעניקות כושר תאי, יכולות להוביל להתפתחות של שיבוטי HSPC מתרחבים שגורמים יותר ויותר לויקוציטים צאצאים המעניקים מחסה למוטציה הסומטית. מכיוון שהמטופוזיס שיבוטי נקשר למחלות לב, שבץ ותמותה, פיתוח מערכות ניסיוניות המרכיבות תהליכים אלה הוא המפתח להבנת המנגנונים העומדים בבסיס גורם סיכון חדש זה. הליכים השתלת מח עצם מעורבים מיזוג מיאלובלטיבי בעכברים, כגון הקרנת הגוף הכולל (TBI), משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של תאים חיסוניים במחלות לב וכלי דם. עם זאת, נזק בו זמנית לגומחת מח העצם ולאתרים מעניינים אחרים, כגון הלב והמוח, הוא בלתי נמנע עם הליכים אלה. לכן, המעבדה שלנו פיתחה שתי שיטות חלופיות כדי למזער או למנוע תופעות לוואי אפשריות הנגרמות על ידי TBI: 1) השתלת מח עצם עם מיגון הקרנה ו 2) BMT מאמץ לעכברים לא מותנים. באיברים מוגנים, הסביבה המקומית נשמרת ומאפשרת ניתוח של hematopoiesis שיבוט בעוד הפונקציה של תאים חיסוניים תושב הוא ללא הפרעה. לעומת זאת, BMT מאמץ לעכברים לא מותנים יש יתרון נוסף כי הן את הסביבות המקומיות של האיברים ואת הנישה hematopoietic נשמרים. כאן, אנו משווים שלוש גישות שונות של שחזור תאים hematopoietic ולדון החוזקות והמגבלות שלהם למחקרים של hematopoiesis שיבוט במחלות לב וכלי דם.

כדי להשוות את ההשפעה של שלוש שיטות BMT / טרום מיזוג על תחריט התא התורם, שברי תאים תורמים בדם היקפי ורקמת לב נותחו על ידי cytometry זרימה ב 1 חודש לאחר BMT. תאים מבודדים הוכתמו עבור סמני לויקוציטים ספציפיים כדי לזהות את קבוצות המשנה השונות של לויקוציטים. בניסויים אלה, תאי מח עצם תורמים מסוג בר(WT) C57BL/6 (CD45.2) הועברו ל-WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/ BoyJ (CD45.1) עכברים נמען להבחין תאים התורמים מתאי הנמען. אסטרטגיות גיטינג cytometry זרימה ששימשו מתוא...

אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

הפרוטוקול שלנו יעזור לחוקרים להבין את ההשפעות הפיזיולוגיות של שלוש שיטות שונות להשתלת מח עצם וכיצד הן משפיעות על תוצאות הניסוי בהמטוטופיזיס שיבוטים. השתלת מח עצם קרינת הגוף הכוללת יכולה להשפיע לרעה על איברי לב וכלי דם ולשנות פתוגנזה של מחלות. לכן, המעבדה שלנו פיתחה שתי שיטות חלופיות כדי למזער או למנוע תופעות לוואי אפשריות.הדגמת ההליכים תהיה Eunbee Park סטודנט לתואר שני, ומייגן אוונס עמית פוסט דוקטורט, הן מהמעבדה שלי עבור בית החזה ואת הבטן מיגון, למקם את המגש מתכוונן ואת הקרנת רנטגן במרחק הנכון כדי להשיג הקרנה אחידה. ומניחים את העכברים המרדים על צלחת LED שטוחה הפוכה זה לזה בתנוחה העל-חושית. אבטחו את כפות הרגליים לצלחת באמצעות סרט הדבקה, והניחו את מיגון הלד כך שהקצה התחתון יתיישר עם עצם ה- xiphisternum והקצה העליון של מגן העופרת יושב ליד התימוס.לאחר המיגון, הנח את העכברים לתוך ההקרנה וחשוף את בעלי החיים לשניים, 5.5 שברי הקרנה אפורים המופרדים במרווח של ארבע עד 24 שעות. למיגון ראש, בזהירות קלטת ארבע כפות של העכבר לבטן. הנח את העכבר במרסן חרוט והחלק את המרסן לתוך החריץ בתוך מגן העופרת כך שראשו ואוזניו של העכבר מכוסים לחלוטין, מה שמשאיר את שאר גוף העכבר חשוף לקרינה.לאחר ההגנה מניחים את העכברים לתוך ההקרנה וחושפים את בעלי החיים ל-5.5 שברים אפורים של קרינה המופרדים במרווח של 4 עד 24 שעות. לאחר כל טיפול קרינה, מניחים את העכברים מורדמים בכלוב על מחצלת מחוממת עם ניטור עד החלמה מלאה. כדי לבודד את העצמות, לחטא את העור של העכבר התורם עם 70% אתנול ולעשות חתך עור רוחבי קטן מתחת לכלוב הצלעות.מחזיקים את העור בחוזקה משני צדי החתך, קורעים בכיוונים מנוגדים לכיוון הראש והרגליים ומקלפים את העור מכל הגפיים. חותכים מעל הכתפיים ומפרקי המרפק, ומשתמשים במגבון מעבדה כדי להסיר את השרירים המחוברים ואת רקמות החיבור מההאמרי. בזהירות לפרוק את המפרקים בין עצם הירך ועצמות הירך.ולהשתמש במספריים קהים כדי לחתוך לאורך ראשי הירך כדי לנתק את הרגליים. חותכים מעל מפרק הברך, כדי להפריד את עצם הירך ואת השוקה. ולהשתמש מגבוני מעבדה כדי להסיר בזהירות את השרירים המצורפים ורקמות חיבור מהעצמות.ואז למשוך את העצמות מעכברים של אותו גנוטיפ לתוך צינורות חרוטים בודדים 50 מיליליטר המכילים 20 מיליליטר של PBS סטרילי קר כקרח על קרח. כדי לבודד את תאי מח העצם בארון בדרגה 2 של בטיחות ביולוגית, השתמש במחט 18 מד כדי ליצור חור קטן בתחתית צינור מיקרו סטרילי של 500 מיקרוליטר. ומניחים את הצינור לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו סטרילי 1.5 מיליליטר בודדים המכיל 100 מיקרוליטרים של PBS סטרילי קר כקרח.כאשר כל הצינורות הוכנו, להסיר את PBS מהצינור המכיל את העצמות המבודדות ולהעביר את העצמות על צלחת סטרילית 100 מילימטר תרבות התא. השתמש מלקחיים עדינים ומספריים קטנים כדי להסיר בזהירות את האפיפיזה מקצות כל עצם, ומניחים עד שש עצמות לתוך כל צינור 500 microliter. כאשר כל העצמות נחתכו, לחלץ את תאי מח העצם על ידי צנטריפוגה.אם כל תכולת מח העצם הוסרה, העצמות אמורות להיראות לבנות ושקוף עם גלולה אדומה גדולה יחסית בתחתית צינור הצנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר. להשתלת תאי מח עצם, לדלל את תאי מח העצם המבודדים במדיה RPMI ללא סרום, ולטעון 200 microliters של השעיית התא לתוך אחד 0.5 מזרק אינסולין מיליליטר לכל עכבר להיות מוזרק. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, לאט להזריק את כל נפח התאים לתוך הווריד מסלולי רטרו של כל בעל חיים מורדם.ואז למקם טיפה של proparacaine על העין להקלה על הכאב. ולאפשר לעכבר לחזור להכרה בזמן שהוא במעקב. כדי להשוות את ההשפעה של שלוש שיטות תנאים קדם-תנאי BMT על תחריט תא התורם.השברים של תאים תורמים בדם היקפי ורקמת לב נותחו על ידי cytometry זרימה בחודש אחד לאחר BMT. בניתוח מייצג זה, בדם ההיקפי של עכברים נמענים שקיבלו הקרנת גוף כוללת, מונוציטים, נויטרופילים ותאי B היו במידה רבה ablated והוחלפו על ידי צאצאים של תאים נגזר מח עצם התורם. בנוסף, אוכלוסיות מונוציט ונויטרופילים לבביים של הנמען הדייר הוחלפו כמעט לחלוטין בתאים שמקורם בתורם.בקבוצת ההקרנה המוגנת חלקית, התחלופה של תאי החיסון הלבביים שנבעה מהתורם הייתה צנועה. תאי מח העצם של העכבר הנמען בתוך האזורים המוגנים תרמו ככל הנראה לרמה הנמוכה יותר של שחזור דם היקפי בהשוואה לעכברים שקיבלו הקרנת גוף כוללת. בקבוצה ללא תנאי BMT, תאים שמקורם בתורם היו ניתנים לגילוי בדם ובלבבות ההיקפיים של עכברים נמענים בארבעה שבועות לאחר BMT.בנוסף, תאי התורמים של Tet2 התרחבו בהדרגה עם הזמן. לשם השוואה, עכברים נמענים חרוטים בתאי תורמים מסוג בר הראו התרחבות מינימלית של תאי תורמים. הם אופטימיזציה של מודלים ניסיוניים אלה יאפשר מחקרים קפדניים יותר של הגנים נהג hematopoiesis שיבוט שתורמים לכל לגרום לתמותה כגון מחלות לב-מטבוליות וסרטן.אנו מקווים כי הפרוטוקולים שלנו יאפשרו לחוקרים לחקור hematopoiesis שיבוט לחקור כיצד הוא תורם למחלות לב וכלי דם ומחלות אחרות.

bone-marrow-transplantation-procedures-mice-to-study-clonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את השראת מחלת השתל נגד המאכסן של המעי, GvHD, בעכבר מושתל המוקרן באופן קטלני באמצעות תאי גזע המטופויטיים אלוגניים ולימפוציטים מסוג T אלוריאקטיביים מעוררי GvHD. פרוטוקול זה מסייע לבסס מודל GvHD חמור במעי כדי להבין את מנגנון המחלה ולפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות.

השראת מחלת השתל לעומת המאכסן במודלים של עכברים באמצעות השתלת מח עצם אלוגנית והשתלת תאים טחול

פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

אנו מתארים פרוטוקול לפיו התניה של בוסולפן מאפשרת להחליף את מח העצם של עכבר נמען בתאי מח עצם מעכברים תורמים המבטאים בכל מקום חלבון פלואורסצנטי ירוק, בהיעדר הקרנה. טכניקה זו שימושית לחקר הצטברות תאי מח עצם במערכת העצבים המרכזית.

Busulfan כסוכן Myelosuppressive ליצירת ברמה גבוהה יציבה מח עצם chimerism בעכברים

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

פרוטוקול זה מספק הנחיות שלב אחר שלב להגדרת ניסויים תחרותיים בהשתלת מח עצם של עכבר כדי לחקור את תפקוד תאי הגזע/אב המטופויאטיים ללא טיהור מוקדם של תאי גזע על ידי מיון תאים.

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

כתב יד זה מספק תיאור של המתודולוגיה המשמשת להקמת מודלים של עכברי התמרה-השתלה. ניתן תיאור מפורט של טעויות טכניות שיש להימנע מהן בעת ביצוע השתלות מח עצם. יש להשיג הבנה ברורה של החשיבות של טיטר ויראלי גבוה, טרנספקציה/התמרה והקרנה.

התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

אנו מתארים את השימוש השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) כדי להעריך את פוטנציאל ממאיר של תאים מהונדסים גנטית hematopoietic. HSCT שימושית לצורך הערכת שונים תאים ממאירים hematopoietic ויוו , כמו גם יצירת קבוצה גדולה של עכברים עם תסמונות myelodysplastic (MDS) או לוקמיה להעריך טיפולים חדשניים.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

למד שלוש שיטות השתלת מח עצם בעכברים לחקירת המטופויזה השיבוטית, כולל קרינת גוף מלא, מיגון ושתל ללא הכנה מוקדמת. שיטות אלו מסייעות בהפחתת תופעות הלוואי הקרדיווסקולריות ומשפרות תוצאות ניסיוניות.

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

גלה סרטונים נוספים