זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

הפרוטוקול שלנו חוקר זיהום פטרייתי הן מנקודת המבט של המארח והן מנקודת המבט של הפתוגן כדי לזהות אינטראקציות בין המערכות הביולוגיות שהן קריטיות למחלה. אנו יכולים לזהות גם חלבונים פטרייתיים וגם חלבונים מארחים בניסוי יחיד ולזהות חלבונים פטרייתיים המיוצרים רק במהלך זיהום, המייצגים חלבונים חדשים הקשורים לזיהום. למרות שאנו מתמקדים בטיפול בזיהומים פטרייתיים על ידי חשיפת אסטרטגיות אנטי-וירוסיות חדשות לטיפול, צינור הפרוטאומיקה והביואינפורמטיקה שלנו הוא אוניברסלי וניתן ליישם אותו במערכות ביולוגיות רבות.

הגישה שלנו מניחה את היסודות למחקרים על פתוגנים שונים ותגובות חיסוניות רבות וניתן להשתמש בה כדי לספק תובנות חדשות לגבי הקשר בין קריפטוקוקוס למערכת החיסון המולדת. תגובת המקרופאגים לפתוגנים וזיהוי מספיק חלבונים פטרייתיים חשובים. לכן מומלץ לבדוק ולבצע אופטימיזציה של MOIs ונקודות זמן עבור כל מין.

מכיוון שמקרופאגים ותרביות תאים פטרייתיים יכולים להיות מאתגרים, חשוב לדעת למה לצפות לאחר קוקולטורה. הדמיה מספקת לחוקר ביטחון ביישום ההליך. כדי להכין תאי פטרייה לזיהום במקרופאגים, יש לאסוף ולצנטריפוגה תאי C neoformans מתרבית שלב ארוך בינוני, ולאחר מכן שלוש שטיפות עדינות עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר באותם תנאי צנטריפוגה.

לאחר השטיפה האחרונה, השעו מחדש את תאי הפטרייה ב-1.2 פעמים 10 עד שמונה תאים למיליליטר של תרבית תאים חופשיים אנטיביוטיים, ריכוז בינוני והוסיפו מיליליטר אחד של תרחיף תאים פטרייתיים לכל אחת מארבע בארות של צלחת תרבית מקרופאגים משולבת של 70% עד 80%. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך שלוש שעות. הטה בזהירות את הצלחת כדי לאפשר שטיפה עדינה של כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר PBS אחד לכל באר בכל כביסה.

כדי למדוד את מיומנות הזיהום לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מיליליטר אחד של מדיום נטול אנטיביוטיקה לכל באר של צלחת שש הבארות, והנח את הצלחת בחממת תרבית התאים. בנקודות הזמן המתאימות, אספו את הסופרנטנט מכל באר ומדדו את כמות ה-LDH בכל באר על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. במקביל, יש ליז את תאי המקרופאגים הלא נגועים כדי לקבוע את הערך לציטוטוקסיות מקסימלית.

לאחר מכן ניתן לחשב את הציטוטוקסיות באמצעות הנוסחה כפי שמצוין. לאיסוף מקרופאגים לא נגועים ותרבית משותפת, הוסף מיליליטר אחד של PBS קר לכל באר של מקרופאגים לא נגועים. לאחר דקה אחת, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים מתחתית הבארות ולאגד את מתלי התאים לצינור יחיד של 15 מיליליטר.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והסר לחלוטין את הסופרנטנט כדי לאפשר הקפאת בזק מיידית של הגלולה בחנקן נוזלי לאחסון של מינוס 80 מעלות. ניתוח המרכיבים העיקריים של התהליך למערכי נתונים מגלה כי כצפוי, מרכיב ההפרדה הגדול ביותר בין הנתונים הוא דגימות נגועות לעומת דגימות לא נגועות. המאפיין הבולט השני של הדגימות הוא השונות הביולוגית שלהן.

שילוב מתאם פירסון עם אשכולות היררכיים לפי מרחק אוקלידי מראה אשכול מובהק של דגימות נגועות לעומת דגימות לא נגועות עם יכולת שחזור שכפול הנעה בין 95% ל-96%ניתן לבצע מבחן סטודנטים מתוקן לבדיקת השערות מרובות באמצעות שיעור גילוי שווא של בנג'מיני-הוכברג כדי לזהות חלבונים עם הבדלים משמעותיים בשפע במהלך ההדבקה בהשוואה לבקרות לא נגועות. בניתוח זה זוהו 117 חלבונים מארחים המדגימים שינוי משמעותי בביטוי בעת ההדבקה. יש לציין כי נצפו גם עליות משמעותיות בשפע החלבונים הפטרייתיים, כצפוי במהלך ההדבקה.

חשוב לטפל במקרופאגים בעדינות במהלך קוקולטורציה, כביסה ואיסוף דגימות. על ידי הגדרת האופן שבו הפתוגן מסתגל למארח וכיצד המארח מגן על עצמו מפני זיהום, נרכשות תובנות חדשות בתחומי המיקרוביולוגיה והאימונולוגיה.