מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה
30 באפריל 2021
בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.
פרוטוקול זה מספק הגדרות ניסוי לביצוע תרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות ניתנות לשליטה במיקרו-מכשירים כדי לדמיין ולנטר שיחות צולבות בין תאים חיסוניים לגידולים ולנתח את ההשפעות של טיפולים אנטי-סרטניים. טכנולוגיה זו מספקת הדמיה קלה בזמן אמת של גיוס תאי חיסון ואינטראקציות וניתן להשתמש בה עבור דגימות אנושיות ומטופלים. זה תואם לרוב המיקרוסקופים החדישים.
המדגימים את ההליך יהיו פרנצ'סקו נוטו, דוקטורנט במחלקה לאונקולוגיה ורפואה מולקולרית, Istituto Superiore di Sanita, וניקולטה מנדוקה ואסתר מקפאו, דוקטורנטיות באוניברסיטה הקתולית דל סקרו קורה, המחלקה לרפואה תרגומית וכירורגיה. שבבים מופעלים בעבר באמצעות פלזמה בחומר ניקוי פלזמה או במכונת חריטת ברזל תגובתית בחדר נקי. תאי טחול מורין וקו תאי גידול משמשים כאן לחיקוי הפרוטוקולים המתוארים בטקסט.
לפני טעינת מתלי תאים, משוך מדיה מכל ששת המאגרים. ואז לאט לטעון 1 x 10 לתאי הגידול 5 resuspended ב 10 עד 50 מיקרוליטר של מדיום צמיחה במאגר השמאלי העליון ואת הבאר התחתונה. בצד ימין, פיפטה עדינה 1 x 10 לתאי החיסון הצפים 6 מרחפים מחדש ב 50 מיקרוליטר של מדיום צמיחה לתוך שתי בארות.
לאחר הוספת כל התאים, מלאו את כל ששת המאגרים של כל שבב בעד 100 עד 150 מיקרוליטר של מדיום גידול ובדקו שהתאים פוזרו כראוי בתוך כל תא תרבית. דגרו על השבב למשך שעה אחת כדי לאפשר למערכת להתייצב לפני ההקלטה בהילוך מהיר. להדמיית תאים חיים, הרכיבו את החיסון של הגידול על לוחית השבב בשלב המיקרוסקופ.
התאם אישית את הגדרת זרימת העבודה של הרכישה בממשק תוכנת המיקרוסקופ, כגון תוכנת Incucyte Live-Cell Analysis Software. בחר חלונות תצפית, קצב המסגרות האופטימלי ומשך הזמן, בהתאם לפרמטרים המתאימים לניסוי ולסוגי התאים הנחקרים. דמיינו את התאים לפרק הזמן המתאים לניסוי.
הכינו שני אליציטוטים של מטריג'ל מדולל במדיום המכיל תרופה או שילוב של תרופות לשני תנאי הניסוי באמצעות קצוות קרים. תאי גידול מוכתמים בצבע פלואורסצנטי התלויים בעדינות בפיפטה, התלויים בתמיסת מטריצה על קרח כדי להשיג פיזור הומוגני של התאים. עם צלחת השבב על בלוק קירור או על סל עם קרח, להזריק לאט את תמיסת מטריצת תאי הגידול שטופלה בתרופה לתוך יציאות הג'ל השמאלי והימני באמצעות קצוות מיקרופיפטה קרים של 10 מיקרוליטר.
הפעל לחץ עדין כדי לדחוף את תמיסת המטריצה מצד אחד של הערוץ לצד השני. כאשר כל תאי הגידול הועמסו, הניחו את המכשיר באינקובטור במצב זקוף למשך 30 דקות. בתום הדגירה, לאחר השלמת ג'לציית המטריצה, ממלאים את התעלות הבינוניות של כל ששת המאגרים ב-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית.
בדוק את שלמות הג'ל הפולימרי ואת פיזור תאי הגידול תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן מניחים את השבבים באינקובטור עד להשלמת הכנת תאי החיסון. לאחר הדגירה, שואפים את המדיום מכל באר.
הניחו את הקצה ליד פתח התעלה האמצעית והשתמשו בלחץ מתון כדי להזריק בעדינות 10 מיקרוליטר של 10 לתאי החיסון ה-6 המסומנים בצבע פלואורסצנטי מנוגד. הזריקו 50 עד 100 מיקרוליטר של התווך לכל אחת מארבע הבארות של התעלות הרוחביות, 40 עד 90 מיקרוליטר של התווך לתוך הבאר המרכזית העליונה, ו-50 עד 100 מיקרוליטר של התווך לתוך הבאר המרכזית התחתונה. כאשר כל הבארות הועמסו, השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר כי התפלגות תאי החיסון נותרה מוגבלת לחדר המרכזי.
לאחר מכן הניחו בזהירות את המכשיר על משטח ישר באינקובטור תרבית התא עד להדמיה. כדי לחשב את היקף תאי החיסון החיים המוכתמים בפלואורסצנטיות החודרים לתאי הגידול, צלם את המכשיר בנקודות זמן ספציפיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי והגדר את פרמטרי המצלמה המתאימים בתוכנת ההדמיה של המיקרוסקופ, כגון Nikon NIS-Elements. כמו כן, הגדר את הפרמטרים עבור תאים חיסוניים מסומנים.
ניתן לעקוב אחר תנועתם של לויקוציטים דרך גשרים מיקרו-ערוציים בנויים כראוי בפלטפורמה המיקרופלואידית לעבר תאי המטרה שלהם באמצעות מיקרוסקופ וידאו. בניתוח מעקב זה, PBMCs בודדים אותגרו עם תאים סרטניים גוססים שטופלו בדוקסורוביצין או חיים שטופלו ב- PBS. ערכי כימוטקסיס רלוונטיים וחלקות נדידה נוצרו באופן אוטומטי, ופרופיל נדידה שונה עבור תאי החיסון נצפה כאשר הם עמוסים יחד עם תאי סרטן השד שנחשפו לדוקסורוביצין או PBS.
כאשר ה-PBMCs נתקלו בתאי סרטן אפופטוטיים, הם חצו מיקרו-ערוצים לעבר התאים הגוועים והמתים, אך לא חצו לתאים חיים ולא מטופלים. חלק קטן של לויקוציטים עם צפיפות גוברת במשך 24 עד 48 שעות הציגו מגעים ארוכי טווח עם תאים סרטניים שטופלו בדוקסו. בניתוח זה, מודל גידול חיסוני תלת-ממדי חדש שימש לכימות גיוס תאי חיסון בתגובה לשילובים אנטי-סרטניים של תרופות אפיגנטיות.
PBMCs המסומנים בצבע אדום הופצו לאחר מכן בצורה הומוגנית לתוך תא הנוזל המרכזי. לאחר מכן הושוותה היכולת של שתי מסות הגידול למשוך את ה-PBMCs, כאשר ה-PBMCs גויסו בניסוי זה למיקרו-ערוץ הימני. עבור מודל 3D, לערבב את הפתרון עם הידרוג'ל ותאים על קרח, הימנעות בועות טרום פילמור.
הזריקו אותו לאט ללא לחץ מוגזם. כוונן את שלבי הפילמור בהתאם למטריצה בה נעשה שימוש. ניתן ליישם בדיקות תאים חיים/מתים ופרופיל הפרשת ציטוקינים מסופרנאטנטים.
ניתן לבצע אימונופלואורסנציה להדמיה קונפוקלית כדי לסווג תת-סוגים חיסוניים ולסמני ביטוי של הפעלה והבשלת תשישות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את השימוש במכשירים מיקרופלואידיים לתרביות שיתוף (co-cultures) בדו-ממד (2D) ובתלת-ממד (3D), במטרה לחקור אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון ולהעריך טיפולים אנטי-סרטניים. השימוש במכשירים אלו מאפשר ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקת תאי חיסון, והוא מתאים לדגימות אנושיות וכן לדגימות המופקות מחולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הסרטן
- אימונותרפיה
- מיקרופלואידיקה
רקע
- הבנת האינטראקציות בין הגידול למערכת החיסון היא קריטית לפיתוח טיפולים יעילים בסרטן.
- לשיטות הנוכחיות חסרה היכולת לנטר אינטראקציות אלו באופן דינמי ובעל רלוונטיות מרחבית.
- תרביות השתלה מיקרופלואידיות (Microfluidic co-cultures) מספקות סביבה מבוקרת לחקר אינטראקציות אלו.
- ניתן להתאים את הפרוטוקולים לסוגי תאים שונים, כולל דגימות המופקות מחולים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקולים לתרביות משותפות (co-cultures) של גידולים ותאי מערכת החיסון בדו-ממד (2D) ובתלת-ממד (3D).
- מתן אפשרות לניטור דינמי של אינטראקציות תאיות ותגובות לטיפולים.
- סיוע בחקר גיוס תאי מערכת החיסון בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התקני מיקרופלואידיקה למערכי תרבית משותפת (co-culture).
- טכניקות ויזואליזציה התואמות למיקרוסקופיה מתקדמת.
- שימוש בתאי טחול של עכבר ובקווי תאי גידול למודלים ניסיוניים.
- הפעלה בפלזמה של שבבים לשיפור היצמדות תאים.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של תרביות משותפות (co-cultures) הניתנות לבקרה בפורמטים של 2D ו-3D.
- ניטור בזמן אמת של אינטראקציות בין תאי מערכת החיסון לתאי גידול.
- הוכחת יעילותם של טיפולים נגד סרטן במערכת התרבית המשותפת.
- תאימות לטכניקות מיקרוסקופיה שונות המשפרת את איסוף הנתונים.
מסקנות
- הפרוטוקולים שפותחו מספקים פלטפורמה חסונה לחקר אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון.
- ויזואליזציה בזמן אמת מסייעת בהבנת הדינמיקה של תגובות חיסוניות.
- גישה זו יכולה לתרום באופן משמעותי למחקר הסרטן ולפיתוח טיפולים.
שאלות נשאלות שכיחית
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של תרבית משותפת (co-culture) במיקרופלואידיקה מאפשרים ניתוח מדויק של האינטראקציה בין הגידול למערכת החיסון תחת מעקב חיסוני המושרה על ידי טיפול, ובכך מספקים תובנות מעשיות לתיקוף מטרות והפחתת סיכונים מנגנוניים בתהליך גילוי תרופות אונקולוגיות. באמצעות שחזור של השפע ההדדי הדו-כיווני בין הגידול למארח בפורמטים נשלטים של 2D ו-3D, פלטפורמות אלו תומכות בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים ומסייעות בתעדוף תיקי פיתוח באמצעות פרמטרים כמותיים של תאי חיסון. השילוב עם דימוי תוכן גבוה של תאים חיים ואנליטיקה מבוססת AI ממצב גישה זו כיכולת ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר לגילוי ביומרקרים טרנסלציונליים ובדיקת טיפולים משולבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזה טיפולית באמצעות ויזואליזציה של גיוס והפעלה של תאי מערכת החיסון בתגובה למשרה מוות תאי אימונוגני.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרה באמצעות ניטור בזמן אמת של נדידת לוקוציטים ודינמיקת אינטראקציות.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות דפוסי חדירה חיסונית תחת אסטרטגיות טיפוליות משולבות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך תהליכי עבודה המשכיים, על ידי יצירת סביבות מיקרו של גידול-מערכת חיסון הניתנות לשחזור.
- ערך תפעולי: מענה לסטנדרטיזציה של בדיקות וליכולת הרחבה באמצעות פורמטים של מיקרו-מכשירים שניתן לשלוט בהם ותואמים להדמיה בעלת תוכן גבוה.
- מוכנות לסריקה: הדגשת פלטים כמותיים, כגון נדידה של תאי חיסון, אינטראקציה ותגובה לסוכנים טיפוליים, לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה על ידי מידול ההטרוגניות והפלסטיות של תתי-סוגים של תאי סרטן, תאי סטרומה ותאי מערכת החיסון כמניעים של התפתחות הסרטן.
- הלימה פרה-קלינית: מתאר המשכיות משלב הגילוי דרך תיקוף פרה-קליני באמצעות ניטור תצלומי פלואורסצנציה למשך עד 72 h.
- קידום מותאם סיכונים: עוסק בהלימה של ביומרקרים באמצעות אימונופלואורסצנציה לסיווג תתי-סוגים חיסוניים וביטוי של סמני הפעלה/תשישות.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו, הממוקמת ברצף הגילוי החל משלב הגילוי המוקדם (Early Discovery), דרך זיהוי מובילים (Lead Identification) ועד לעבודה פרה-קלינית, תומכת בבדיקת השערות, הבהרת מסלולים וצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה דינמית של אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון.
- ביולוגיה של הגילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות על ידי ויזואליזציה של crosstalk בין תאי גידול נצמדים לאוכלוסיות תאי חיסון צפים בתנאים טבעיים ובתנאים המושרים על ידי טיפול.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות ויזואליזציה קלה ובזמן אמת של גיוס תאי חיסון ואינטראקציות התואמות למיקרוסקופיות חדישות.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כגון נדידה של תאי חיסון, אינטראקציה ותגובה לסוכנים טיפוליים המופקות באמצעות שלבי עיבוד תמונה כדי לאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה להמשכיות פרה-קלינית באמצעות מיקרו-סביבות גידול-חיסון בתלת-ממד המורכבות במבנה תחרותי להערכת אסטרטגיות טיפול משולבות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, בשל יכולת ההסתגלות שלה לסימולציה של מורכבות ה-TME הכוללת סוגי תתי-תאים שונים ואינטראקציות הדדיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית באינטראקציה שבין הגידול למערכת החיסון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה (scalability) של מערכי תרבית משותפת (co-culture) במכשירים מיקרופלואידיים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפקת פרמטרים כמותיים של תאי חיסון.
- השפעה על תיק הפיתוח (Portfolio): תעדוף וקבלת החלטות על קידום הפיתוח מותאמים לסיכון, בהסתמך על ניטור התסננות חיסונית דיפרנציאלית תחת טיפולים נגד סרטן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בטיפול בהתקני מיקרופלואידיקה, בטכניקות של תרבית תאים ובניתוח תמונות מבוסס מיקרוסקופיה.
- הצרכים בתחומי המכשור והתשתית האנליטית כוללים ציוד להפעלת פלזמה, מיקרוסקופים התומכים בדימוי time-lapse בשדה בהיר ובפלואורסצנציה, ותוכנה ליצירת גרפי chemotaxis ומגירה.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים כוללות הקפדה על הפרוטוקול בהכנת השבב, בהליכי טעינת תאים ובשלבי מילוי המצע, כדי להבטיח פיזור עקבי של תאי מערכת החיסון.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל כוללים כיוונון של שלבי הפולימריזציה בהתאם למטריצה שבה נעשה שימוש, והתאמת פרמטרי ההזרקה של תמיסת המטריצה של תאי גידול שעברו טיפול תרופתי.
- מגבלות מעשיות המגובות בחומרי המקור כוללות את האתגר שבניהול מערכי נתונים אינפורמטיביים גדולים מדימוי high-content של תאים חיים, דבר המצריך צינורות עיבוד מתקדמים לניתוח נתונים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:02
2D Chip Cell Plating
2:10
Unlabeled Cancer and Immune Cell Time-Lapse Acquisition
2:43
3D Immuno-Competent Cancer On-Chip Model
5:15
Results I: Migratory and Interaction Patterns of the 2D Tumor-Immune Cells Co-Culture by Time-Lapse Data Analysis
6:19
Results II: Fluorescent Analysis of Infiltrated Immune Cells in a 3D Tumor Microenvironment
6:56
Conclusion
