Name: גילוי מוקדם של פריחות ציאנובקטריאליות וציאנוקסינים נלווים באמצעות אסטרטגיית זיהוי מהירה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: גלה אסטרטגיית זיהוי מהירה לפריחות ציאנובקטריות וציאנוטוקסינים במים ובמטריצות אורגניות. השיטה משלבת חיישנים מרחוק, רחפנים וניתוח LCMS לזיהוי תוך 24 שעות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי "Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" במסגרת הפרויקט "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella faella fascia costiera אזור דלה קמפניה", ובוצע בשיתוף פעולה עם הסוכנות להגנת הסביבה באזור קמפניה, איטליה (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno / Osservatorio Regionale לכל לה סיקורצה אלימנטרה" (IZSM /ORSA), אוניברסיטת נאפולי "פדריקו II" - המחלקה לרפואה וטרינרית וייצור בעלי חיים, השופט פרופ ' א. אנסטסיו).

1. חישה מרוחקת ופרוקסימלית: רכישת נתונים וניתוחם
הערה: במקרה זה, נתוני חישה מרוחקים/פרוקסימליים משמשים לסקר מאקרו-אזור ראשון ולבחירת נקודות ספציפיות של אזורי חוף לדגימה. בערכת MuM3 framework17 הזרימה הלוגית מבוססת על מודל ניטור הירארכי הכולל מספר רמות הנקראות שכבות מידע. המידע של כל רמה מבוסס על נתונים שנרכשו באמצעות חיישנים אחד או יותר הנישאים על גבי פלטפורמות הממוקמות בגבהים שונים. כל רמה מגדירה סולם מרחבי בהתאם לגובה המדידה19. קיים פוטנציאל לחיישנים מרובים בכל רמה. כמה דוגמאות הן: גלוי ליד אינפרא אדום (VNIR) ואינפרא אדום תרמי (TIR) הדמיה20 על לוויינים, מטוסים, מסוקים, מל"ט21 ועל פני השטח; ניתוחים פיזיים, כימיים וביולוגיים וכו'22 על פני השטח ובתגובה מהירה באמצעות המעבדה הניידת. הנתונים הנרכשים על ידי כל חיישן מעובדים ומשולבים לחישוב אינדקסים רב-ספקטרליים (לדוגמה, מדד צמחיית הפרש מנורמל (NDVI), מדד מי הבדל מנורמל (NDWI), אינדקס כלורופיל וכו '), כך שהנתונים הגולמיים מומרים לפרמטרים ופורמטים שימושיים יותר (לדוגמה, מפה נושאית).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3.jpg"> איור 2: ניתוחי חישה מרוחקים/פרוקסימליים לדגימה (שלבים 1.2). גישה רב-מפלסית ורב-חיישנית לגילוי פריחה ציאנובקטריאלית. רכישת נתונים מתבצעת על ידי לוויין (A), מטוסים (B), ו / או מזל"ט (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol><li>אחזור נתוני חישה מרוחקים ופרוקסימליים
	<ol>
<li>אחזר נתונים מערכות הנתונים השונות של חישה מרחוק ציבוריות ופרטיות, שהופקו במיוחד עבור אחזור מבוסס תוכן וסיווג סצנה. מקורות טיפוסיים של ערכת נתונים המשמשים בשלב זה כוללים: מוצרי Landsat המסופקים על ידי הסקר הגיאולוגי של ארה"ב23, סנטינל-2,3 מוצרים המסופקים על ידי נאס"א24, ו מרכז גישה פתוחה קופרניקוס25, MODIS-Aqua26.</li>
		<li>זהה את המוצרים הזמינים עבור האזור הספציפי, טווח התאריכים ושקול את המגבלה הנגזרת מכיסוי הענן. הגדר: א) אזור העניין באמצעות ממשק משתמש גרפי ובחירת מצולע; ב) טווח התאריכים וכיסוי הענן באמצעות שדות סינון שאילתת הטקסט. הערה: גם אם דיווחים מדעיים רבים מצטטים כי ערך כיסוי ענן מקובל הוא &lt;20%, בסוג זה של מחקר, חשוב לשים לב לכיסוי העננים האמיתי רק על פני המים, ולכן ערך האפקטיביות של אזור זה הוא &lt;5%.</li>
		<li>בחר מוצרים הנגזרים מהפלטפורמות המתאימים ביותר לצרכים הספציפיים של המשימה. מכל שילוב של מפרט טכני לווין ומטען, ניתן להשיג מספר אוספים של מוצרים. לדוגמה, מוצרי הנתונים של נאס"א EOSDIS24 מעובדים ברמות שונות החל מרמה 0 ועד רמה 4: מוצרי רמה 0 הם נתונים גולמיים ברזולוציית מכשיר מלאה ואילו ברמות גבוהות יותר הנתונים מומרים לפרמטרים ופורמטים שימושיים יותר. בדרך כלל, רמות 0-1 זמינים, בעוד המוצרים ברמות 2-4 צריך עיבוד ספציפי הקשורים למטרות מחקר ספציפיות, כך הזמינות שלהם מוגבלת בזמן ואת האזור מכוסה.</li>
		<li>הורד את ערכת הנתונים שנבחרה של תצפיות לווין. בפירוט, בחירה בין רשימת התוצאות מהפעולה הקודמת, הורד מוצר ערכת נתונים מלא (לדוגמה, קבוצה של קבצי geo-tiff, אחד עבור כל רצועה, בתוספת מידע ומטה-נתונים אחרים) או רק רצועה אחת ספציפית. הערה: לתיאור הספציפי של כל פעולה בסיסית הכלולה בהליך של שלב 1, עיין גם הואן-הואן חן ואח '. 202027.</li>
	</ol></li>
	<li>עיבוד ועיבוד מראש של נתונים לניתוח והפיכתם לפרמטרים ופורמטים שימושיים יותר כדי לאפשר הקרנה ראשונה של אזור המאקרו. הערה: הפעולות הבאות (שלב 1.2) מוקדשות לעיבוד נתונים סופי כדי להפוך נתונים גולמיים המגיעים מרמות נמוכות יותר למידע ולאחר מכן למידע שימושי (רמות גבוהות יותר). שלב זה מורכב מעיבוד הנתונים הגולמיים מכל חיישן (לדוגמה, רמות מוצר 0-1) והפיכתם למוצרים ברמה גבוהה יותר (לדוגמה, רמות 2-4) ולאחר מכן, בשכבות מידע כדי ליצור פרמטרים ופורמטים שימושיים יותר (לדוגמה, מפה נושאית).<ol>
<li>מעבדים מראש נתונים גולמיים הכוללים כיול גיאומטרי ורדיומטרי. ניתן לבצע פעולה זו באמצעות תוכנה ספציפית, באופן אוטומטי או חצי אוטומטי (ללא השגחה או בפיקוח), מספקת ערכה של כלים מחוברים לעיבוד רסטר כדי לבצע סיווג קל המכבד זרימת עבודה נכונה. הערה: במחקר זה, שני כלי קוד פתוח חינם משמשים: Q-GIS 3.1428 בשילוב עם תוסף סיווג חצי אוטומטי (SCP). תוסף SCP29 מאפשר סיווג חצי אוטומטי של תמונות חישה מרחוק, מתן ערכת כלים מלאה להורדת תמונות חינם, עיבוד מראש, עיבוד שלאחר, ואת חישוב רסטר.</li>
		<li>תהליך נתונים מכוילים חישוב אינדקסים multispectral. בדרך כלל, פעולה זו מתבצעת באמצעות כלי מחשבון רסטר. החישוב של אינדקס רב-ספקטרלי מגדיר מתאם בין רצועות/שכבות שונות, וכתוצאה מכך יוצר שכבה חדשה שניתן לנהל בפלטפורמת GIS. לדוגמה, החל חיישן הדימוי היבשתי התפעולי סנטינל ו Landsat (OLI), ניתן לחשב אינדקסים multispectral כגון מדד צמחייה הבדל נורמלי (NDVI). אינדקס צמחייה משמש לאחר מכן להערכת תוכן כלורופיל30,31.</li>
		<li>לנתח את התוצאות המתקבלות מההערכה של אינדקס תוכן כלורופיל המיוצג כמו במפות נושאיות צבע שווא ולהגדיר אזור קריטי עם ריכוז כלורופיל גבוה. במחקר זה, כלורופיל-מפה נוצרת באמצעות ערכת נתונים של חיישן MODIS32, רכוב על פלטפורמות לווין טרה ואקווה. נקודות הדגימה מותאמות לשפות מקומיות שבהן רשומים ערכים חריגים. הערה: דגל פריחת האצות (המגדירים כל נקודה ספציפית) מורם בתחום החישה מרחוק כאשר ריכוז Chl-a עולה על 20 מ"ג / L33.</li>
	</ol></li>
</ol>2. דגימות מונחות
הערה: הבחירה בנקודות דגימה מונעת על ידי ניתוח שכבת חישה מרוחקת / פרוקסימלית המאפשרת לבחור כתמים באזורי חוף גדולים. אם ניקח בחשבון כי דגימה עלולה להיות מסוכנת עבור מפעילים בשל רעילות של microcystins, נהלי דגימת בטיחות נדרשים. במיוחד, יש צורך להגן על המפעילים מפני שאיפת תרסיס ומגע בעור. לאחר מכן, בצע דגימה בהתאם להליך המפורט להלן.
<ol><li>יש ללבוש משקפי מגן להגנה על העיניים, מסכת FFP2 למניעת שאיפת אירוסול וכפפות בטיחות למניעת מגע בעור.</li>
	<li>לאסוף 0.5 L של מים משולש בכל אתר.</li>
	<li>למדוד את המליחות עבור כל מדגם באמצעות שבירה. שים טיפה של המדגם על השבירה ולקרוא את ערך המליחות במונחים של חלקים לאלף (ppt - ‰).</li>
	<li>בסוף הדגימה, ראשית לשטוף את הידיים; ואז בתורו להסיר את הכפפות, מסכה, ומשקלים מקפידים לא לגעת במשטח החיצוני של ציוד הגנה אישית.</li>
	<li>קח את הדגימה למעבדה בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>3. זיהוי מיני ציאנובקטריה על ידי תצפיות מיקרוסקופיות וזיהוי טקסונומי
<ol><li>צנטריפוגה כל דגימה (≈0.5 L) ב 11,200 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>לחלץ supernatants כדלקמן: לשפוך 500 מ"ל של butanol בכל מדגם באמצעות משפך, להעביר את התערובת כדי להיות מופק לתוך משפך מפריד. הנח את המשפך המפריד זקוף במהדק הטבעת כדי לאפשר לשתי השכבות להיפרד. תן לשלב מימית לנקז בבקבוק ארלנמאייר. חזור על שלב זה שלוש פעמים. לאחר מכן, לרכז את השלבים האורגניים תחת ואקום ולשקול אותם.</li>
	<li>לאסוף כדורי משלב 3.1 ולנתח אותם ב 400x ו 1,000x הגדלה עם מיקרוסקופ אופטי מצויד 18 MP מצלמה דיגיטלית עבור מיקרוסקופ. חפש נוכחות של ציאנובקטריה על בסיס התכונות המורפולוגיות שלהם: צבע כחול-ירוק, צורת תא וגודל מאפשרים לזהות ציאנובקטריה בקרב מיקרואורגניזמים אחרים.</li>
	<li>לזהות את המין באמצעות ניתוח טקסונומי על ידי תצפית מיקרוסקופית, על פי ההליך המתואר Komarék ואח '. 201434. הערה: ניתן לבצע ניתוח מטגנומי משלים של 16S על מנת לזהות מסה ציאנובקטריאלית3.</li>
	<li>לדלל aliquot של כדורי עם 10 מ"ל של מי ים / מים מתוקים BG11 מדיה, על פי המליחות שלה, לטיפוח.</li>
</ol>4. זיהוי של ציאנוקסינים
<ol><li>מיצוי דגימות עם ממיסים אורגניים<ol>
<li>שים כל מדגם של גלולה בבקבוק sonicate במשך 5 דקות באמצעות אמבט קרח. לאחר מכן, הוסיפו 50 מ"ל של MeOH טרי ונערו בעדינות. סנן את הפתרון באמצעות מסנן נייר ואסוף את הסינון בבקבוקון תחתון עגול. חזור על שלב זה פעמיים. לאחר מכן, לחלץ את כדורי הוספת תערובת 50 מ"ל של MeOH / DCM פעמיים (1:1, 50 מ"ל), ופעמיים באמצעות 100% DCM (x2, 50 מ"ל)35. סמן כל בקבוקון תחתון עגול בהתאמה, כ"תמצית MeOH", "תמצית MeOH/DCM" ו"תמצית DCM", והתרכז תחת ואקום.</li>
		<li>נתח כל תמצית אורגנית (MeOH, MeOH/DCM, DCM) באמצעות LC-HRMS/MS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח LC-HRMS/MS<ol>
<li>הכנת דגימות LC-HRMS ו-LC-HRMS/MS: המסת כל דגימה באמצעות MeOH ≥ 99.9% כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל.</li>
		<li>נתח כל דגימה באמצעות ספקטרומטר מסה ESI ברזולוציה גבוהה בשילוב עם מערכת HPLC (מערכת LC-HRMS/MS). עבוד על HPLC עם עמודת C18 של 5 מיקרומטר (100 x 2.10 מ"מ), בטמפרטורת החדר. השתמש elution הדרגתי עם H2O (בתוספת 0.1% HCOOH) ו MeOHat 200 μL מינימום-1. התוכנית ההדרגתית היא: 10% MeOH למשך 3 דקות, 10% עד 100% MeOH למשך 30 דקות, 100% MeOH למשך 7 דקות.</li>
		<li>רכישת נתונים. איסוף נתונים במצב רכישה תלוי נתונים (DDA): 10 היונים האינטנסיביים ביותר של ספקטרום מסת סריקה מלאה צריכים להיות נתונים לניתוח ספקטרומטריית מסה דו-מושבית ברזולוציה גבוהה (HRMS/MS). רכוש סריקות HRMS/MS עבור יונים נבחרים עם פיצול CID, רוחב בידוד של 2.0, אנרגיית התנגשות מנורמלת של 35, הפעלה Q של 0.250 וזמן הפעלה של 30 אלפיות השנייה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוחים ביואינפורמטיים ורשתות מולקולריות<ol>
<li>נתח תבניות פיצול עבור כל יון אינטנסיבי באמצעות תוכנה ספציפית ל- MS.</li>
		<li>השתמש ב- MS-Cluster כדי לאשכול את הנתונים (עמידות במסה המהווה אב של 1.0 Da וסובלנות יון קטע MS/MS של 0.5 Da). ספקטרום קונצנזוס המכיל פחות מ 2 ספקטרום מסולקים.</li>
		<li>נתח נתוני MS/MS על ידי GNPS (גלובל מוצרים טבעיים חברתיים36) עבור רשתות מולקולריות.</li>
		<li>זוג להשוות ספקטרום קונצנזוס וגם עם אלה שדווחו בספריות GNPS-Mass-Ive.</li>
		<li>דמיינו את הרשת המתקבלת37. הערה: עבור נטוורקינג מולקולרי אנא עיין Sigrist ואח '. 202038.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3.jpg"> איור 3: שלבי מעבדה של FDS (3.4). ייצוג חזותי של הפעילויות העיקריות המתבצעות במעבדה לאחר הדגימה (שלבים 3 ו-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+marine+toxins+and+the+associated+seafood+poisoning+episodes+in+the+African+countries+of+the+Indian+ocean+and+the+Red+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea.</a> Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).</li>
<li>Lürling, M., Faassen, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+poisonings+associated+with+a+Microcystis+aeruginosa+bloom+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands.</a> Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).</li>
<li>O'Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+harmful+cyanobacteria+blooms%3A+The+potential+roles+of+eutrophication+and+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change.</a> Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).</li>
<li>Teta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacteria+as+indicators+of+water+quality+in+Campania+coasts%2C+Italy%3A+A+monitoring+strategy+combining+remote%2Fproximal+sensing+and+in+situ+data%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data.</a> Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).</li>
<li>Teta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioindicators+as+a+tool+in+environmental+impact+assessment%3A+Cyanobacteria+as+a+sentinel+of+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sustainable+Development+and+Planning%22%5BJournal%5D)">Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution.</a> International Journal of Sustainable Development and Planning. 14 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cyanobacterial+blooms+to+assess+the+impact+of+wastewaters+discharges+on+coastal+areas+and+lakes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sustainable+Development+and+Planning%22%5BJournal%5D)">Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes.</a> International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).</li>
<li>Teta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+molecular+networking+study+of+a%3A+Smenospongia+sponge+and+a+cyanobacterial+bloom+revealed+new+antiproliferative+chlorinated+polyketides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Chemistry+Frontiers%22%5BJournal%5D)">A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides.</a> Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacteria%3A+an+emerging+source+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery.</a> Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).</li>
<li>Huisman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+blooms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).</li>
<li>Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+evaluation+of+cyanobacterial+cyclic+peptide+toxin+microcystin+variants+%28LR%2C+RR%2C+YR%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice.</a> Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+toxins%3A+Microcystin-LR+in+drinking+water.+Background+document+for+development+of+WHO+Guidelines+for+Drinking-Water+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality.</a> WHO. 2, (1998).</li>
<li>Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+strategies+for+the+monitoring+of+freshwater+cyanobacteria%3A+Reducing+the+sources+of+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty.</a> Water Research. 46 (9), 3043-3053 (2012).</li>
<li>Giménez-Campillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cyanotoxins+and+phycotoxins+in+seawater+and+algae-based+food+supplements+using+ionic+liquids+and+liquid+chromatography+with+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry.</a> Toxins. 11 (10), 610(2019).</li>
<li>Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanotoxins%3A+methods+and+approaches+for+their+analysis+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22JRC+Technical+Reports%22%5BJournal%5D)">Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection.</a> JRC Technical Reports. , (2017).</li>
<li>Teta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+LC-MS%2FMS+and+molecular+networking+approach+reveals+new+cyanotoxins+from+the+2014+cyanobacterial+bloom+in+Green+Lake%2C+Seattle%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle.</a> Environmental Science and Technology. 49 (24), 14301-14310 (2015).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+detection+strategy+for+cyanobacterial+blooms+and+associated+cyanotoxins+%28FDSCC%29+reveals+the+occurrence+of+lyngbyatoxin+A+in+campania+%28South+Italy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy).</a> Chemosphere. 225, 342-351 (2019).</li>
<li>Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+impact+assessment%3A+a+multilevel%2C+multi-parametric+framework+for+coastal+waters%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sustainable+Development+and+Planning%22%5BJournal%5D)">Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters.</a> International Journal of Sustainable Development and Planning. 13 (8), 1041-1049 (2018).</li>
<li>Di Fiore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+hierarchical+geo-environmental+survey+strategy+applied+to+the+detection+and+investigation+of+an+illegal+landfill%3A+A+case+study+in+the+Campania+Region+%28Southern+Italy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy).</a> Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).</li>
<li>Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDES+project%3A+A+new+effective+tool+for+safety+and+security+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lecture+Notes+in+Computer+Science+%28including+subseries+Lecture+Notes+in+Artificial+Intelligence+and+Lecture+Notes+in+Bioinformatics%29%22%5BJournal%5D)">IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment.</a> Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , 8286 LNCS (PART 2) (2013).</li>
<li>Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+terrestrial+discharges+into+coastal+waters+with+thermal+imagery+from+a+hierarchical+monitoring+program%5BTitle%5D)+AND+%22Water%22%5BJournal%5D)">Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program.</a> Water. 9 (7), Switzerland. (2017).</li>
<li>Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+simulation+of+the+emergent+behavior+of+small+drones+swarming+for+distributed+target+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Science%22%5BJournal%5D)">Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization.</a> Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).</li>
<li>Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+pollution%2C+including+eroded+soils%2C+intensifies+cloud+growth%2C+precipitation%2C+and+soil+erosion%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cleaner+Production%22%5BJournal%5D)">Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review.</a> Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).</li>
<li>U.S. Geological Survey. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ers.cr.usgs.gov">https://ers.cr.usgs.gov</a> (2020).</li>
<li>NASA Earthdata. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://urs.earthdata.nasa.gov">https://urs.earthdata.nasa.gov</a> (2020).</li>
<li>Copernicus Opern Access Hub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://scihub.copernicus.eu/apihub">https://scihub.copernicus.eu/apihub</a> (2020).</li>
<li>MODerate Image Spectroradiometer (MODIS) Aqua. , Available from: 
 <a target="_blank" href="podaac-tools.jpl.nasa.gov">podaac-tools.jpl.nasa.gov</a> (2020).</li>
<li>Chen, H. -H., Tang, R., Zhang, H. -R., Yu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+relationship+between+sea+surface+chlorophyll+and+major+features+of+the+south+china+sea+with+satellite+information%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).</li>
<li>QGIS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qgis.org/it/site/">https://www.qgis.org/it/site/</a> (2020).</li>
<li>Congedo, L. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation">https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation</a> (2016).</li>
<li>Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+vegetation+systems+in+the+great+plains+with+ERTS%5BTitle%5D)+AND+%22Third+Earth+Resources+Technology+Satellite+%28ERTS%29+Symposium%22%5BJournal%5D)">Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS.</a> Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).</li>
<li>Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetation+index+to+estimate+chlorophyll+content+from+multispectral+remote+sensing+data%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Remote+Sensing%22%5BJournal%5D)">Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data.</a> European Journal of Remote Sensing. 48 (1), 319-326 (2015).</li>
<li>Savtchenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODIS+data+from+terra+and+aqua+satellites%5BTitle%5D)+AND+%22International+Geoscience+and+Remote+Sensing+Symposium+%28IGARSS%29%22%5BJournal%5D)">MODIS data from terra and aqua satellites.</a> International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).</li>
<li>Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+satellite-derived+chlorophyll+and+algal+bloom+indices+on+Lake+Winnipeg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Great+Lakes+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg.</a> Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).</li>
<li>Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+classification+of+cyanoprokaryotes+%28cyanobacterial+genera%29+2014%2C+using+a+polyphasic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Preslia%22%5BJournal%5D)">Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach.</a> Preslia. 86, 295-335 (2014).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorinated+thiazole-containing+polyketide-peptides+from+the+caribbean+sponge+smenospongia+conulosa%3A+structure+elucidation+on+microgram+scale%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).</li>
<li>UCSD Commputational Mass Spectrometer Website. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://gnps.ucsd.edu/">http://gnps.ucsd.edu/</a> (2020).</li>
<li>Shannon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape%3A+A+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).</li>
<li>Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-guided+genome+mining+as+a+tool+to+uncover+novel+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

במהלך השנים האחרונות, הצוות שלנו בדק ואימת מספר גישות שונות שאפשרו לפענח את נוכחותם של ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים בגופי מים ובייבלבים. האסטרטגיה המפותחת החדשה מייצגת את התוצאה של מחקרים אלה. הטכניקות והטכנולוגיות האופטימליות המתאימות להיקף הזיהוי המהיר נאספות תחת כובעו של הליך ייחודי הממקסם את האפקטיביות של כל צעד ושלב. אזור היעד, הרחבת הפריחה ושלב הגידול הם הכוח המניע לבחירת שיטות וטכנולוגיות מתאימות לשימוש.
כאשר גילוי מהיר של ציאנובקטריה וציאנוקסינים הוא בראש סדר העדיפויות, האסטרטגיה יעילה בהפחתת המספר הכולל לארבעה שלבים עיקריים: (1) חישה מרחוק ופרוקסימלי וניתוח נתונים לסקר ראשון, לוקליזציה של אתרים והגדרת דפוס פריחה והרחבה; (2) דגימה מודרכת; (3) תצפית מיקרוסקופית וניתוח טקסונומי; (4) ניתוח כימי ורשת מולקולרית של נתוני LC-MS לדרפליציה של דגימות המים וגילוי מהיר של ציאנוקסינים.
לגבי הצעד הראשון, גם אם הזמינות של נתונים שנרכשו על ידי שרשרת שלמה של פלטפורמות המכסות את כל השכבות של גישת ניטור היררכי יהיה הפתרון הטוב ביותר כדי restitute חזון מלא של התרחיש מנותח, לעתים קרובות רק שכבת מידע אחת יכולה להניע את פעולת הסקר באזור ולהתמקד ביעילות בנקודות החמות לבצע פעולות דגימה in-situ. על פי החוויות המדווחות שבהן נרכשו נתונים באמצעות לוויינים, מטוסים, מסוקים, כלי טיס בלתי מאוישים, הפתרון התואם לחלוטין את הצרכים הנדרשים על ידי אסטרטגיית הגילוי המהירה הוא השימוש במוצרי הלוויין היחידים.
בנוסף, שכבות המידע הנובעות ממשימות המבוצעות על ידי פלטפורמות הטסות בגבהים נמוכים יותר מאשר לוויינים (למשל, מטוסים, מסוקים, כלי טיס בלתי מאוישים) מספקות מידע ברזולוציה גבוהה אך אלה יקרות מאוד וגם דורשות זמן רב יותר להשלמת תהליך הרכישה המלא הכולל גם הגדרת תוכנית טיסה ואישור.
לאחר שהנקודות שיש לדגימות נבחרו (שלב 2), ניתוחים אנליטיים/ביואינפורמטיים (נטוורקינג מולקולרי של נתוני LC-MS) הוא הכלי לדרפליציה מהירה של דגימות המים וגילוי מהיר של ציאנוקסינים (שלבים 3 ו -4). ניתוח מטגנומי 16S לוקח לפחות 2 שבועות של עבודה. יתר על כן, גם כאשר מינים ציאנובקטריאליים רעילים באופן כללי מזוהים, ייצור הרעלן שלהם אינו מוכח. מאותה סיבה, תצפית מיקרוסקופית אינה עצמה מספיקה כדי לחשוף את נוכחותם של ציאנובקטריה רעילה. כמובן, ניתוח טרשת נפוצה ורשת מולקולרית יש כמה מגבלות; הם יעילים למדי אם תרכובות של עניין (למשל, רעלים) מיוננת היטב בתנאים החלים, אם הם בסכום מספיק כדי להתגלות. לצורך זיהוי וניטור רעלן ציאנובקטריאלי ידוע, רשת מולקולרית מבוססת טרשת נפוצה מייצגת למעשה את אחת הטכנולוגיות החזקות והאמינות יותר.
לכן, גישה זו מוכיחה להיות שימושי למדי כאשר יש צורך בזיהוי מהיר של ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים קשורים; יתר על כן, כימות של פריחה ציאנובקטריאלית ורעלן על פני מרחב וזמן אפשרי גם על ידי אסטרטגיה זו כדי למנוע בעיות של קהילות בריאות שעלולות להתעורר על ידי פריחות רעילות ציאנובקטריאליות גדולות.

פריחות ציאנובקטריאליות התגלו כבעיה סביבתית בכל רחבי העולם ב -15 השנים האחרונות1,2. פריחות ציאנובקטריאליות נובעות מצמחיית יתר של מיקרואורגניזמים הנקראים ציאנובקטריה. הם קבוצה בולטת של מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים שהתאימו את עצמם לחיות במגוון רחב של סביבות, כולל אזורים טרופיים ומים קרים במיוחד. הם ידועים בהפקת פריחות גדולות המכסות משטחי מים, במיוחד בתגובה להעשרה מסיבית של חומרים מזינים, מה שמכונה תהליך eutrophication3.
לכן, ציאנובקטריה הם bioindicators מעולה של זיהום מים4,5,6. הם יכולים גם לייצר מגוון רחב של תרכובות טבעיות עם תכונות תרופתיות מעניינות7,8. הבעיה הסביבתית הקשורה לציאנובקטריה היא הפריחה עצמה. פריחה יכולה לחסום את אור השמש לעשבים מתחת למים, לצרוך חמצן במים המובילים להריגת דגים, לייצר חלאות וריחות משטח, ולהפריע להאכלת המסנן של אורגניזמים9.
בנוסף, ואפילו יותר ברצינות, בשילוב מסוים של גורמים כגון טמפרטורה, חומרים מזינים (זרחן וחנקן), אור השמש (עבור הפוטוסינתזה), ו- pH של המים, פריחות ציאנובקטריאליות מפעילות ייצור רעלים; לכן, הם הופכים מזיקים לבני אדם ובעלי חיים. המחלקה הנחקרת ביותר של ציאנוקסינים מיוצרת על ידי הסוג Microcystis. אלה הם פפטידים מחזוריים הידועים תחת השם הכללי של microcystins (MCs): microcystin-LR להיות הנחקר ביותר כמו היכולת לייצר hepatoxicity חמור10. בעלי חיים ובני אדם עלולים להיחשף MCs על ידי בליעה של מי שתייה מזוהמים או מזון. ארגון הבריאות העולמי (WHO) הציע ערך microcystin-LR הכולל של 0.001 מ"ג / ליטר כקו מנחה11. עם זאת, זה קשור רק גרסה אחת (כלומר, MC-LR) מתוך יותר מ 100 microcystins שהיו מבודדים עד כה.
שיטות משולבות שדווחו בעבר, כגון חישה מרחוק עם MALDI-TOF MS ניתוח12,13,14,15, התמקדו בזיהוי ריכוז של MCs. השיטות האחרונות משתמשות בחיישנים ברזולוציה נמוכה היעילים בזיהוי מרחבי פריחה רחבים בלבד; הם גם מסוגלים לחשוף רק רעלים שעבורם סטנדרטים זמינים. יתר על כן, רוב ההליכים האלה הם זמן רב, והזמן הוא גורם דרמטי לגילוי מוקדם של הפריחה כדי למנוע או למזער בעיות בטיחות. האסטרטגיה הרב-תחומית המוצעת כאן מספקת זיהוי מהיר של פריחת ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים, לאחר 24 שעותבלבד 16.
במסגרת התוכנית שנקראת MuM3, "ניטור רב תחומי, רב-ממדי ורב-פרמטרי במרחב הפיזי התלת מימדי (3D) "17,18, אסטרטגיית זיהוי מהירה (FDS) משלבת את היתרונות של מספר טכניקות: 1) חישה מרחוק כדי לזהות את הפריחה; 2) תצפית מיקרוסקופית לגילוי מיני ציאנובקטריה; ו-3) ניתוחים אנליטיים/ביואינפורמטיים, כלומר, רשתות מולקולריות מבוססות LC-HRMS, לזיהוי ציאנוטוקסינים. התוצאות מתקבלות תוך 24 שעות.
הגישה החדשה שימושית לניטור אזורי חוף רחבים תוך זמן קצר, הימנעות מדגימה וניתוחים רבים והפחתת זמן הגילוי והעלויות. אסטרטגיה זו היא תוצאה של מחקר ויישום של גישות שונות לניטור של ציאנובקטריה ורעליהם ומשלבת את היתרונות של כל אחד מהם. באופן ספציפי, ניתוח התוצאות, הנובעות משימוש בפלטפורמות שונות (לווין, מטוסים, רחפנים) וחיישנים (MODIS, אינפרא אדום תרמי) לניתוח חישה מרחוק, כגון גישות מתודולוגיות מגוונות לזיהוי מינים ציאנובקטריאליים (מיקרוסקופ, ספקטרוסקופיית UV-Vis, ניתוח 16S) ורעלים (ניתוח LC-MS, רשתות מולקולריות), אפשרו את הבחירה בשיטה המתאימה ביותר הן עבור המתודולוגיה החדשה נוסתה ותוקפה בקמפיינים שלאחר מכן ניטור בחופי קמפניה (איטליה), במסגרת תוכנית ניטור הסוכנות להגנת הסביבה קמפניה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3.jpg"> איור 1: אסטרטגיית FDS. סקירה כללית של אסטרטגיית זיהוי מהיר עבור ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr>תערובת <td></td><td></td><td>ויטמינים פי 10</td><td>חומצה ניקוטינית 100 מ"ג/100 מ"ל; PABA 10 מ"ג/100 מ"ל; ביוטין 1 מ"ג/100 מ"ל; תיאמין 200 מ"ג/100 מ"ל; B12 1 מ"ג/100 מ"ל; חומצה פולית 1 מ"ג/100 מ"ל; אינוזיטול 1 מ"ג/100 מ"ל; Ca-pantothenate 100 מ"ג/100 מ"ל</td></tr><tr><td>1-BuOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33065.2.5L-R</td><td></td></tr><tr><td>BG11 תמיסת</td><td></td><td></td> מלאי <td>Na2EDTA 20 מ"ג/ליטר; אמוניום ציטראט ברזל 120 מ"ג/ליטר; חומצת לימון ומידות; 1 שעה<תת>2</תת>O 120 מ"ג/ליטר; CaCl2&middot; 2H2O 700 מ"ג/ליטר, MgSO4&middot; 7H2O 1.5 g/L, K2HPO4&middot; 3H2O 800 מ"ג/ליטר, NiSO4(NH4)2SO4&middot; 6H2O (מלאי 0.1 מ"מ) 5 מ"ל; Na2SeO4 (מלאי 0.1 מ"מ) 2 מ"ל, Nitsch's Solution 20 מ"ל</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>הרמל</td><td>Z36HK</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Honeywell</td><td>32211.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kinetex C18 cloumn</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה ESI ברזולוציה גבוהה LTQ Orbitrap XL בשילוב עם מערכת U3000 HPLC</td> מיקרוסקופ <td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Honeywell</td><td>32213.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>המצויד במצלמת OMAX 18 MP CMOS&nbsp;</td><td>Optech</td><td>Biostar B3</td><td></td></tr><tr><td>Multiband מצלמה Intergraph</td><td>DMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitsch's Solution</td><td></td><td></td><td>H3BO3 0.5 g/L MnSO4&middot; H2O 2.28 g/L ZnSO4&middot; 7H2O 0.5 g/L CuSO4&middot; 5H2O 0.025 g/L COCl2&middot; 6H2O 0.135 g/L Na2MoO4&middot; 2H2O 0.025 גרם/ליטר</td></tr><tr><td>רפרקטומר mr 100 ATC</td><td>AQL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWBG11 בינוני</td><td></td><td></td><td>BG11 תמיסת מלאי 50 מ"ל/ליטר; אינסטנט אוקיינוס 33 גרם/ליטר; מים 950 מ"ל/ליטר 10X; תערובת ויטמינים 100 ומיקרו; ליטר/ליטר</td></tr></tbody></table>

גילוי מוקדם של פריחות ציאנובקטריאליות וציאנוקסינים נלווים באמצעות אסטרטגיית זיהוי מהירה

Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

זיהוי מהיר של ציאנובקטריה וציאנוקסינים מושגת באמצעות אסטרטגיית זיהוי מהירה (FDS). רק 24 שעות נדרשות כדי לפענח את נוכחותם של ציאנובקטריה וציאנוטוקסינים קשורים בדגימות מים ובמטריצה אורגנית, כגון תמציות דו-כיווניות. FDS משלב טכניקות חישה מרוחקות/פרוקסימליות עם ניתוחים אנליטיים/ביואינפורמטיים. נקודות דגימה נבחרות באמצעות ניטור רב-תחומי, רב-ממדי ורב-פרמטרי במרחב פיזי תלת מימדי, כולל חישה מרחוק. תצפית מיקרוסקופית וניתוח טקסונומי של הדגימות מבוצעים במסגרת המעבדה, המאפשרת זיהוי של מינים ציאנובקטריאליים. דגימות מופקות לאחר מכן עם ממיסים אורגניים ומעובדות עם LC-MS / MS. נתונים המתקבלים על ידי MS / MS מנותחים באמצעות גישה ביואינפורמטית באמצעות הפלטפורמה המקוונת גלובל מוצרים טבעיים חברתיים (GNPS) כדי ליצור רשת של מולקולות. רשתות אלה מנותחות כדי לזהות ולזהות רעלים, השוואת נתונים של ספקטרום הפיצול המתקבל על ידי ספקטרומטריית מסה עם ספריית GNPS. זה מאפשר זיהוי של רעלים ידועים אנלוגים לא ידועים המופיעים קשורים באותה רשת מולקולרית.

במחקר ראשון3, ארבעה אתרים מושפעים אנתרופוגנית לאורך חוף קמפניה באיטליה SW נצפו באמצעות לווין Landsat 8 ומטוסים במהלך קיץ 2015. Landsat 8 חיישן תמונה יבשתית מבצעית (OLI) ואת המצלמה multispectral המטוס מותר ליצור הבדל מנורמל אינדקס מים (NDWI) תמונות עבור האזורים, ולכן, כדי לחשוף את נוכחותם של קהילות cyanobacterial. הרכב הקהילה הציאנובקטריאלי נקבע באמצעות ניתוחים ספקטרופוטומטריים לגילוי phycocyanin פיגמנט ציאנובקטריאלי (PC). לאחר מכן, ניתוח מטגנומי משלים 16S מותר לזהות מסה ציאנובקטריאלי. האינדקס והסיווג של התמונה הרב-ספקטרלית הפשוטה באמצעות פלטפורמות לווין/אוויר בשילוב עם ניתוחים מטגנומיים היו יעילים בזיהוי נוכחות של ציאנובקטריה השייכת לג'נריישן הקשורים לתנאים אוטרופיים חזקים (כגון לפטולינגביה sp., Pseudooscillatoria sp.), בשלב מוקדם של פריחה.
במחקר שני14, גישת FDS נבדקה במהלך האביב / קיץ 2017. נתוני לוויין שימשו כרמה היחידה של חישה מרחוק. בפירוט, נתונים שנרכשו על ידי חיישן MODerate Image Spectroradiometer (MODIS), רכוב על פלטפורמות לוויין טרה ואקווה, אפשרו כימות של כלורופיל-a (Chl-a) בגופי המים לאורך חופי קמפניה ונסעו הבחירה של עשרה כתמי דגימה. דגימות עובדו במעבדה על ידי תצפית מיקרוסקופית וזיהוי טקסונומי, ולאחר מכן שחולצו עם ממיסים אורגניים. תמציות אורגניות עובדו על ידי ניתוח LC-MS-MS. נתונים שהתקבלו על ידי MS-MS נותחו באמצעות גישה ביואינפורמטית, באמצעות פלטפורמת GNPS כדי ליצור רשת של מולקולות. הרשת נותחה כדי לזהות ולזהות רעלנים המשווים נתונים של ספקטרום הפיצול המתקבל על ידי ספקטרומטריית מסה עם ספריית GNPS. זה מותר לזהות רעלים ידועים אנלוגים לא ידועים שיופיעו קשורים באותה רשת מולקולרית. באופן ספציפי, Lyngbyatoxin A, dermatotoxins lipophilic, זוהה בכל דגימות המים ודגימות דו-כיווניות; ב Lyngbyatoxin אשכול מולקולרי, צמתים שאינם קשורים לכל תרכובות ידועות של משפחת lyngbyatoxins היו גם נוכחים, מה שמרמז על נוכחות של אנלוגים לינגביא רעלן לא ידוע. בדגימות לא התגלו מיקרוציסטינים ורעלים אחרים. כל התוצאות התקבלו תוך 24 שעות.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות FDS. דוגמה ליישום אסטרטגיית FDS בחוף קמפניה (איטליה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן מתוארת בעיה רב-תחומית לגילוי מוקדם של פריחות ציאנובקטריאליות וציאנוטוקסינים נלווים. זה מאפשר זיהוי של ציאנובקטריה וציאנוקסינים הקשורים בדגימות מים ומטריצות אורגניות, כגון דגימות דו-כיווניות, תוך 24 שעות.

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of ...

אסטרטגיית הגילוי המהירה מאפשרת גילוי מוקדם של פריחות ציאנובקטריה וציאנוקסינים קשורים בדגימות המים, בין אם במטריצה אורגנית זו, כגון דגי פגז ומוצרי דגים אחרים. פריחת ציאנובקטריה נובעת מצמחיית יתר של ציאנובקטריה, שיכולה לחיות בכל סוג של סביבה. והם התגלו כבעיה סביבתית ברחבי העולם ב-15 השנים האחרונות.ככל שמספר פריחות ציאנובקטריה מזיקות גדל במהלך השנים האחרונות, הצורך בגילוי מוקדם, שהוא המפתח לטיפול בפריחה והתפשטות רעילה הפך דחוף יותר. אסטרטגיית הכיוון הראשונה שלנו משלבת טכנולוגיית חישה מרחוק ופרוקסימלית עם המעבדה ניתוח כימי וביואינפורמטי בשילוב ייחודי של זרימת העבודה. כל התהליך בטוח.אמצעי בטיחות מתאימים ננקטים כדי למנוע שאיפת תרסיס ומגע בעור במהלך דגימה וניתוח מעבדה. לאחזור נתונים, אתר תחילה את אזור היעד במפת עולם גלובלית ואחזר את הנתונים מערכות נתונים שונות של חישה מרחוק ציבוריות ופרטיות עבור תאריך האיסוף. לאחר האחזור, עבד את הנתונים הגולמיים, חשב את האינדקסים הרב-ספקטרליים וסווג את המידע המתקבל.לאחר מכן הגדר את אתרי הדגימה במפה הנושאית שנוצרה. לאיסוף מדגם, העבירו את הציוד לאתר הדגימה שנבחר במעבדה הניידת ותכננו את נתיב טיסת המזל"ט לביצוע סקר אזור מאקרו. באתר, השתמש במספר רחפנים המצוידים במטענים שונים לביצוע משימות טיסה.ולהשתמש בקטעים שנרכשו על ידי המזל"ט כדי לאמת את נוכחות הפריחה וההרחבה ולזהות נקודות דגימה מדויקות. בנקודת הדגימה שזוהתה, לשים על ציוד מגן אישי המתאים ולאסוף שלוש דגימות מים 500 מיליליטר מכל אתר. למדוד מספר פרמטרים סביבתיים כגון טמפרטורת האוויר והמים ואת pH האתר מליחות.ואז לאחסן את הדגימות שנאספו במעבדה הניידת להובלה למעבדה באוניברסיטה. הכן שקופיות וסנן את הדגימות עם מיקרוסקופ המעבדה הנייד מצויד במצלמה דיגיטלית כדי לאפשר ניתוח טקסונומי מיקרוסקופי וזיהוי של המינים הקיימים בתוך הדגימות על בסיס הצבע הכחול-ירוק שלהם, צורת התא, כדורי גודל. לאחר שמינים של ציאנובקטריה שנאספו בתוך הדגימות זוהו, במעבדת האוניברסיטה, צנטריפוגה הדגימות ולהעביר כל supernatant למיכל חדש מבלי להפריע כדורי המדגם.הוסף 500 מיליליטר של בוטנול לכל מדגם supernatant ולהעביר כל פתרון כדי להיות מופק לתוך משפך הפרדה. לאחר טלטול והנחת משפכים זקוף מלחצי טבעת בודדים, לאפשר את השלבים מימית לנקז לתוך צלושי Erlenmeyer בודדים. לאחר חזרה על הפרדת השכבה שלוש פעמים, לרכז את השלבים האורגניים תחת ואקום ולשקול אותם.להפקת מדגם באמצעות ממיסים אורגניים, להוסיף 50 מיליליטר של מתנול טרי לכל גלולה מדגם sonicate את הדגימות באמבט קרח. לאחר חמש דקות, מוסיפים 50 מיליליטר של מתנול טרי לכל דגימה ומנערים בעדינות את הבקבוק לפני סינון הפתרונות באמצעות חתיכות בודדות של נייר מסנן ואיסוף filtrates בבקבוקים תחתונים עגולים. לאחר סינון כל מדגם פעמיים נוספות, כפי שהוכח זה עתה, לנתח את תמציות המדגם על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לאחר מכן צור רשת מולקולרית באמצעות הפלטפורמה החברתית העולמית של המוצר הטבעי והשתמש בכלים המתאימים כדי לנתח את נתוני ספקטרומטריית המסה של הרשת והטנדם המתקבלים כדי לזהות רעלנים שנקבע כי הם נוכחים בדגימות שנאספו. האסטרטגיה המוצעת קיבלה תוקף על ידי התוצאות שהתקבלו בתוכנית ניטור החופים, הפעילה באזור קמפניה בדרום איטליה בין 2015 ל-2021. נוצרה זרימת עבודה חזותית המקשרת את הטכניקות עם התוצאות שנוצרו.במהלך מסעות הניטור הבאים, כל צעד היה אופטימיזציה במטרה לאתר במהירות. אופטימיזציה של זרימת העבודה של חישה מרחוק אפשרה הפחתה במספר הפלטפורמות והמשימות תוך שיפור רמת המוצר שנוצרה. לדוגמה, אסטרטגיית זיהוי מהירה זו מאפשרת מעבר משימוש במספר פלטפורמות אוויריות שונות לפלטפורמות לוויין ורחפנים בלבד.ומהשימוש במספר אינדקסים מיוחדים רב ספקטרליים שונים ועד לכלורופיל האינפורמטיבי יותר ומפות נושאיות של מדד צמחיית הבדל מנורמל. במקביל, זרימת העבודה הופחתה מצורך בניתוח מטוגנומי של 16 S לשימוש בתצפית מיקרוסקופית רק לקביעת הקהילה הציאנובקטריאלית. וזרימת העבודה הכימית החדשה משתמשת ברשת מולקולרית מבוססת LCMS לגילוי ציאנוקסין מהיר ומדויק.אסטרטגיה זו מאפשרת את חקר ציאנובקטריה כביו-אינדיקטור של זיהום, במיוחד באזורים שבהם נוכחות הפריחה קשורה לתהליכי eutrophication ומשמשת לחץ אנתרופוגניים. אסטרטגיה רב-תחומית זו דורשת שילוב של טכניקות, טכנולוגיה ומומחיות שונות בזרימת עבודה ייחודית ליישומה המוצלח. אסטרטגיית הזיהוי המהירה שימושית כדי למנוע בעיות בקהילה בריאות עקב פריחות ציאנובקטריה מזיקות ולנטר אזורים גדולים בזמן קצר.

early-detection-cyanobacterial-blooms-associated-cyanotoxins-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

מקור: צ'פמן, I. J., et al., אופטימיזציה של בדיקה מולקולרית לקביעת תמותת תאים באורגניזם פוטוסינתטי (Microcystis aeruginosa) באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את השיטה להבחנה בין תאי Microcystis aeruginosa חיים ומתים על ידי שילוב של תיוג בדיקה פלואורסצנטית עם ניתוח ציטומטרי זרימה של אוטו-פלואורסצנציה של פיקוציאנין ואות בדיקה.

ניתוח כדאיות של Microcystis aeruginosa באמצעות ציטומטריית זרימה

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי זני ציאנובקטריה בדגימה סביבתית באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים. דגימות הנושאות חיידקים שונים מקיימות אינטראקציה עם נוגדנים מודפסים, והצבעה חיסונית עם נוגדנים אנטי-ציאנובקטריאליים המסומנים כפלואורופורים חושפת את נוכחותם של זנים ציאנובקטריאליים ספציפיים באמצעות פלואורסצנטיות בנקודות שונות.

טכניקה לזיהוי זנים ציאנובקטריאליים באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים

Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).

זיהוי אופטי של א coli חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

פרוטוקול הכולל ריכוז משולב, העשרה וזיהוי קולורימטרי של נקודת קצה של פתוגנים הנישאים במזון בכמויות גדולות של מים חקלאיים מוצג כאן.  המים מסוננים באמצעות Modified Moore Swabs (MMS), מועשרים במדיה סלקטיבית או לא סלקטיבית, והזיהוי מתבצע באמצעות התקנים אנליטיים מבוססי נייר (μPAD) המשובצים במצעים קולורימטריים אינדיקטיביים חיידקיים.

מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

אוכלוסיות חיידקים מכילות ההטרוגניות תא משמעותית, אשר יכול להכתיב התנהגות כוללת. ניתוח בדיקה מולקולרי באמצעות cytometry זרימה יכול לקבוע מדינות פיסיולוגיות של תאים, עם זאת היישום שלה משתנה בין מינים. מחקר זה מספק פרוטוקול לקבוע תמותת תאים בתוך אוכלוסיית cyanobacterium במדויק, בלי להמעיט או הקלטת תוצאות חיוביות שגויות.

מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה (<em&gt; Aeruginosa Microcystis</em&gt;) שימוש cytometry הזרימה

נוכחותם של רעלנים ציאנובקטריאליים במאגרי מים מתוקים למאכל אדם היא דאגה גדולה עבור רשויות ניהול המים. כדי להעריך את הסיכון לזיהום מים, מאמר זה מתאר פרוטוקול לגילוי בשטח של זנים ציאנובקטריאליים בדגימות נוזליות ומוצקות באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים.

פרוטוקול הניסוי לזיהוי כחוליות בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ'יפ Microarray נוגדן

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

סינון פיצול אבחון, מיושם לתוך MZmine, היא גישה אלגנטית, לאחר הרכישה למסך LC-MS/MS datasets עבור מחלקות שלמות של מוצרים טבעיים ידועים ולא ידועים. כלי זה מחפש את MS/MS ספקטרום עבור יוני מוצרים ו/או הפסדים ניטרליים כי האנליסט הגדיר כאבחון עבור המחלקה כולה של תרכובות.

גילוי מוצר טבעי עם סינון פיצול LC-MS/MS: בקשה ניתוח Microcystin

פרוטוקול זה מציג שלבים של ניתוח metabarcoding, מיקוד 16S rRNA ו 18S rRNA גנים, לניטור פריחות אצות מזיקות ואת המיקרוביום הקשורים שלהם בדגימות מי ים. זהו כלי רב עוצמה המבוסס על מולקולות אך דורש מספר הליכים, אשר מוסברים חזותית כאן צעד אחר צעד.

הליך מתוקנן לניטור פריחות אצות מזיקות בצ'ילה על ידי ניתוח Metabarcoding

גלה אסטרטגיית זיהוי מהירה לפריחות ציאנובקטריות וציאנוטוקסינים במים ובמטריצות אורגניות. השיטה משלבת חיישנים מרחוק, רחפנים וניתוח LCMS לזיהוי תוך 24 שעות.

גילוי מוקדם של פריחות ציאנובקטריאליות וציאנוקסינים נלווים באמצעות אסטרטגיית זיהוי מהירה

גלה סרטונים נוספים