מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

פרוטוקול זה יכול לספק מדידות תפוקה גבוהות של אלקטרופיזיולוגיה תאית באופן ההולם את הטכנולוגיה המתפתחת במהירות של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פחות מורכבת ופחות עתירת עבודה מטכניקת מהדק התיקון המסורתית, אך היא מסוגלת לייצר תוצאות שוות ערך. אז ניתן להרחיב את הפרוטוקול הזה לתוכניות סינון רעילות בקנה מידה גדול באמצעות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע אנושיים.

לדוגמה, הבדיקה המקיפה של פרואריתמיה במבחנה. כדי להכין תרביות קרדיומיוציטים שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיים לניסוי, יש לצפות תחילה את החלקות הכיסוי הבודדות של 10 מילימטר זכוכית עגולה מספר אפס עם 150 מיקרוליטר של מטריצת קרום הבסיס של 1:60 בתוך כל באר של צלחת של 24 בארות, ולדגור על החלקות הכיסוי בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. בתום הדגירה, הסר את המטריצה העודפת מהחלקות הכיסוי והחל את נפח התאים המתאים על כל החלקת כיסוי.

לאחר שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס, מלאו בזהירות כל באר במדיום ציפוי והחזירו את הצלחת לחממה. כדי להתכונן להדמיית צבע רגישה למתח, ציידו מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך בעדשת צמצם מספרי גבוה בהגדלה של פי 40, וחברו נורית LED לבנה חמה המתחלפת במהירות ליציאת התאורה המשודרת. הכנס מסנן אדום פשוט של 660 ננומטר לנתיב האור המשודר והרכיב ראש LED מיתוג מהיר של 470 ננומטר להקלטת פוטומטריה.

הכנס מסנן עירור 470/40 ביציאת האפיפלואורסצנציה כדי לנקות את האור שנוצר על ידי ה-LED, והכנס קוביית מיקרוסקופ המכילה מפצל אלומה באורך 495 ננומטר בקרוסלת יחידת המראה בתוך המיקרוסקופ. התקן זרוע גילוי המכילה דיאפרגמת שדה מתכווננת ליציאת תושבת C כדי לאפשר בחירת אזור עניין, וחבר גלאי PMT ומצלמת USB למיקרוסקופ. הכנס קוביית מסנן המכילה מפצל אלומה במעבר ארוך של 565 ננומטר ומסנן פליטה של 535/50 ליציאת PMT כדי לפצל את אור הפליטה בין שני הגלאים.

חבר את ה-PMT לספק-כוח ולמגבר PMT, וחבר את יציאת מגבר ה-PMT לפין כניסה אנלוגי של מערכת קליטת נתונים. כדי לעמוד בקריטריונים של Nyquist ולמנוע כינוי, סנן את הנתונים האנלוגיים מה-PMT בקילו-הרץ אחד ומעלה, ובצע דיגיטציה של הנתונים בתדר שהוא לפחות כפול מהתדר הגבוה ביותר הקיים באות האנלוגי. כדי להעמיס את התאים בצבע רגיש למתח, ערבבו חמישה מיקרוליטרים של 1000x FluoVolt ו-50 מיקרוליטר של תמיסת עומס הספק, והוסיפו שלושה מיקרוליטרים מתמיסת הטעינה המתקבלת לשלושה מיליליטר של תמיסת Tyrode מחוממת בצלחת פטרי.

הוסף לכלי תלוש כיסוי מצופה קרדיומיוציטים שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים יחיד והניח את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. התקן תא הדמיה מחומם של תאים חיים על במת המיקרוסקופ ומלא את התא ב-500 מיקרוליטר של תמיסת Tyrode טרייה. לאחר מכן שטפו את פתק הכיסוי בתמיסת Tyrode טרייה ב-37 מעלות צלזיוס והשתמשו במלקחיים עדינים כדי להעביר בזהירות את החלקת הכיסוי לתא האמבטיה שחומם מראש.

כדי לתקנן את הדינמיקה התאית והפרמטרים הניסיוניים, הכניסו שתי אלקטרודות פלטינה לתא, במרווחים של חמישה מילימטרים זו מזו, וחברו את האלקטרודות לסטימולטור חיצוני. הגדר את הממריץ לפולסים של שדה דו-קוטבי של חמש אלפיות שנייה ב-0.5 הרץ, והגדל את הגירוי מוולט אחד עד שהתאים מתחילים להתכווץ. לאחר מכן הגדר את המתח לכ-25%מעל סף זה.

לרכישת פוטנציאל פעולה אופטית, השתמש בנתיב האור המשודר ובמצלמת ה-USB כדי לדמיין את המיוציטים בתנאי שדה בהיר. בחר תא מבודד והשתמש בסרעפת השדה כדי לחתוך היטב את הנתיב האופטי שלו, ולהבטיח שרק האור מהתא המעניין מנוטר. הפעל את ה-PMT ampחיים יותר והגדר את אספקת ה-PMT ל-750 וולט.

הפעל את פרוטוקול הגירוי יחד עם תוכנת הרכישה תוך הפעלת אור העירור של 470 ננומטר בו-זמנית. הקלט 10 סריקות, כדי להבטיח זיהוי פוטנציאל פעולה יציב. לאחר הסריקה האחרונה, הזיזו מיד את שלב המיקרוסקופ תוך כדי הקלטה כדי לרכוש לזמן קצר אות רקע מאזור נטול תאים ולכבות את אור העירור.

כדי לנתח את נתוני פוטנציאל הפעולה, פתח הקלטה שמורה בתוכנת הניתוח המתאימה וממוצע של 10 סריקות המכילות פוטנציאל פעולה מגורה מתא בודד. הפחיתו את הממוצע של אות הבסיס המייצג היסט פלואורסצנטי מהעקבה הממוצעת, ולאחר מכן השתמש בנוסחה כדי לחשב את השינוי בקרינה באמצעות פלואורסצנציה דיאסטולית כ-F0. זהה את תחומי העניין הדיאסטוליים ופוטנציאל הפעולה ומדוד את הפרמטרים הרצויים של פוטנציאל הפעולה הלבבית, כולל, אך לא רק, משך הזמן ב-50% ו-90% רפולריזציה. לאחר מכן ייצא את הנתונים מתא בודד זה לתוכנית גיליון אלקטרוני.

שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של מכניקת הרפולריזציה, שיכולה לספק תובנות חשובות לגבי חריגות יוניות תאיות. ניתן להבחין במאפייני שלב ראשון בולטים באותות אופטיים מקרדיומיוציטים של עכברים, הנבדלים מבחינה מורפולוגית מאלו של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. בנוסף, קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים מגיבים למניפולציה פרמקולוגית עם ניפדיפין, אנטגוניסט ידוע של תעלת סידן מסוג L.

במהלך יישום רציף של תרופות, נצפתה ירידה של 41.5% משך פוטנציאל הפעולה ב-90% רפולריזציה, מה שמרמז על הפונקציונליות של הדמיה מבוססת אינדיקטור מתח פלואורסצנטי כפלטפורמה למחקרי סינון תרופות לבביות פרוספקטיביות בתפוקה גבוהה. חשוב לזכור שלמרות שהצבע הרגיש למתח המשמש במחקר זה הוא פחות ציטוטוקסי מאחרים, עדיין יש להשתמש באור העירור במשורה כדי לשמר את הכדאיות התאית. ציוד הפוטומטריה המווסת המשמש בפרוטוקול זה הוא רב-תכליתי להפליא.

לדוגמה, ניתן להשתמש בו למדידות בו זמנית של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים אחרים, כגון סידן תוך תאי.