אפיון וחיזוי תפקודי של חיידקים ברקמות השחלות
23 באוקטובר 2021
כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף גן RNA ריבוזומלי 16S (גן 16S rRNA) בוצעו על מנת לגלות ולהבחין חיידקים ברקמות שחלות סרטניות ולא-ncancerous במקום. ההבדלים הקומפוזיציה והתפקודית של החיידקים היו צפויים באמצעות BugBase וחקירה פילוגנטית של קהילות על ידי שחזור של מדינות ללא הפרעה (PICRUSt).
פרוטוקול זה נועד לגלות חיידקים ברקמות השחלות ולחזות את תפקודם. כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף rRNA 16S, שימשו על מנת לגלות ולהבדיל חיידקים ברקמות שחלות סרטניות ולא סרטניות במקום. ההבדלים התזונתיים והתפקודיים של החיידקים צפויים באמצעות BoPs וחקירה תאית-גנטית של קהילות על ידי שחזור של ימים ללא הפרעה.
הפרוטוקול שלנו נועד לחלץ חיידקים מרקמות השחלות במקום. זה יכול לשמש גם כדי לגלות חיידקים בגידולים מכל סוג שהוא. היתרונות העיקריים של הפרוטוקול שלנו הם שזה קל ונוח, כי זה יכול להתממש כמעט בכל מעבדה.
זה גם מהיר לקבל את התוצאות. במהלך התרגול בפרוטוקול, חשוב להוציא כל חיידקים מחוץ לאתר רקמות גידול. לכן, כל ההליכים בפרוטוקול זה צריכים להיות סטריליים.
במהלך הניתוח, להפריד שחלות נצוצות לתוך בערך סנטימטר אחד דגימות רקמה בעובי עם זוג פינצטה סטרילית חדשה. הימנע מלגעת בכל דבר אחר במהלך כל ההליך. לאחר ההפרדה, להסיר את המדגם לתוך צינור סטרילי ולשים אותו חנקן נוזלי לשידור.
שמור על דגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לתקן רקמות על ידי פורמלין, ולאחר מכן להטמיע אותם על ידי פרפין. פרוטוקול זה ניתן להשהות כאן.
ניתן לשמור את הרקמות בטמפרטורת החדר לשימור ארוך יותר. על מנת להפעיל צעדים נוספים, לחתוך את הדגימות בחמישה מקטעים טוריים מיקרומטר. לאחר מכן, לייבש את הדגימות.
לעשות דה פרפין והידרציה לדגימות. כדי לאחזר אנטיגן, יש צורך בטיפול מיקרוגל 10 דקות במאגר EDTA. טובלים את הדגימות ב-PBS שמכיל 0.3% מימן.
Peroxidize במשך 20 דקות כדי לעצור פעילות פרוקסידאז אנדוגני. בצע את הנוגדן EMA בליבת LPS, בריכוז של 1 מעל 300. ולשמור אותו ללילה אחד בארבע מעלות צלזיוס.
על מנת לגלות את החיידקים, להשתמש בערכת מצע DAP כדי לזהות את קיומו של HRP. התבססות על הוראות היצרן, השתמש בפולימר HRP, נוגדן נגד ארנבים. השתמש ברכז שולחן כדי לאפשר לנוגדן לשלב באופן מלא.
השתמש PBS כדי לחסל נוגדנים לא קומבננטיים. האם הכתמים הכימיים שלך על פי הוראות היצרן, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות מתחת למים. האם התייבשות לדגימות.
דגימות חליפות על ידי חתימה. והזן כדוגמה באמצעות ספריית Imaging Pro Plus Prepare בהתבסס על פרוטוקול היצרן. תרגלו את תבנית הפריימר, המורכבת מהרצפים הספציפיים לגנים ומרצפי הנוקלאוטידים של מתאם Illumina.
כדי להגביר את שיעורי הילודה עבור אזור V4 של חיידקים 16s על רצפי גנים rRNA, להגביר את התבנית מן קלט דגימת DNA באמצעות AMPLICON PCR. השתמש Mag-Bind RxNPure פלוס חרוזים מגנטיים כדי להסיר את תערובת התגובה ממוצר PCR. בצע הגברת PCR באינדקס בפעם השנייה.
השתמש ב- Agilent 2200 TapeStation כדי לבדוק את הספריה. השתמש במערכת dsDNA של QuantiFluor כדי לכמת את הספריה. עם מחזור 600, תא זרימה סטנדרטי v3 לייצר כ 100, 000 קצוות מזווגים.
2 כפול 300 בסיס 3. הספריות מסונפות, מ ומאוחסות ברצף. התעריפים הגולמיים של כל מדגם מסוננות על בסיס איכות רצף על ידי Trimmomatic.
יש להסיר את רצפי הפריימר והמתאם. יש לקצר את קריאות הרצף עם זוג ואיכויות הנמוכות מ- 25. ניתח את rRNA 16s על ידי חבילת התוכנה QIIME.
לאסוף רצפים כדי ליצור OTUs עם ניתוק דמיון ב 97%עבור OTUs, השפע היחסי צריך להיות מחושב בכל מדגם. השתמש מסווג בייסיאנית, אשר נמצא בהכשרת RDP להגדיר כדי למיין את כל הרצפים. עם OTU נתון, סיווג אשר יש את העקביות העיקרית של הרצפים מוקצה OTUs.
OTUs מיושרים למסד הנתונים סילבה, התבססות על מידע קבוצה לדוגמה. בצע גיוון אלפא וניתוח הקואורדינטות הראשי המבוסס על UniFrac. כדי לחזות את המצגת הנוגעת למאפייני החיידקים השתמש ב- BugBase.
לחזות את ההרכב הפונקציונלי של metagenome ב PICRUSt. עם השימוש בנתוני ניטור ובמסד נתונים המכיל גנומי ייחוס, נתח את הפונקציות השונות בקרב כל קבוצה בעזרת תוכנת STAMP. השתמש בתוכנת סטטיסטיקה אחת כדי לחשב את התוצאה.
יש להגדיר את האינדיקציה למשמעות סטטיסטית כ- p פחות מ- 0.05. חשב גורמים מבלבלים, הכוללים גיל ושוויון, לפי מבחן t של סטודנט. חשב מצב גיל המעבר, היסטוריה של יתר לחץ דם וסוכרת על ידי מבחן צ'י-ריבוע.
לחשב את מספר חיידקי השחלות מסה על ידי מבחן מאן-ויטני U. 16 חולים נרשמו למחקר זה. BugBase שימש לתרגול ניתוח של metagenomes חזוי.
פוטנציאל פתוגנטי ואימונוהיסטוכימיה של השחלות באמצעות נוגדן LPS אנטי בקטריאלי. נתון זה מראה עושר חיידקי וגיוון בקבוצות הסרטן והבקרה. נחשף על-ידי רצף rRNA של 16S.
הנתונים הם מדד מינים נצפה. מדד Chao1, מדד ACE, מדד שאנון, מדד שוויון, מדד סימפסון, בהתאמה. השפע היחסי של פילה ו -12 המינים החיידקיים הנפוצים ביותר בדגימות השחלות מוצג באיור זה.
איור א', ב', ג' ו-ד' פירושו השפע היחסי של הפאנל בשחלות של החולים בקבוצת הביקורת וקבוצת סרטן השחלות. השפע היחסי של שנים עשר מיני החיידקים הנפוצים ביותר בשחלות של חולי הבקרה וקבוצת סרטן השחלות. זה נפוץ, מקובצים באמצעות PCoA ואת השפע היחסי של Anoxynatronum סיביריקום ומתנוזרצ'ינה vacuolata.
איור א' מציג את הנפוצים ביותר, שהיו מקובצים באשכולות באמצעות PCoA. PC1 ו- PC2 מותווים על x ועל ציר ה- y. הבלוק האדום שווה לדגימה בקבוצת סרטן השחלות.
העיגול הכחול שווה לדוגמה בקבוצת הביקורת. ניתן להפריד את הדגימות מקבוצת סרטן השחלות מדגימות אחרות בקבוצת הביקורת. איור ב' מציג את הנפוצים ביותר שהיו מקובצים באשכולות באמצעות PCoA.
PC1 ו- PC2 מותווים על ציר x ו- y. הבלוק האדום שווה לדגימה בקבוצת סרטן השחלות. העיגול הכחול המוצק שווה לדגימה מהמטופל עם מיומה ברחם.
והעיגול החלול הכחול שווה לדגימה של מטופל עם אדנומיוזיס ברחם. איור C מראה את השפע היחסי של סיביריקום Anoxynatronum. איור ד' הוא מתנוזרצ'ינה וקולטה.
נתון זה הוא ניתוח BugBase של מטגנומיקה חזויה. הפנוטיפ הפתוגנטי והחמצוני של השחלות בקבוצת הסרטן היו חזקים יותר מזה של קבוצת הביקורת. נתון זה שונה באופן משמעותי מרחב נתיב KEGG בין הסרטן וקבוצות בקרה על ידי ניתוח PICRUSt.
כאשר אנו מקבלים את הדגימות שלנו, יש צורך בזוג פינצטה סטרילית חדשה. שימו לב לזיהום פוטנציאלי בדגימות. רקמות גידול חיידקים מחוץ לאתר עשויות להשפיע מאוד על הנחישות.
הגדרת קבוצת ביקורת לכל שלב מועדפת. על מנת להפחית את ההשפעה של זיהום פוטנציאלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה נועד לגלות ולהבחין בחיידקים ברקמות שחלתיות סרטניות ושאינן סרטניות in situ. צביעת אימונוהיסטוכימיה ורצף 16S rRNA משמשים לחיזוי ההבדלים ההרכביים והפונקציונליים של החיידקים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- אונקולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- הבנת ההרכב החיידקי ברקמות השחלה יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה של סרטן.
- צביעת אימונוהיסטוכימיה מאפשרת הדמיה של חיידקים בדגימות רקמות.
- רצף 16S rRNA הוא כלי רב עוצמה לזיהוי מיני חיידקים.
- כלי חיזוי כמו BugBase ו-PICRUSt יכולים להסיק פונקציות חיידקים על סמך המידע הגנטי שלהם.
מטרת המחקר
- להפיק ולזהות חיידקים מרקמות השחלה.
- להשוות בין אוכלוסיות חיידקים ברקמות סרטניות לעומת שאינן סרטניות.
- להעריך את התפקידים הפונקציונליים של החיידקים שזוהו.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- צביעת אימונוהיסטוכימיה להדמיה של רקמות.
- רצף גן 16S rRNA לזיהוי חיידקים.
- BugBase להעריך את ההרכב החיידקי.
- PICRUSt להעריך את ההבדלים הפונקציונליים בין חיידקים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי אוכלוסיות חיידקים שונות ברקמות שחלתיות סרטניות ושאינן סרטניות.
- חיזוי פונקציונלי מצביע על הבדלים ביכולות מטבוליות בין שני סוגי הרקמות.
- הפרוטוקול ניתן להתאמה לשימוש עם סוגים שונים של גידולים.
מסקנות
- מחקר זה מספק מסגרת להבנת התפקיד של חיידקים בסרטן השחלה.
- השיטות נגישות וניתן ליישמן ברוב המעבדות.
- מחקר נוסף עשוי לחקור את ההשלכות של קהילות חיידקים אלו על התקדמות הסרטן.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding microbial presence in ovarian tissues addresses a growing need to de-risk cancer target hypotheses by revealing microenvironmental factors that may influence tumor biology. This protocol enables biopharma R&D to assess bacterial contributions to oncogenic pathways, supporting mechanistic insight in early discovery. By providing a standardized method to detect and functionally predict tissue-associated microbes, it aids in prioritizing targets with stronger translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor microenvironment hypotheses by identifying bacteria differentially abundant in cancerous versus non-cancerous ovarian tissues.
- Operational Value: Uses immunohistochemistry and 16S rRNA sequencing to spatially resolve and quantify bacterial presence in situ.
- Predictive Value: Employs BugBase and PICRUSt to infer functional phenotypes, such as pathogenicity and oxidative stress tolerance, linked to cancer phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable 16S rRNA sequencing outputs suitable for comparative microbial profiling across sample groups.
- Reproducibility: Incorporates contamination controls and sterile tissue handling to ensure reliable detection of true tissue-associated signals.
- Scalability: Compatible with high-throughput sequencing and bioinformatics pipelines for broader application across tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects microbial signatures in human ovarian cancer tissues, supporting relevance to human pathophysiology.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of microbial shifts from normal to malignant states, informing biomarker discovery.
- Mechanistic De-risking: Predicts functional microbial contributions (e.g., metabolic pathways) that may modulate tumor progression or therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to preclinical validation, particularly in immuno-oncology and microenvironment-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether specific bacteria are enriched in tumor tissues and associated with cancer phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbial profiling data that can be integrated with multi-omics datasets for target prioritization.
- Analytics: Provides functional predictions via BugBase and PICRUSt, enabling comparison of metabolic and phenotypic potentials between groups.
- Translational Research: Connects microbial detection to cancer biology through differential abundance and functional inference in patient-derived tissues.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other solid tumors, allowing cross-cancer microbiome studies using a standardized workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking microbial presence to functional phenotypes in cancer-relevant pathways.
- Operational Value: Employs accessible techniques (IHC, 16S sequencing, bioinformatics) feasible in most research laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying microbial confounders or modulators of tumor biology early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target selection by accounting for microenvironmental variables that may affect drug efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, molecular biology, and bioinformatics for sequencing and functional prediction.
- Necessitates sterile tissue handling, PCR equipment, sequencing platforms, and tools like QIIME, Trimmomatic, and STAMP.
- Demands standardized protocols across sites to minimize contamination and ensure comparability of microbial data.
- Must account for host tissue variability and low biomass challenges when applying to other organ systems.
- Limited by detection sensitivity in low-abundance communities and dependence on reference databases for functional inference.
