זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי
20 באוקטובר 2020
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.
הפרוטוקול שלנו חוקר זיהום פטרייתי הן מנקודת המבט של המארח והן מנקודת המבט של הפתוגן כדי לזהות אינטראקציות בין המערכות הביולוגיות שהן קריטיות למחלה. אנו יכולים לזהות גם חלבונים פטרייתיים וגם חלבונים מארחים בניסוי יחיד ולזהות חלבונים פטרייתיים המיוצרים רק במהלך זיהום, המייצגים חלבונים חדשים הקשורים לזיהום. למרות שאנו מתמקדים בטיפול בזיהומים פטרייתיים על ידי חשיפת אסטרטגיות אנטי-וירוסיות חדשות לטיפול, צינור הפרוטאומיקה והביואינפורמטיקה שלנו הוא אוניברסלי וניתן ליישם אותו במערכות ביולוגיות רבות.
הגישה שלנו מניחה את היסודות למחקרים על פתוגנים שונים ותגובות חיסוניות רבות וניתן להשתמש בה כדי לספק תובנות חדשות לגבי הקשר בין קריפטוקוקוס למערכת החיסון המולדת. תגובת המקרופאגים לפתוגנים וזיהוי מספיק חלבונים פטרייתיים חשובים. לכן מומלץ לבדוק ולבצע אופטימיזציה של MOIs ונקודות זמן עבור כל מין.
מכיוון שמקרופאגים ותרביות תאים פטרייתיים יכולים להיות מאתגרים, חשוב לדעת למה לצפות לאחר קוקולטורה. הדמיה מספקת לחוקר ביטחון ביישום ההליך. כדי להכין תאי פטרייה לזיהום במקרופאגים, יש לאסוף ולצנטריפוגה תאי C neoformans מתרבית שלב ארוך בינוני, ולאחר מכן שלוש שטיפות עדינות עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר באותם תנאי צנטריפוגה.
לאחר השטיפה האחרונה, השעו מחדש את תאי הפטרייה ב-1.2 פעמים 10 עד שמונה תאים למיליליטר של תרבית תאים חופשיים אנטיביוטיים, ריכוז בינוני והוסיפו מיליליטר אחד של תרחיף תאים פטרייתיים לכל אחת מארבע בארות של צלחת תרבית מקרופאגים משולבת של 70% עד 80%. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך שלוש שעות. הטה בזהירות את הצלחת כדי לאפשר שטיפה עדינה של כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר PBS אחד לכל באר בכל כביסה.
כדי למדוד את מיומנות הזיהום לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מיליליטר אחד של מדיום נטול אנטיביוטיקה לכל באר של צלחת שש הבארות, והנח את הצלחת בחממת תרבית התאים. בנקודות הזמן המתאימות, אספו את הסופרנטנט מכל באר ומדדו את כמות ה-LDH בכל באר על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. במקביל, יש ליז את תאי המקרופאגים הלא נגועים כדי לקבוע את הערך לציטוטוקסיות מקסימלית.
לאחר מכן ניתן לחשב את הציטוטוקסיות באמצעות הנוסחה כפי שמצוין. לאיסוף מקרופאגים לא נגועים ותרבית משותפת, הוסף מיליליטר אחד של PBS קר לכל באר של מקרופאגים לא נגועים. לאחר דקה אחת, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים מתחתית הבארות ולאגד את מתלי התאים לצינור יחיד של 15 מיליליטר.
אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והסר לחלוטין את הסופרנטנט כדי לאפשר הקפאת בזק מיידית של הגלולה בחנקן נוזלי לאחסון של מינוס 80 מעלות. ניתוח המרכיבים העיקריים של התהליך למערכי נתונים מגלה כי כצפוי, מרכיב ההפרדה הגדול ביותר בין הנתונים הוא דגימות נגועות לעומת דגימות לא נגועות. המאפיין הבולט השני של הדגימות הוא השונות הביולוגית שלהן.
שילוב מתאם פירסון עם אשכולות היררכיים לפי מרחק אוקלידי מראה אשכול מובהק של דגימות נגועות לעומת דגימות לא נגועות עם יכולת שחזור שכפול הנעה בין 95% ל-96%ניתן לבצע מבחן סטודנטים מתוקן לבדיקת השערות מרובות באמצעות שיעור גילוי שווא של בנג'מיני-הוכברג כדי לזהות חלבונים עם הבדלים משמעותיים בשפע במהלך ההדבקה בהשוואה לבקרות לא נגועות. בניתוח זה זוהו 117 חלבונים מארחים המדגימים שינוי משמעותי בביטוי בעת ההדבקה. יש לציין כי נצפו גם עליות משמעותיות בשפע החלבונים הפטרייתיים, כצפוי במהלך ההדבקה.
חשוב לטפל במקרופאגים בעדינות במהלך קוקולטורציה, כביסה ואיסוף דגימות. על ידי הגדרת האופן שבו הפתוגן מסתגל למארח וכיצד המארח מגן על עצמו מפני זיהום, נרכשות תובנות חדשות בתחומי המיקרוביולוגיה והאימונולוגיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה בוחן את האינטראקציה בין המאכסן לפתוגן במהלך זיהום פטרייתי באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות. הוא מאפשר גילוי של חלבונים הן של המאכסן והן של הפתוגן בניסוי בודד, ובכך מספק תובנות לגבי חלבונים הקשורים לזיהום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- מחלות זיהומיות
- פרוטאומיקה
רקע
- הבנת האינטראקציות בין המארח לפתוגן היא קריטית למחקר מחלות.
- זיהומים פטרייתיים מהווים סיכונים בריאותיים משמעותיים, המצריכים אסטרטגיות טיפול חדשניות.
- פרוטאומיקה יכולה לחשוף שינויים בשפע החלבונים במהלך זיהום.
- מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית לפתוגנים.
מטרת המחקר
- לאפיין את האינטראקציות בין מקרופגים של המארח לבין הפתוגן Cryptococcus neoformans.
- לזהות חלבונים חדשים הקשורים לזיהום המיוצרים במהלך זיהום פטרייתי.
- לבסס תשתית (pipeline) אוניברסלית של פרוטאומיקה וביואינפורמטיקה שניתן ליישם על מערכות ביולוגיות שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי חלבונים.
- כימות ללא סימון (Label-free quantification) למדידת שינויים בשפע החלבונים.
- אופטימיזציה של ריבוי הזיהום (MOI) ושל נקודות הזמן לקבלת תוצאות מדויקות.
- ניתוח ביו-אינפורמטיקה לפירוש נתוני הפרוטאומיקה.
תוצאים עיקריים
- זיהוי חלבוני פטרייה המיוצרים באופן ספציפי במהלך זיהום.
- תובנות לגבי תגובת המקרופגים ל-Cryptococcus neoformans.
- ביסוס מסגרת למחקר של פתוגנים ותגובות חיסוניות שונות.
- הדגמת התאימות של הפרוטוקול למערכות ביולוגיות שונות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה מקיפה לחקר אינטראקציות בין מאח ופתוגן.
- הוא מניח את היסודות למחקרים עתידיים על זיהומים פטרייתיים ותגובות חיסוניות.
- מומלץ לבצע אופטימיזציה נוספת של תנאי הניסוי עבור מינים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זרימת העבודה של פרוטאומיקה כמותית ללא סימון (label-free) זו מאפשרת מיפוי סימולטני של הפרוטאומיות של המארח והפתוגן במהלך זיהום, ובכך מספקת נתונים לא מוטים על שפע חלבונים, שהם קריטיים לתיקוף מטרות במחקר של מחלות זיהומיות. באמצעות זיהוי חלבונים פטרייתיים הקשורים לזיהום וחתימות של תגובת המארח, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של אסטרטגיות אנטי-וירולנטיות ומסייעת בבחירת מטרות בשלב הפרה-קליני. היכולת להעביר את השיטה למערכות מארח-פתוגן שונות מגבירה את היישומיות שלה על פני פורטפוליו של תוכניות לגילוי תרופות אנטי-פטרייתיות ואימונו-מודולטוריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי חלבונים של פתוגנים המיוצרים באופן בלעדי במהלך זיהום, המהווים מטרות חדשות הקשורות לאלימות (virulence).
- ערך מדעי: מבהיר מסלולי אינטראקציה בין המאכסן לפתוגן באמצעות שינויים מתואמים בשכיחות בשני הפרוטאומיים, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות.
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת פרופילים פרוטאומיים כמותיים וניתנים לשחזור של מצבי זיהום, לצורך הפחתת סיכונים בהיפותזות לגבי מטרות טיפוליות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך תפעולי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף (מקרופאגים מזוהמים) לפיתוח בדיקות המשך עם תנאי הדבקה סטנדרטיים ואופטימיזציה של MOI.
- ערך תפעולי: יצירת תוצרי פרוטאומיקה כמותיים וללא סימון, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולהערכת הדירות במסעי סריקה.
- ערך תפעולי: תמיכה בשימוש חוזר וניתן להרחבה בפלטפורמה עבור פתוגנים מגוונים, הודות לתכנון אוניברסלי של צינור העיבוד הפרוטאומי והביואינפורמטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: זיהוי חלבוני מאכס רלוונטיים למחלה המגיבים לפלישה מיקרוביאלית, המאפשר התאמה של סממנים ביולוגיים לצורך תיקוף פרה-קליני.
- ערך תרגומי: הבטחת רציפות משלב הגילוי ועד לעבודה פרה-קלינית על ידי קישור שינויים פרוטאומיים במצב של זיהום למנגנונים פתוגניים.
- ערך תרגומי: סיוע בקבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים, באמצעות הדגשת חלבונים החיוניים לאלימות (virulence) ולמנגנוני הגנה של המאכס.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
תהליך העבודה משתלב בשלבי הגילוי המוקדמים של הביולוגיה באמצעות פרופיל של אינטראקציות בין מאחס לפתוגן, תומך במוכנות לסריקה באמצעות מודלים סטנדרטיים של זיהום, ומאפשר מחקר תרגומי על ידי קישור שינויים פרוטאומיים למנגנוני ארגוניות (virulence) ותגובה חיסונית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי כימות שינויים המושרים על ידי זיהום הן בפרוטאום של הפתוגן והן בפרוטאום של המארח.
- סריקה: מספקת מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם MOI ונקודות זמן אופטימליות, מה שמבטיח מודלי זיהום הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות ללא תיוג ופלט סטטיסטי (למשל, מבחני t עם תיקון Benjamini-Hochberg) להשוואת תנאים וזיהוי חלבונים שהשתנו באופן מובהק.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין חתימות פרוטאומיות למכניזמים פתוגניים ותגובות הגנה של המארח, ובכך תומכת בגילוי סממנים ביולוגיים ובהמשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תשתית (pipeline) לביו-אינפורמטיקה ופרוטאומיקה שניתנת לשימוש חוזר ותואמת פתוגנים ומערכות חיסון מרובות, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות באמצעות פרופיל פרוטאומי כמותי ולא מוטה של מצבי זיהום.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולים אופטימליים של תרבית משותפת (coculture), שטיפה וליזיס עם מדדי בקרת איכות (QC) מתוקפים (PCA, clustering, שחזוריות של 95-96% בין חזרות).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי חשיפת גורמי virulent קריטיים ורשתות תגובה של המארח, ובכך מפחית סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים של תוכניות לפיתוח תרופות אנטי-פטרייתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על ביטוי חלבונים ספציפי לזיהום ומעורבות של מסלולים ביולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים של יונקים ופטריות, בהכנת דגימות לפרוטאומיקה ובניתוח נתונים של ספקטרומטריית מסות.
- תלוי בגישה למכשור LC-MS/MS, בתוכנה לכמתים ללא סימון (label-free quantification) ובכלי ביואינפורמטיקה לביצוע PCA, קיבץ (clustering) וניתוח ביטוי דיפרנציאלי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרמטרי ההדבקה (MOI, נקודות זמן) ושל הטיפול בדגימות כדי להבטיח הדירות בין מחקרים.
- כולל שיקולי התאמה עבור מערכות פתוגן-מארח שונות, כולל אופטימיזציה של הכנת תאי פטרייה ושל צפיפות (confluency) המקרופאגים.
- מגבלות מעשיות כוללות את האתגר הטכני של גילוי חלבונים פטרייתיים בריכוז נמוך על רקע אותות גבוהים של המארח, דבר הדורש עומק הדבקה ורגישות מספיקים.
