Name: מיקרו-גיגיטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: למד פרוטוקול מיקרו-הזרקת ביצים לעריכת גנום ב-Thermobia domestica. שיטה זו מאפשרת יצירת זנים מוטנטיים ומחקר מנגנוני אבולוציה בחרקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TO ו- TD נתמכו על ידי JSPS KAKENHI מענק מספרים 19H02970 ו 20H02999, בהתאמה.

1. תחזוקת מושבות מעבדה
<ol><li>לשמירה על אוכלוסיות של דגים מלאכותיים ומוטנטים, השתמשו במיכל פלסטיק גדול (460 מ"מ x 360 מ"מ x 170 מ"מ) עם מזון דגים מלאכותי רגיל, מים ב כוסות פלסטיק עם חור אוורור בחלקו העליון, נייר מקופל להסתרת החרקים וכותנה שכבתית להטלת ביצים (איור 2A). שמור את כל תרבויות T. domestica בתוך 37 °C (70 °F) חממות ולהגדיר את הלחות היחסית (RH) בתוך כל מיכל ל 60%-80%. הערה: מכיוון ש- T. domestica סופג אדי מים מהאטמוספירה11, אין צורך באספקת מים ישירה. RH המתאים נשמר בשל נוכחות של אדי מים מכוסות פלסטיק המכיל חור אוורור בחלק העליון או כוסות lidless בתוך כל מיכל. אין צורך לחות בתוך אינקובטור שלם המכיל תרבויות. משך הזמן המשוער של כל שלב התפתחותי בתנאי המתואר בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. המהירות ההתפתחותית יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי הטמפרטורה ו / או RH12.</li>
	<li>מוסיפים אוכל מעת לעת. מוסיפים מים לפני שהם מתייבשים.</li>
	<li>להעביר את האוכלוסיות למיכל נקי חדש לפחות כל 3 חודשים בהתחשב בכך שמבוגרים מפסיקים להטיל ביצים בסביבה מלוכלכת ו / או אוכלוסייה צפופה (ראה דיון).</li>
</ol>2. איסוף ביצים ומיקרו-יין
<ol><li>עיצוב RNA מדריך (gRNA)<ol>
<li>תכנן רצף gRNA עבור כל מטרה נדרשת ופוצץ את רצפי gRNA נגד הרכבת הגנום כדי לבדוק אתרי זיהוי אפשריים מחוץ ליעד.</li>
		<li>לסנתז ולטהר את gRNAs על פי הוראות היצרן8. הערה: כדוגמה, במקרה של מיקוד הגן הלבן טרנספורטר קלטת מחייב ATP, רצף יעד 20 bp תוכנן ושני אוליגונוקלאוטידים DNA מסונתז 5 '-TAATACGACTCACTACTTAGTAGTGTGGGAC-3' ו 5'-TTCTAGCTCTAAAAכתא-3' הוזמנו. תבנית הדנ"א הוכנה על ידי חישול שני אוליגונוקלאוטידים אלה ואחריו הגברה PCR ואת gRNA הוא אז במבחנה מתמלל מן התבנית עם פולימראז T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מושבות איסוף ביצים<ol>
<li>העבירו כ-20 גברים ו-20 נשים מבוגרים למיכל בגודל בינוני (200 מ"מ x 150 מ"מ x 90 מ"מ) עם מזון, אספקת מים, נייר מקופל וחתיכת כותנה שכבתית קטנה להנחת ביצים (איור 2B).</li>
		<li>להקים מספר מושבות כדי לקבל מספר גדול של עוברים מבוימים בפרק זמן קצר כדי לשמש לעריכת גנום. הערה: כ-20-40 ביצים צפויות להיאסף ממושבה לאחר 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בדרך כלל לוקח כמה ימים למבוגרים שהועברו להתחיל להטיל ביצים, אולי בגלל הסתגלות לסביבה חדשה.</li>
	</ol></li>
	<li>ביום ההזרקה, להחליף את הכותנה בתוך המיכלים עם חדשים.</li>
	<li>הנח סרט דו-צדדי בגודל 76 מ"מ x 5 מ"מ על שקופית זכוכית רגילה של 76 מ"מ x 26 מ"מ.</li>
	<li>שמונה שעות לאחר מכן, לאסוף את הביצים מן הכותנה שכבתית על ידי הפרדת השכבות באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>מיישרים את הביצים על הסרט הדו-צדדי באמצעות מברשת צבע רטובה ושומרים על מרחק של 2 מ"מ בין הביצים. יש לכוון את כל הביצים כך שציר הביצה האורך יפונה לצד ההזרקה(איור 3A). לחץ בעדינות על הביצים עם מברשת צבע להחזקה מוצקה במהלך ההזרקה. הערה: בפרוטוקול זה, הפטרייה גדלה במהירות בביצים מוזרקות פגומות במצב רטוב וחם. חשוב לשמור על המרחק בין הביצים כדי למנוע זיהום צולב והתרחבות הפטרייה.</li>
	<li>מערבבים את חלבון gRNA ו- Cas9 לריכוז סופי של 100 ננוגרם/μL ו- 500 ng/μL, בהתאמה. השתמש במים מזוקקים לדילול. דגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקדם היווצרות מורכבת ריבונוקלאופרוטאין ולאחר מכן לשמור את התערובת על הקרח. הערה: אדום ניטרלי בריכוז סופי של 1% ניתן להוסיף לפתרון ההזרקה כדי לפקח על הכמות מוזרקת.</li>
	<li>טען 2 μL של פתרון gRNA / Cas9 נימי הזרקת זכוכית עם microloader. ודא שאין בועות אוויר בתמיסה לפני ההזרקה. במידת הצורך, הקש על המחט כדי להסיר את הבועות. הערה: בניסוי זה, מחט מוכנה משמשת לקבלת קצה מחט עדין (איור 3B). מחט תוצרת בית עם צורה דומה יכול לשמש במקום.</li>
	<li>לתקן את נימי הזרקת זכוכית, טעון בעבר עם הפתרון gRNA / Cas9, למחזיק מצויד מניפולטור ולחבר את המחזיק microinjector אלקטרונית.</li>
	<li>מטב את צורת קצה המחט על ידי שבירתו מעט במלקחיים כדי למנוע סתימה ועמידות טובה יותר לאורך סדרה של זריקות (דוגמה למחט מתאימה מוצגת באיור 3C). הערה: מומלץ להחליף מחט כאשר היא סתומה. אפשר להמשיך להזריק עם אותה מחט אם הוא שבור שוב עם מלקחיים, אבל טיפ רחב יותר מוביל יותר נזק לביצה ומוריד את שיעור ההישרדות שלהם. כמו T. ביצים מקומיות הם רכים ושבירים, שמירה על קצה מחט בסדר הוא המפתח שיש שיעור הישרדות גבוה לאחר הזרקה.</li>
	<li>הכנס את המחט לנקודת האמצע של ציר האורך של ביצה והזרק כמות קלה של הפתרון (ראה איור 3D-H לעיון בכמות ההזרקה). להתאים את התצורה של microinjector אלקטרונית במהלך ההזרקה, בהתאם לצורת קצה המחט. הערה: מומלץ להפעיל לחץ מתמיד במהלך ההזרקה, אחרת תכולת ביצה דביקה יכולה בקלות לזרום לתוך מחט הזכוכית ועלולה לסתום אותו. הפתרון עשוי להיות גם להזריק עם דופק לחץ קצר או עם לחץ מתמיד, בהתאם לכמות הנוזל מוזרק. זכור שכאשר לקצה המחט יש פתח רחב, יותר מדי פתרון מוזרק לביצה, מה שגורם לקטלניות (איור 3F-H). במקרה זה, לשמור על זרימה נוזלית מתמדת על ידי לחץ מתמיד, ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך ביצה ולמשוך אותו מיד. אם זה גורם יותר מדי גלישה או פרצי הביצה, לשנות את המחט.</li>
	<li>שמור את הביצים המוזרקות במיכל עם הגודל המתאים למספר הביצים המוזרקות (<20 ביצים: צלחת קטנה; >20 ביצים: מיכל בגודל בינוני) עם 60%-80% RH ו 37 °C (67 °F).</li>
</ol>3. הזדווגות
<ol><li>בדקו את הביצים המוזרקות מעת לעת והשליכו ביצים פגומות במלקחיים כדי למנוע צמיחה פטרייתית(איור 3I,J). במקרה יותר מדי פטרייה גדל על ביצה, לנקות את פני השטח של הביצה עם 70% EtOH.</li>
	<li>לפני הבקיעה (כ 10 ימים ב 37 מעלות צלזיוס לאחר הטלת ביצה), לטבול את שקופית הזכוכית עם הביצים מוזרק לתוך אבקת טלק כדי לצפות את פני השטח של הסרט דו צדדי. זה ימנע את הערימה של נימפות בקעו. מעבירים את מגלשות הזכוכית מצופות האבקה למיכל בגודל בינוני עם מזון, מים ונייר מקופל להסתרת החרקים.</li>
	<li>הסר את מגלשות הזכוכית לאחר שהנימפות בקעו. מעת לעת לספק מזון עד שהם מגיעים לבגרות. הערה: לוקח בערך חודשיים וחצי עד שאנשים מגיעים לבגרות אחרי שהם בוקעים (איור 1A). הבמה הבוגרת נשפטת על סמך אוביפוסטור מפותח אצל נקבות (איור 1B).</li>
	<li>כדי להזדווג עם הפרטים, להעביר כמה שיותר מבוגרים נקבות בר הדרושים ממושבת מעבדה למיכל בגודל בינוני ולהדגיר אותם לפחות 14 ימים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לוודא שהם בתולים. הערה: אין צורך לאסוף נקבות בתולה ממושבת מעבדה כי למבוגרים T. domestica יש מחזור חוזר ונשנה של הזדווגות והזדווגות שנקרא "מחזור הרבייה וההזדווגות", שבמהלכו הנקבות זורקות זרע עם כל molt ומזדווגות שוב במחזור ההפריה הבא13.</li>
	<li>העבירו זכר או נקבה בוגר G0 שהתפתח מביצה מוזרקת ומבוגרים מסוג פראי לצלחת פלסטיק קטנה (100 מ"מ x 40 מ"מ) עם אוכל, נייר מקופל וחתיכת כותנה קטנה להטלת ביצי G1(איור 2C'; צלחת הזדווגות). שמור את מנות ההזדווגות במיכל גדול יותר עם 60%-80% RH(איור 2C). הערה: ניתן לכלול בצלחת מספר מבוגרים מסוג פראי כדי להגדיל את הסיכוי להזדווגות מוצלחת, אם כי שיעורי הצלחה גבוהים הושגו עם זיווג אחד לאחד.</li>
</ol>4. גנוטיפינג
<ol><li>עיצוב זוגות פריימר PCR עבור כל gRNA כדי להגביר מוצר 100-200 bp הכולל את האתר ממוקד על ידי gRNA. BLAST כל רצף פריימר מול מכלול הגנום כדי לבדוק את הספציפיות שלו (דוגמה מוצגת למיקוד הגן הלבן באיור 4A).</li>
	<li>בדוק את טרנספורמציית הנבט של מבוגרי G0.<ol>
<li>חמישה ימים לאחר הטלת הביצים, אוספים ביצי G1 בודדות מכל זוג בוגרים G0 לצינורות 0.2 מ"ל (ביצה אחת לכל צינור; חנות אספה דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך). להפריד את שכבות כותנה כדי לאסוף את הביצים. הערה: מומלץ לגנוטיפ לפחות 12 נימפות G1 מכל זוג הזדווגות כדי להעריך את ההצלחה של העברת הנבט (ראה תוצאות מייצגות).</li>
		<li>הוסף 15 μL של 0.25 מ"ג / מ"ל Proteinase K פתרון (מומס במאגר Tris-EDTA) לכל צינור, בקצרה הומוגניזציה דגימות עם קיסמים, ואת הדגירה ב 55 °C (70 °F) עבור 3 עד 16 שעות.</li>
		<li>להשבית את Proteinase K על ידי הצבת הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 90 μL של מים מזוקקים לכל צינור ומערבבים היטב. השתמש 2 μL של supernatant בתמהיל תגובת PCR μL 10 μL המכיל את פריימרים תוכנן בשלב 4.1. הערה: מומלץ להשתמש בפולימראז DNA המותאם לתבניות גולמיות כדי להגיע למספיק הגברה של PCR.</li>
		<li>כדי לנתח את מוצרי PCR, בצע בדיקת ניידות הטרודופלקס (HMA) עם מערכת אלקטרופורזה של שבב זעיר (איור 3B; ראה Ohde et al., 2018)8. הערה: מוטציות ניתן להעריך עם שתי שיטות חלופיות: (1) HMA עם פולימרים ג'ל סטנדרטי, כגון 8% polyacrylamide14; (2) עיכול של מוצרי PCR עם אנדונוקלאאז T7 ואחריו אלקטרופורזה ג'ל agarose15.</li>
		<li>שמור רק את נימפות G1 הנובעות מבוגרים G0 המכילים מוטציות בנבט שלהם להשליך את האחרים.</li>
	</ol></li>
	<li>גנוטיפינג אישי של נימפות G1 / מבוגרים<ol>
<li>בודדו את נימפות G1 ללוחות של 24 בארות עם שאיפה או מברשת צבע. הנח את לוחות 24 הבאר במיכל גדול יותר (למשל, המיכל הבינוני המשמש בפרוטוקול זה) עם אספקת מים כמתואר לעיל כדי לשמור על RH של 60%-80%(איור 1D). שמרו על אספקת מזון דגים מלאכותי רגיל(איור 1D). הערה: למרות שלב זה יכול להתבצע בכל נקודה של שלבי נימפה ומבוגרים, מומלץ לבצע אותו לאחר שהגיע לבגרות ורגע לפני הזיווג (>2.5 חודשים לאחר ההזרקה; איור 1B) כי קל יותר לתחזק כבאיות במיכל גדול. גידול אישי נדרש כדי לעקוב אחר הגנוטיפ של כל נימפה G1 על השלבים הבאים. נימפות G1 מאותו מבוגר G0 יכול להיות מוטציות שונות.</li>
		<li>צבוט ומשוך cerci ואת חוט caudal מנימפה / מבוגר באמצעות מלקחיים ולאסוף אותם לתוך צינור 0.2 מ"ל המכיל 50 μL EtOH (לאחסן את הדגימות שנאספו ב -20 °C (70 °F) עבור אחסון לטווח ארוך). הערה: דגימות רקמה נאספות ב- EtOH מכיוון שהיא מונעת אובדן של דגימות קטנות אלה עקב חשמל סטטי. אם אדם צריך לעצור את התנועה של חרקים, המרדים נימפה / מבוגר על קרח בעת לקיחת דגימות רקמה. כי T. domestica לא יכול לשרוד לאחר קירור לטווח ארוך על קרח, לא להרדים אותם במשך יותר מדקה ומיד להעביר אותם בחזרה לטמפרטורת החדר. אבלציה של cerci ואת חוטי caudal גורם ללא עלייה בתמותה.</li>
		<li>מניחים צינורות מדגם עם העפעפיים פתוחים על בלוק תרמי במשך 15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי לאדות את EtOH.</li>
		<li>חזור על שלבים 4.2.2–4.2.5 עבור genotyping.</li>
		<li>שלח את מוצרי ה- PCR שבהם תבנית רצועת מוטנטים נצפתה לשירות רצף סנגר סטנדרטי.</li>
		<li>שמרו על הנימפות/מבוגרים של G1 עם המוטציות הרצויות והשליכו את האחרים (ראו איור 4C לקבלת תוצאת רצף מייצגת).</li>
	</ol></li>
	<li>חוצים את המבוגרים המכילים את המוטציות הרצויות בצלחת הזדווגות ומשיגים את הדורות הבאים כדי ליצור זן מוטנט הומוזיגי.</li>
</ol>

<ol><li>Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019">http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019</a> (2019).</li>
<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+expression+pattern+of+labial%2C+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li>
<li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+%28Zygentoma%2C+Lepismatidae%29%3A+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li>
<li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes%2C+Clock+and+cycle%2C+in+the+firebrat+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%3A+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li>
<li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna%2C+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica%3A+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Structure+and+Development%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li>
<li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+insects%3A+Applications%2C+best+practices+and+biosafety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li>
<li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+balance+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29.+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li>
<li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+ecology+of+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Monographs%22%5BJournal%5D)">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhout%2C+HF+%22Insect+Hormones%22">Insect Hormones</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+detection%2C+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li>
<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li>
<li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+notes+upon+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+Packard%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+New+York+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עבור הדור המוצלח של מוטציית T. domestica הרצויה עם CRISPR/Cas9, חשוב תחילה לאסוף מספר מספיק של עוברים מבוימים להזרקה. עבור אוסף קבוע של מספר מספיק של ביצי T. domestica, המפתח הוא לבחור גודל מתאים של המיכל יש צפיפות אוכלוסין נמוכה יותר כי זה יעזור להשלים בהצלחה סדרה של התנהגויות הזדווגות מורכבות, אשר חוזר על עצמו לאחר כל molt מבוגר13. זכר T. domestica מבוגר מעביר את הזרע שלה בעקיפין לנקבה באמצעות זרע. Sweetman (1938) דיווח כי זה לוקח מבוגרים גברים 20 עד 35 דקות מן החניכה ...

Thermobia domestica שייך לאחד ממסדרי החרקים הבסיסיים ביותר, זיג נטומה, השומרת על מחזור חיים אמטבולי וחסר כנפיים של אבות קדמונים. תנוחה פילוגנטית בסיסית כזו ומאפייני אבות מגדירים מין זה כמודל אטרקטיבי לחקר המנגנונים שבבסיס ההצלחה של חרקים על פני כדור הארץ, המכסים מעל 70% ממיני בעלי החיים המתוארים1. T. domestica שימש זמן רב בעיקר כדי ללמוד מאפיינים אבות של פיזיולוגיה חרקים בגלל המאפיינים המתאימים שלה כמודל מעבדה, כגון מחזור חיים קצר יחסית (2.5-3.0 חודשים מעובר למבוגר הרבייה; איור 1A) ורבייה קלה. בשלושת העשורים האחרונים הורחב השימוש בו כדי לחקור מאפיינים של אבות קדמונים של תכונות שונות כגון תוכנית גוף, בידול עצבי ומקצבים צירקדיים2,3,4.
יישום כלים גנטיים מתקדמים ב- T. domestica יכול להאיץ עוד יותר תרומות כאלה בתחום מחקר רחב. הפרעה מוצלחת RNA (RNAi)-בתיווך נפילת גנים בעוברים, נימפות, ומבוגרים דווח ב T. domestica4,5,6. היעילות של RNAi המערכתי עדיין תלויה מאוד במינים - לדוגמה, הוא בדרך כלל גבוה בקולופטרה ואילו הוא נמוך בסדר הלפידופטרה7. היעילות ומשך ההפלה של RNAi ב- T. domestica טרם נבדקו. בנוסף ל- RNAi, דיווחנו בעבר על נוקאאוט גנים מוצלח של CRISPR/Cas9 בתיווך T. domestica8. מערכת CRISPR/Cas הוחלה באופן נרחב לעריכת גנום בחרקים במיוחד עבור נוקאאוט גנים ממוקדים. השימוש בו יכול להיות מורחב עבור יישומים אחרים כגון בדיקת כתב גנים, מעקב אחר שושלת התא, ומניפולציה של פעילות שעתוק על ידי דפיקות במבנים אקסוגני לאחר הקמת פרוטוקול להעברת רכיבים של מערכת CRISPR / Cas לתוך גרעינים9. בשילוב עם הרכבה הגנום שפורסם10, השימוש הרחב ופיתוח נוסף של עריכת הגנום מבוסס CRISPR / Cas ב T. domestica יקל על מחקרים המתמקדים במנגנונים האבולוציוניים שמאחורי ההצלחה המסתגלת יוצאת הדופן של חרקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור microinjection העובר עבור הזדווגות בוגר T. domestica כדי ליצור זן מוטציה באמצעות CRISPR / Cas9. בהתחשב בשיטה חדשנית זו, אנו דנים בחשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של מיני מודלים לא מסורתיים ליישומים מוצלחים של טכניקות אלה.

<table><tbody><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>קורנינג</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 ומיקרו; g</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אנטי סטטי</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>להסרת חשמל סטטי מצלחת 24 בארות</td></tr><tr><td>תיבת מחסום 20.7L</td><td>כאחד</td><td>4-5606-01</td><td>מיכל גדול</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>מיקרו-מזרק אלקטרוני</td></tr><tr><td>Femtotip II, נימי הזרקה</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>הזרקת זכוכית נימי</td></tr><tr><td>חבילה גבוהה 2440 מ"ל</td><td>כאחד</td><td>5-068-25</td><td>חממת מיכל בגודל בינוני</td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>עבור 37 מעלות; דגירה C. אין צורך להרטיב בתוך החממה.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>אנזים PCR לגנוטיפ. ממוטב להגברה מתבניות גולמיות.</td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>להחזקת המיקרומניפולטור Microloader</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>למיקרו-הזרקה. הגדלה של יותר מפי 35 מספיקה למערכת</td></tr><tr><td>האלקטרופורזה</td><td>של Microinjection MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td> Microchip</tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>סרט דו צדדי להנחת ביצים על מגלשת זכוכית</td></tr><tr><td>מברשת צבע (שיער סוס)</td> <td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבות צמחים</td><td>SPL מדעי החיים</td><td>310100</td><td>צלחת הזדווגות ואספקת מים למיכלים גדולים ובינוניים</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K, רקומביננטי, ליופיליזט בדרגת PCR מבית Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX 12</td><td>הגדלה של פי 35 מספיקה לאבקת טלק מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td></td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold</td><td>Growth Spectrum Brands</td><td></td><td>מזון דגים רגיל מלאכותי</td></tr></tbody></table>

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

תרמוביה הביתית של האש היא מין אמטבולי וחסר כנפיים המתאים לחקר המנגנונים ההתפתחותיים של חרקים שהובילו לקרינה האבולוציונית המוצלחת שלהם על פני כדור הארץ. היישום של כלים גנטיים כגון עריכת גנום הוא המפתח להבנת שינויים גנטיים האחראים על מעברים אבולוציוניים בגישה Evo-Devo. במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול הנוכחי שלנו ליצירת ותחזוקה של זנים מוטנטים של T. domestica. אנו מדווחים על שיטת הזרקה יבשה, כחלופה לשיטת ההזרקה הרטובה המדווחת, המאפשרת לנו להשיג שיעורי הישרדות גבוהים ביציבות בעוברים מוזרקים. אנו מדווחים גם על הגדרת סביבה ממוטבת להזדווגות עם מבוגרים ולקבל את הדורות הבאים ביעילות גבוהה. השיטה שלנו מדגישה את החשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של כל מין ליישום מוצלח של שיטות עריכת גנום לאורגניזמים מודל לא מסורתיים. אנו צופים כי פרוטוקולי עריכת הגנום הללו יסייעו ביישום T. domestica כמודל מעבדה ולהאיץ עוד יותר את הפיתוח והיישום של כלים גנטיים שימושיים במין זה.

בידינו, כ -100 ביצים ניתן להזריק היטב עם נימי הזרקה אחת כאשר יש לו את הקצה המתאים(איור 3C). הזרקה של gRNA / Cas9 ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בעוברים בתוך 8 h הראשון לאחר הטלת ביצה תוצאות indels באתר ממוקד gRNA. זה גורם מוטציות biallelic בתאים מסוימים של הדור מוזרק (G0) ולכן פנוטיפים פסיפס מוטציה מתקבלים בדרך כלל G0. לדוגמה, כאשר פרוטוקול זה שימש להזרקת gRNA שנועד למקד את הגן הלבן, 32.6% מנימפות G0 מציגות אובדן חלקי של פיגמנטציה בעיניהן המורכבות ובאזורי הגב שלהן (א...

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

מכיוון ש-Thermobia domestica הוא חרק בסיסי, מחקרים גנטיים על מין זה יאירו את המנגנונים העומדים בבסיס האבולוציה של חידושים מרכזיים בחרקים, כגון תעופה ממונעת ומטמורפוזות. פרוטוקול זה מכסה טכניקות בסיסיות מתחזוקת תרבית, ועד הזרקת ביצים ליישום תרמוביה כמין מודל מעבדה. שיטה זו יכולה לשמש גם ליישום של כלים גנטיים אחרים כגון הפלת גנים בתיווך RNI וטרנסגנזה בתרמוביה.שמרו על אוכלוסיות פראיות ומוטנטיות במיכל פלסטיק גדול עם מזון דגים מלאכותי רגיל, מים בכוסות פלסטיק עם חור אוורור בחלקו העליון, נייר מקופל להסתרת החרקים וכותנה שכבתית להטלת ביצים. שמור את כל תרביות T.domestica בתוך אינקובטורים של 37 מעלות צלזיוס והגדר את הלחות היחסית בתוך כל מיכל ל-60 עד 80%כדי להכין את איסוף הביצים, מושבות העבירו כ-20 זכרים ו-20 נקבות בוגרות למיכל בגודל בינוני עם מזון, אספקת מים, נייר מקופל וחתיכה קטנה של כותנה שכבתית להטלת ביצים. הקימו מספר מושבות כדי להשיג מספר רב של עוברים בשלבים תוך פרק זמן קצר.ביום ההזרקה החלף את הכותנה בתוך המיכלים בכותנה חדשה. שמונה שעות לאחר מכן אוספים את הביצים משכבות הכותנה על ידי הפרדת השכבות באמצעות מלקחיים. מיישרים את הביצים על הסרט הדו צדדי בעזרת מברשת צבע רטובה תוך שמירה על מרחק של שני מילימטר בין הביצים.כל הביציות צריכות להיות מכוונות כך שציר האורך של הביצית פונה לצד ההזרקה. לחץ בעדינות על הביצים כלפי מטה בעזרת מברשת לאחיזה יציבה במהלך ההזרקה. טען שני מיקרוליטר של תמיסת gRNA CAS9 לתוך נימי הזרקת זכוכית עם מעמיס מיקרו.ודא שאין בועות אוויר בתמיסה לפני ההזרקה. במידת הצורך הקש על המחט כדי להסיר את הבועות. ייעל את צורת קצה המחט על ידי שבירתו מעט עם מלקחיים כדי למנוע סתימה וכדי לקבל עמידות טובה יותר לאורך סדרת הזרקות.הכנס את המחט בנקודת האמצע של ציר האורך של ביצה והזריק כמות קטנה מהתמיסה. התאם את התצורה של מזרק המיקרו האלקטרוני במהלך ההזרקה, בהתאם לצורת קצה המחט. שמור את הביצים המוזרקות במיכל בגודל מתאים עם לחות יחסית של 60 עד 80% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בדוק את הביצים המוזרקות מעת לעת והשליך ביצים פגומות כדי למנוע צמיחה פטרייתית. אם צומחת יותר מדי פטרייה על ביצה, נקה את פני הביצה עם 70% אתנול. לפני הבקיעה, טבלו את שקופית הזכוכית עם הביצים המוזרקות באבקת טלק כדי לצפות את פני הסרט הדו-צדדי.זה ימנע ערימה של נימפות שבקעו. העבירו את מגלשות הזכוכית המצופות באבקה למיכל בגודל בינוני עם מזון, מים ונייר מקופל. בודד נימפות G1 ל -24 צלחות באר בעזרת שואב או מברשת.שמור על אספקת מזון דגים רגיל מלאכותי. הניחו את 24 צלחות הבאר במיכל גדול יותר עם אספקת מים ללחות של 60 עד 80% צבטו ושלפו סרקוס מנימפה או מבוגר בעזרת מלקחיים ואספו אותם לצינור של 0.2 מיליליטר המכיל 50 מיקרוליטר אתנול. אחסן את הדגימות שנאספו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך.הנח צינורות דגימה עם מכסים פתוחים על בלוק תרמי למשך 15 דקות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס כדי לאדות את האתנול. הזרקת קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין gRNA CAS9 בעוברים בשמונה השעות הראשונות לאחר הטלת הביצים מביאה לאינדלים באתר הממוקד של ה-gRNA. זה גורם למוטציות ביאלליות בחלק מהתאים של הדור המוזרק ובדרך כלל מתקבלים פנוטיפים מוטנטיים של פסיפס.כאשר נעשה שימוש בפרוטוקול זה להזרקת gRNA שתוכנן להתמקד בגן הלבן, 32.6% מהנימפות G0 הראו אובדן חלקי של פיגמנטציה בעיניים המורכבות ובאזורים הגביים שלהן. הערכת טרנספורמציה של קו הנבט של מבוגרים G0 ואנשים עם מוטציה G1 נעשתה על ידי PCR גנומי ואחריו בדיקת ניידות דופלקס הטרו. בדגימות G1, ניתן להבחין בבירור בדפוסי פס דיפרנציאלי בין דגימות מסוג בר לדגימות מוטציות.עריכת גנום בתרמוביה מספקת גישה מוצקה לניתוח מנגנונים גנטיים העומדים בבסיס תכונות מוקדמות של חרקים. זה עוזר לחקור את הסודות מאחורי ההצלחה יוצאת הדופן שלהם ושלנו.

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

למד פרוטוקול מיקרו-הזרקת ביצים לעריכת גנום ב-Thermobia domestica. שיטה זו מאפשרת יצירת זנים מוטנטיים ומחקר מנגנוני אבולוציה בחרקים.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

גלה סרטונים נוספים