זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי
October 20th, 2020
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.
הפרוטוקול שלנו חוקר זיהום פטרייתי הן מנקודת המבט של המארח והן מנקודת המבט של הפתוגן כדי לזהות אינטראקציות בין המערכות הביולוגיות שהן קריטיות למחלה. אנו יכולים לזהות גם חלבונים פטרייתיים וגם חלבונים מארחים בניסוי יחיד ולזהות חלבונים פטרייתיים המיוצרים רק במהלך זיהום, המייצגים חלבונים חדשים הקשורים לזיהום. למרות שאנו מתמקדים בטיפול בזיהומים פטרייתיים על ידי חשיפת אסטרטגיות אנטי-וירוסיות חדשות לטיפול, צינור הפרוטאומיקה והביואינפורמטיקה שלנו הוא אוניברסלי וניתן ליישם אותו במערכות ביולוגיות רבות.
הגישה שלנו מניחה את היסודות למחקרים על פתוגנים שונים ותגובות חיסוניות רבות וניתן להשתמש בה כדי לספק תובנות חדשות לגבי הקשר בין קריפטוקוקוס למערכת החיסון המולדת. תגובת המקרופאגים לפתוגנים וזיהוי מספיק חלבונים פטרייתיים חשובים. לכן מומלץ לבדוק ולבצע אופטימיזציה של MOIs ונקודות זמן עבור כל מין.
מכיוון שמקרופאגים ותרביות תאים פטרייתיים יכולים להיות מאתגרים, חשוב לדעת למה לצפות לאחר קוקולטורה. הדמיה מספקת לחוקר ביטחון ביישום ההליך. כדי להכין תאי פטרייה לזיהום במקרופאגים, יש לאסוף ולצנטריפוגה תאי C neoformans מתרבית שלב ארוך בינוני, ולאחר מכן שלוש שטיפות עדינות עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר באותם תנאי צנטריפוגה.
לאחר השטיפה האחרונה, השעו מחדש את תאי הפטרייה ב-1.2 פעמים 10 עד שמונה תאים למיליליטר של תרבית תאים חופשיים אנטיביוטיים, ריכוז בינוני והוסיפו מיליליטר אחד של תרחיף תאים פטרייתיים לכל אחת מארבע בארות של צלחת תרבית מקרופאגים משולבת של 70% עד 80%. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך שלוש שעות. הטה בזהירות את הצלחת כדי לאפשר שטיפה עדינה של כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר PBS אחד לכל באר בכל כביסה.
כדי למדוד את מיומנות הזיהום לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מיליליטר אחד של מדיום נטול אנטיביוטיקה לכל באר של צלחת שש הבארות, והנח את הצלחת בחממת תרבית התאים. בנקודות הזמן המתאימות, אספו את הסופרנטנט מכל באר ומדדו את כמות ה-LDH בכל באר על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. במקביל, יש ליז את תאי המקרופאגים הלא נגועים כדי לקבוע את הערך לציטוטוקסיות מקסימלית.
לאחר מכן ניתן לחשב את הציטוטוקסיות באמצעות הנוסחה כפי שמצוין. לאיסוף מקרופאגים לא נגועים ותרבית משותפת, הוסף מיליליטר אחד של PBS קר לכל באר של מקרופאגים לא נגועים. לאחר דקה אחת, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים מתחתית הבארות ולאגד את מתלי התאים לצינור יחיד של 15 מיליליטר.
אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והסר לחלוטין את הסופרנטנט כדי לאפשר הקפאת בזק מיידית של הגלולה בחנקן נוזלי לאחסון של מינוס 80 מעלות. ניתוח המרכיבים העיקריים של התהליך למערכי נתונים מגלה כי כצפוי, מרכיב ההפרדה הגדול ביותר בין הנתונים הוא דגימות נגועות לעומת דגימות לא נגועות. המאפיין הבולט השני של הדגימות הוא השונות הביולוגית שלהן.
שילוב מתאם פירסון עם אשכולות היררכיים לפי מרחק אוקלידי מראה אשכול מובהק של דגימות נגועות לעומת דגימות לא נגועות עם יכולת שחזור שכפול הנעה בין 95% ל-96%ניתן לבצע מבחן סטודנטים מתוקן לבדיקת השערות מרובות באמצעות שיעור גילוי שווא של בנג'מיני-הוכברג כדי לזהות חלבונים עם הבדלים משמעותיים בשפע במהלך ההדבקה בהשוואה לבקרות לא נגועות. בניתוח זה זוהו 117 חלבונים מארחים המדגימים שינוי משמעותי בביטוי בעת ההדבקה. יש לציין כי נצפו גם עליות משמעותיות בשפע החלבונים הפטרייתיים, כצפוי במהלך ההדבקה.
חשוב לטפל במקרופאגים בעדינות במהלך קוקולטורציה, כביסה ואיסוף דגימות. על ידי הגדרת האופן שבו הפתוגן מסתגל למארח וכיצד המארח מגן על עצמו מפני זיהום, נרכשות תובנות חדשות בתחומי המיקרוביולוגיה והאימונולוגיה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה חוקר את האינטראקציה בין המארח לפתוגן במהלך זיהום פטרייתי באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה. הוא מאפשר זיהוי של חלבונים של המארח והפתוגן בניסוי יחיד, ומספק תובנות לגבי חלבונים הקשורים לזיהום.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחלות זיהומיות
- פרוטאומיקה
רקע
- הבנת האינטראקציות בין המארח לפתוגן חיונית למחקר מחלות.
- זיהומים פטרייתיים מהווים סיכונים בריאותיים משמעותיים, ומחייבים אסטרטגיות טיפול חדשות.
- פרוטאומיקה יכולה לחשוף שינויים בשפע החלבונים במהלך זיהום.
- מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובת החיסון לפתוגנים.
מטרת המחקר
- לתאר את האינטראקציות בין מקרופאגים של המארח לפתוגן Cryptococcus neoformans.
- לזהות חלבונים חדשים הקשורים לזיהום המיוצרים במהלך זיהום פטרייתי.
- לבסס צינור פרוטאומיקה וביואינפורמטיקה אוניברסלי החל על מערכות ביולוגיות שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה לזיהוי חלבונים.
- כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבונים.
- אופטימיזציה של מכפליות הזיהום (MOI) ונקודות זמן לתוצאות מדויקות.
- ניתוח ביואינפורמטי מכדי לפרש נתונים פרוטאומיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי חלבונים פטרייתיים המיוצרים במיוחד במהלך זיהום.
- תובנות לגבי התגובה של המקרופאגים ל-Cryptococcus neoformans.
- ביסוס מסגרת לחקר פתוגנים שונים ותגובות חיסוניות.
- הוכחת יישומיות הפרוטוקול על מערכות ביולוגיות שונות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה מקיפה לחקר האינטראקציות בין המארח לפתוגן.
- הוא מניח את היסודות למחקר עתידי על זיהומים פטרייתיים ותגובות חיסוניות.
- מומלץ לבצע אופטימיזציה נוספת של תנאי הניסוי עבור מינים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
