Name: קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני על ידי ניטור פנולוגי, האבקות ביד, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג מולקולרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: חקור את דרישות ההאבקה בשזיף יפני באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג PCR. השיטה משלבת גישות שדה ומעבדה לזיהוי מזהמים מתאימים ושיפור היבול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לחקר y Tecnología אגריה y Alimentaria (RFP2015-00015-00 ו RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón – הקרן החברתית האירופית, האיחוד האירופי (Grupo Consolidado A12-17R) ו חונטה דה אקסטרמדורה — פונדו אירופה דה דסארולו אזורי (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero נתמך על ידי מלגה של Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología של מקסיקו (CONACYT, 471839).

1. האבקה ידנית בשטח
<ol><li>
מיצוי אבקה
	<ol>
<li>כדי להשיג אבקה, לאסוף ניצני פרחים בשלב D24, על פי שלב 57 בסולם BBCH25,26. הערה: יותר ניצני פרחים נחוצים בשזיף יפני מאשר במינים אחרים של פרונוס מכיוון שהאנטרים שלהם מייצרים פחות אבקה.</li>
		<li>הסר את anthers באמצעות רשת פלסטיק (2 מ"מ x 2 מ"מ נקבובית גודל) ומניחים אותם על נייר בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות עד anther dehiscence.</li>
		<li>מסננים את גרגרי האבקה דרך רשת עדינה (0.26 מ"מ x 0.26 מ"מ גודל נקבובית), ושמר אותם בצינור זכוכית 10 מ"ל עם מכסה ב 4 °C (4 °F) עד לשימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
האבקה של פרחים מוסרסים
	<ol>
<li>כאשר בין 10%-20% מהפרחים פתוחים, בחר וסמן מספר ענפים. הסר פרחים פתוחים וניצנים צעירים, משאיר רק ניצני פרחים בשלב D24, על פי שלב 57 בסולם BBCH25,26.</li>
		<li>הסר את עלי הכותרת, עלי הכותרת, ואת פסלונים של בין 800 ל 1,000 ניצני פרחים לטיפול עם ציפורניים או פינצטה.</li>
		<li>יד להאביק את pistils בעזרת מברשת צבע בסדר 24 שעות לאחר סירוס. חלק מענפים המכילים מחצית pistils עם אבקה של אותו cultivar, ואת החצי השני עם אבקה תואמת מן cultivar אחרים כמו שליטה. היזהר לא לזהם את קצות האצבעות או מברשת צבע עם גרגרי אבקה מן cultivars אחרים.</li>
		<li>ספירה שבועית שיא של פרחים ופירות מתפתחים כדי לאפיין את דפוס טיפת הפירות ולכמת את הפירות הסופיים שנקבעו בכל טיפול האבקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
האבקה משלימה בתחום
	<ol>
<li>כמה ימים לפני פתיחת הפרחים הראשונים, סגרו עצים נבחרים בכלוב רשת 0.8 מ"מ כדי למנוע הגעת חרקים מאביקים.</li>
		<li>כאשר 10%-20% פרחים פתוחים, בחר וסמן מספר ענפים לטיפול האבקה, ומשאיר 1,000-1,500 פרחים לטיפול.</li>
		<li>למחרת, כאשר פרחים פתוחים, להאביק כל פרח בעזרת מברשת צבע עם אבקה המקבילה (אבקה מאותו cultivar עבור האבקה עצמית, מן cultivars תואם אחרים כמו בקרת האבקה צולבת).</li>
		<li>להאבי כל יומיים עד שכל הפרחים נפתחים.</li>
		<li>ספירה שבועית שיא של פרחים ופיתוח פירות מן anthesis לקצור כדי לאפיין את דפוס טיפת פירות ולכמת פירות סופיים להגדיר בכל טיפול האבקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. האבקות ידניות במעבדה
<ol><li>לאסוף 50-100 פרחים בשלב D24, על פי שלב 57 בסולם BBCH25,26.</li>
	<li>במעבדה, לסרס 30 פרחים לטיפול (האבקה עצמית והצלבה). הערה: יש להמשיך את הסירס בקפידה כדי למנוע נזק על הממסלולים.</li>
	<li>לעשות חתך טרי על הבסיס של כל פדיקור פרח מתחת למים לפני הנחת אותו על חתיכת קצף פרחים רטוב (חתיכה אחת של קצף עבור כל טיפול האבקה).</li>
	<li>יד להאביק כל pistil 24 שעות מאוחר יותר באמצעות מברשת צבע בסדר עם אבקה שנאספה בעבר (ראה סעיף 1.1). להאביק קבוצה אחת של pistils עם אבקה מאותו cultivar, והשני להגדיר עם אבקה מן cultivar תואם כמו שליטה.</li>
	<li>השאירו את pistils מואבק 72 שעות לאחר האבקה בטמפרטורת החדר. הקצף הפרחוני צריך להיות רטוב ללא הרף עם מים.</li>
	<li>תקן את pistils בתמיסה קבועה של אתנול / חומצה אצטית (3:1) לפחות 24 שעות ב 4 °C (70 °F). החלף את הקיבעון עם 75% אתנול. ניתן לשמר דגימות בפתרון זה ב 4 °C (5 °F) עד לשימוש27° הערה: ודא שהדגימות שקועות לחלוטין בפתרון.</li>
</ol>3. תצפיות מיקרוסקופיות
<ol><li>
הערכה של נביטת אבקה במבחנה
	<ol>
<li>כדי לפרט נביטת אבקה בינונית, להמיס 25 גרם של סוכרוז על 250 מ"ל של מים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף 0.075 גרם של סידן חנקתי [Ca(NO3)2] ו 0.075 גרם של חומצה בורית (H3BO3).</li>
		<li>מוסיפים 2 גרם אגר לתמיסה ומערבבים עד להמסה מוחלטתשל 28.</li>
		<li>כדי לעקר את המדיום, autoclave אותו ב 120 °C (70 °F) במשך 20 דקות. מצננים את המדיום, ולפני שהוא מתמצק, מפיצים 3 מ"ל לכל צלחת פטרי סטרילית (55 מ"מ x 12 מ"מ) במכסה זרימה למינאר סטרילי. לאחר התגבשות בינונית, יש לשמר את כלי הפטרי עטופים בנייר אלומיניום ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.</li>
		<li>להפיץ את האבקה של כל cultivar שימש בעבר כתורם אבקה בהאבקות מבוקרות בשתי מנות פטרי ודגרה אותם ב 25 °C (24 °F) במשך 24 שעות. הערה: ניתן לצפות במדיה התרבותית המחוסנת במיקרוסקופיה מיד לאחר או לאחסן ב- -20 °C (70 °F). לשם כך, יש להחליף את מנות הפטרי מהמקפיא למקרר 24 שעות לפני תצפיות מיקרוסקופיות.</li>
		<li>כדי לצפות גרגרי האבקה, להכין 1% (v/ v) פתרון כחול אנילין כי מכתים callose. ראשית, להכין 0.1 N אשלגן פוספט טריבסיק (K3PO4)פתרון על ידי המסת 7.97 גרם של K3PO4 ב 1,000 מ"ל של מים מזוקקים. כדי לפרט את הפתרון הכחול 1% (v/v), להמיס 1 מ"ל של כחול אנילין ב 100 מ"ל של 0.1 N K3PO4.</li>
		<li>הוסיפו 2-3 טיפות של תמיסה כחולה אנילין לכל צלחת צלחת פטרי ושימו לב לאחר 5 דקות תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות UV באמצעות מסנן exciter BP340-390 ומסנן מחסום LP425. ספירת גרגרי אבקה בני קיימא ולא ברי קיימא בשלושה שדות לכל צלחת, כל שדה המכיל 100-200 גרגרי אבקה, בשתי מנות פטרי לכל כת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צמיחת צינור אבקה
	<ol>
<li>לשטוף את pistils קבוע עם מים מזוקקים שלוש פעמים (1 שעות כל אחד, 3 שעות בסך הכל) ולהעביר ל 5% (w / v) נתרן סולפיט (Na2SO3) ב 4 °C (24 °F) עבור 24 שעות. כדי להכין את הפתרון הזה, להמיס 5 גרם של נתרן סולפיט ב 100 מ"ל של מים מזוקקים.</li>
		<li>אוטומטית לכלוך את pistils ב 120 °C במשך 8 דקות ב 5% (w /v) נתרן סולפיט כדי לרכך את הרקמות.</li>
		<li>סקווש מרוכך pistils בירידה של 1% (v /v) פתרון כחול אנילין תחת כיסוי על שקופית כדי להכתים callose.</li>
		<li>צפה צמיחת צינור אבקה לאורך הסגנון תחת מיקרוסקופ עם אפיפלואורסצנטיות UV באמצעות מסנן exciter BP340-390 ומסנן מחסום LP425.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. קביעת יחסי אי-תאימות
<ol><li>הפקת דנ"א מהעלים<ol>
<li>כדי לחלץ דנ"א, אספו 3-4 עלים צעירים מכל כת בשטח, רצוי באביב. הערה: DNA יכול גם להיות מופק עלים בוגרים, אבל DNA של עלים צעירים יש פחות תרכובות פנוליות.</li>
		<li>לבודד DNA באמצעות ערכה מסחרית ולעקוב אחר ערכת הפרוטוקול שסופקה (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לכמת את ריכוז ה- DNA ולהעריך את איכות ה- DNA של כל דגימה ב 260 ננומטר בספקטרופוטומטר מיקרו-Vis מיקרו-וויס. התאם את ריכוז הדנ"א ל-10 ננוגרם/מיקרו-אל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תנאי PCR להגברת קטעים<ol>
<li>תווית 0.2 mL PCR צינורות וכובעים.</li>
		<li>הכן את ריאגנטים PCR על פי טבלה 1 ולתת להם להפשיר על קרח.</li>
		<li>הגדר נפח של תמהיל מאסטר של כל זוג פריימרים במיקרו-Tube של 1.5 מ"ל בהתאם למספר התגובות בתוספת 10% של עודף, בהתחשב בנפח של 16 μL לכל תגובה. מוסיפים את ריאגנטים לאחר הסדר בטבלה 1 ומערבבים היטב.</li>
		<li>Aliquot 16 μL של תערובת מאסטר לתוך כל צינור PCR 0.2 מ"ל המכיל 4 μL של תבנית DNA או 4 μL של מים מזוקקים מעוקרים כמו שליטה שלילית (C-). השתמש בדנ"א של cultivars עם גנוטיפ ידוע כמו פקדים חיוביים. מערבבים בעדינות, סוגרים את צינורות התגובה עם הכובעים, וצנטריפוגטה ב 2,000 x g עבור 30 s כדי לאסוף את כל הנפח בתחתית צינור התגובה.</li>
		<li>מקם את צינורות התגובה בתרמוציקלר והגדיר את תוכנית ה- PCR באמצעות פרופיל הטמפרטורה הבא: שלב ראשוני של 3 דקות ב 94 °C (74 °F), 35 מחזורים של 1 דקות ב 94 °C (54 °F), 1 דקות ב 56 °C (56 °F) ו 3 דקות ב 72 °C (72 °F), וצעד סופי של 7 דקות ב 72 °C(72 °F) 20°C ..</li>
	</ol>
</li>
	<li>אלקטרופורזה והערכה של גודל שבר<ol>
<li>כדי להכין 1.7% (w/v) ג'ל מיני אגרוז, להמיס 0.68 גרם של אגרוז ו 40 מ"ל של 1x TBE חוצץ לתוך בקבוק 100 מ"ל ארלנמאייר. להמיס את הפתרון על ידי חימום במיקרוגל ב 600 W במרווחים של 30 שניות כדי למנוע רותחים.</li>
		<li>תן את הפתרון להישאר על הספסל כדי להתקרר, ולאחר מכן להוסיף 3.5 μL של תמיסת כתמי חומצה גרעין.</li>
		<li>מניחים את מגש הג'ל לתוך דוכן הליהוק ומכניסים את המסרק הנבחר לתבנית הג'ל. הקפד לקבל מספיק בארות עבור כל מוצר PCR וסולם DNA.</li>
		<li>יוצקים את תמסת אגרוז לתבנית הג'ל ומניחים לה להתקרר עד פילמור. הסר את המסרק של ג'ל פולימרי. מניחים את הג'ל במערכת אלקטרופורזה אופקית המכילה מספיק חיץ TBE 1x כדי לכסות את פני השטח של הג'ל.</li>
		<li>טען את בארות הראשון והאחרון עם 2 μL של סולם משקל מולקולרי DNA (1 kb סולם DNA). לטעון 3 μL של כל מוצר של PCR בבארות האחרות. סגור את התא, הפעל את הכוח, והפעל את הג'ל ב 100 V במשך 30 דקות.</li>
		<li>שימו לב לג'ל תחת אור UV באמצעות מערכת תיעוד ג'ל. השתמש בסולם המשקל המולקולרי של ה- DNA כדי לקבוע את גודל השבר המוגבר ולהשוות אותו עם הפקדים החיוביים על מנת לזהות את אללים המתאימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ניטור תאריכי פרחים
<ol><li>לפקח על הפנולוגיה של עצים שונים של כל cultivar בפריחה על פני שנים שונות. לקבוע את אורך תקופת הפריחה מהראשון (כ -5%) עד הפרחים הפתוחים האחרונים (כ -95%). פריחה מלאה נחשבת כאשר לפחות 50% מהפרחים נמצאים בשלב F24, על פי שלב 65 בסולם BBCH25,26.</li>
	<li>כדי להשוות את תאריכי הפריחה של cultivars בין תואם ולקבוע את אלה חופפים בזמן הפריחה מדי שנה, לפרט לוח שנה של זמני פריחה עם נתונים ממספר שנים.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המתודולוגיה המתוארת כאן לדרישות האבקה של פולחנים שזיפים יפניים דורשת קביעת התאימות העצמית של כל כת על ידי האבקות מבוקרות בתחום או במעבדה, ותצפית לאחר מכן של צמיחת צינור אבקה עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מערכות היחסים של אי-תאימות נוצרות על ידי אפיון של S-alleles על ידי genotyping מולקולרי. לבסוף, הבחירה של מאביקים מבוצע על ידי פנולוגיית ניטור כדי לזהות את אלה cultivars כי בקנה אחד עם פריחה מדי שנה.
קביעת דרישות האבקה בכתות שזיפים יפניות חדשות הופכת לחשובה יותר ויותר בשל המספר הגבוה של...

שזיף יפני(פרונוס סליצילינה לינדל) הוא יליד סין1. במאה ה -19, יבול זה הוצג מיפן לארצות הברית, שם הוא היה שזור עם שזיפים דיפלואידים אחרים בצפון אמריקה2. במאהה-20, חלק מההיברידים האלה התפשטו לאזורים ממוזגים ברחבי העולם. כיום, המונח "שזיף יפני" מתייחס למגוון רחב של היברידיות בין-מיניות שמקורן בצלבים בין P. salicina המקורי עם עד 15 פרונוס דיפלואידים אחרים עמ'3,4,5.
שזיף יפני, כמו מינים אחרים של משפחת Rosaceae, מציג Gametophytic עצמית אי תאימות (GSI), אשר נשלט על ידי אחד מאוד polymorphic S- לוקוס המכיל אללים מרובים6. ה- S-לוקוסמכיל שני גנים המקודדים ריבונוקלאז(S-RNase)המתבטא בפסטיל, וחלבון F-box (SFB) המתבטא בגרגר האבקה7. בתגובת אי הכשירות העצמית, כאשר S-allele לידי ביטוי גרגר האבקה (הפלואיד) זהה לאחד מהשניים המבוטאים ב pistil (diploid), הצמיחה של צינור האבקה על פני הסגנון נעצר עקב השפלה של צינור האבקה RNA על ידי הפעולה של S-RNase8. מאז תהליך זה מונע הפריה של gametophyte הנשי בovule, GSI מקדם את outcrossing בין cultivars.
למרות שחלק מכת השזיפים היפנית תואמת את עצמה, רוב הפולחנים הגדלים כיום אינם תואמים את עצמם, והם זקוקים לאבקה מתורמים בין-תואמים כדי להפרות את הפרחים שלהם3. במיני פרי אבן מסוג פרונוס כגוןשקדים 9, משמש10,11,12 ודובדבן מתוק13, דרישות האבקה של cultivars ניתן לקבוע על ידי גישות שונות. תאימות עצמית (in) יכולה להיקבע על ידי האבקה עצמית של פרחים בשטח וניטור לאחר מכן של ערכת פירות, או על ידי האבקה עצמית של חצי ויוו בתנאים מבוקרים במעבדה ותצפית של צינורות אבקה מתחת למיקרוסקופ14,15,16,17,18 . יחסי אי התאמה בין cultivars ניתן לקבוע על ידי האבקות צולבות בתחום או במעבדה באמצעות אבקה של cultivar מאביקים פוטנציאליים, ועל ידי זיהוי S-alleles של כל cultivar על ידי ניתוח PCR14,15,16,19,20,21,22 . במינים כגון דובדבן מתוק או שקדים, התאימות העצמית (in)ניתן להעריך גם על ידי זיהוי של אלס S מסוים הקשורים לתאימות עצמית, כמו S4' בדובדבן מתוק13 או Sf בשקדים23.
מספר תוכניות גידול שזיפים מהמדינות המייצרות העיקריות משחררות מספר cultivarsחדשים 2,14, רבים מהם עם דרישות האבקה לא ידועות. בעבודה זו, מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת. תאימות עצמית נקבעת על ידי האבקה עצמית הן בתחום והן במעבדה, ואחריהן תצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית הפלואורסצנטיות. מבחר של cultivars מאביקים משלב את הזיהוי של S-genotypes על ידי ניתוח PCR עם ניטור של זמן פריחה בתחום.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית קרחון</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>כחול אנילין</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית (H3BO4)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>סידן חנקתי 4-הידרט (Ca(NO3)2 &middot; 4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 מ"מ x 60 מ"מ</td></tr><tr><td>הדמיית מצלמה</td><td>דיגיטלית Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>חבילת תוכנה למצלמה</td><td>דיגיטלית Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 מ"מ כל אחד</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA פולימראז</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 96&deg;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA 1Kb (פטנט ארה"ב מס' 4.403.036) (500pb-12Kb)</td> <td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>גודל: 250 ומיקרו; g; Conc: 1.0 ומיקרו; g/&micro; l</td></tr><tr><td>מערכת תיעוד ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>מונה יד</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab תוכנה</td><td>Bio-Rad מערכת ניתוח תמונות Bio-Rad</td><td></td><td>למערכת תיעוד ג'ל</td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ עם UV Epiflurescence</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Exciter filter BP340-390, מסנן מחסום LP425</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 מ"מ x 76 מ"מ</td></tr><tr><td>מיני מערכת אלקטרופורזה</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 מ"מ x 14 מ"מ</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט Tribasic (K3PO4&middot; 1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>פריימר קדימה 'Pru C2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer קדימה Pru T2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer הפוך 'PCER'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe תמיסת צביעת חומצות גרעין</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סולפיט נטול מים (Na2SO3)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Speedtools ערכת מיצוי DNA צמחי</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Autoclave Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני על ידי ניטור פנולוגי, האבקות ביד, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג מולקולרי

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

פולחן השזיפים היפני שגודל בדרך כלל הוא בני כלאיים בין-מיניים שמקורם בצלבים בין סליצ'ינה פרונוס המקורית לבין מינים אחרים של פרונוס. רוב ההיברידים מפגינים אי-תאימות עצמית משחקטופיטית, הנשלטת על ידי S-לוקוס יחיד ופולימורפי מאוד המכיל אללים מרובים. רוב ההיברידים המעובדים אינם תואמים את עצמם וצריכים אבקה מתורם תואם כדי להפרות את הפרחים שלהם. קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני הופכת חשובה יותר ויותר בשל המספר הגבוה של cultivars חדשים עם דרישות האבקה לא ידועות. בעבודה זו, מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת. התאימות העצמית נקבעת על ידי האבקות ידניות הן בתחום והן במעבדה, ולאחר מכן ניטור התארכות צינור האבקה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, וגם ניטור התבגרות פירות בתחום. מבחר של cultivars מאביקים מוערך על ידי שילוב זיהוי של S-genotypes על ידי ניתוח PCR עם ניטור של זמן פריחה בתחום. הכרת דרישות ההאבקה של cultivars מקלה על בחירת cultivars לעיצוב פרדסים חדשים ומאפשרת גילוי מוקדם של בעיות פרודוקטיביות הקשורות עם חוסר האבקה בפרדסים מבוססים.

כל ניצן פרח שזיף יפני מכיל תפרחת עם 1-3 פרחים. כמו במיני פרי אבן אחרים, כל פרח מורכב מארבעה פרחים: קרפל, פסלנים, עלי כותרת וספלים, אשר מותכים ויוצרים בבסיס הפרח. מבני הפרחים קטנים יותר מפירות אבן אחרים, עם פסטיל קצר ושברירי מוקף אבקנים המכילים כמות קטנה של גרגרי אבקה. בפריחה מלאה, הפרחים של כל תפרחת מופיעים מופרדים על גבעולים קצרים, ומציגים את עלי הכותרת הלבנים היוצרים בלון מוקף בפתחים הירוקים (שלב D, 57 BBCH) (איור 1A) בימים שלפני ההאנסה. הפרח פתוח במלואו בהנסתזה, ומציג את האנת'ים ואת המסלו...

מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת, המשלבת האבקות שדה ומעבדות ותצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות עם זיהוי של S-genotypes על ידי PCR וניטור הפריחה לבחירת מאביקים.

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

פרוטוקול זה הופך חשוב יותר ויותר בשל המספר הגבוה של זני שזיפים יפניים חדשים שאינם תואמים לעצמם עם דרישות האבקה לא ידועות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לקבוע את דרישות ההאבקה של זנים על ידי שילוב של שתי גישות משלימות בתנאי שדה ומעבדה. ניתן ליישם גישה זו גם כדי לקבוע דרישות האבקה ומיני עצי פרי אחרים שאינם תואמים לעצמם כמו משמש או דובדבן מתוק.לצורך מיצוי אבקה, אסוף ניצני פרחים בשלב הבלון לפי שלב 57 בסולם BBCH. מסירים את האנתרים בעזרת רשת פלסטיק ומניחים אותם על נייר בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות עד להתפרקות. מסננים את גרגרי האבקה דרך רשת דקה ושומרים אותם בצינור זכוכית של 10 מילימטר עם מכסה בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש.כאשר 10 עד 20% מהפרחים פתוחים, בחר ותייג מספר ענפים, והשאיר 1,000 עד 1,500 פרחים בכל טיפול האבקה. למחרת, כאשר פרחים נוספים פתוחים, האבקה של כל פרח באמצעות מכחול עם אבקה מאותו זן להאבקה עצמית ואבקה מזנים אחרים כבקרת האבקה צולבת. האבקה כל יום עד שכל הפרחים פתוחים.רשום ספירה שבועית של פרחים ופירות מתפתחים מהאנתזה ועד הקציר כדי לאפיין את דפוס טיפת הפירות ולכמת את ערכת הפירות הסופית בכל טיפול האבקה. אספו 50 עד 100 פרחים בשלב הבלון לפי שלב 57 בסולם BBCH. יש להוציא 30 פרחים בכל טיפול במעבדה להאבקה עצמית והצלבה.ערוך חתך טרי על בסיס כל פדיקל פרח מתחת למים והניח אותו על חתיכת קצף פרחים רטוב. השתמש בחתיכת קצף אחת לכל טיפול האבקה. לאחר 24 שעות, יש להאביק ידנית כל עלי עם האבקה שנאספה קודם לכן באמצעות מכחול עדין.האבקה קבוצה אחת של סיבים עם אבקה מאותו זן ואת הקבוצה השנייה עם אבקה מזן תואם אחר כבקרה. תקן את הסיבים המואבקים הללו בתמיסה מקבעת של אתנול וחומצה אצטית למשך 24 שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס. מורחים את האבקה של כל זן ששימש בעבר כתורם אבקה בהאבקה בשתי צלחות פטרי ומדגרים אותן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.כדי להתבונן בגרגירי האבקה, הוסף שתיים עד שלוש טיפות של תמיסת אנילין כחולה לכל צלחת פטרי והתבונן בהן תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי UV לאחר חמש דקות. ספרו גרגרי אבקה ברי קיימא ולא ברי קיימא בשלושת השדות לכל צלחת פטרי כאשר כל שדה מכיל כ-100 עד 200 גרגרי אבקה בשתי צלחות פטרי לכל זן. כדי להתבונן בצינורות האבקה, דלעת סיבים מרוככים בטיפה של תמיסה כחולה של 1% אנילין מתחת לזכוכית כיסוי על מגלשה.התבונן בצמיחת צינור האבקה לאורך הסגנון תחת מיקרוסקופ עם אפיפלואורסצנציה UV באמצעות מסנן מעורר BP340-390 ומסנן מחסום LP425. אוספים שלושה עד ארבעה עלים צעירים מכל זן בשדה ומוציאים DNA מהעלים. הגדר תערובת מאסטר לכל זוג פריימרים בצינורות מיקרו של 1.5 מיליליטר.מוסיפים את כל הריאגנטים ומערבבים היטב. יש להוסיף 16 מיקרוליטר של תערובת מאסטר זו לכל צינור PCR של 200 מיקרוליטר המכיל ארבעה מיקרוליטר של תבנית DNA או בקרה. מערבבים אותם בעדינות, סוגרים את הכובעים והצנטריפוגה בחום של 2, 000 פעמים G למשך 30 שניות.הנח את הצינור בתרמו-סייקלר והפעל את תוכנית ה-PCR כפי שהוזכר בכתב היד הטקסטואלי. להערכת גודל השבר על ידי אלקטרופורזה של ג'ל, טען את הבאר הראשונה והאחרונה בשני מיקרוליטר של סולם ה- DNA ושלושה מיקרוליטר של מוצר ה- PCR בבארות האחרות. סגור את החדר והפעל את הג'ל על 100 וולט למשך 30 דקות.התבונן בג'ל תחת אור UV באמצעות מערכת הדמיית ג'ל. השתמש בסולם ה-DNA כדי להעריך את גודל השברים המוגברים ולהשוות אותו עם הבקרות החיוביות והשליליות. לעקוב אחר הפנולוגיה של עצים שונים מכל זן לאורך שנות פריחה שונות.קבע את אורך תקופת הפריחה מהפרחים הפתוחים הראשונים ועד האחרונים. פריחה מלאה נחשבת כאשר לפחות 50% מהפרחים נמצאים בשלב F על פי שלב 65 ב-BBCH. דפוס נשירת הפירות של פרחים שהואבקו ביד לאחר הסרה או האבקה משלימה הראה שרוב הפרחים נשרו שבועיים-שלושה לאחר ההאבקה, אך 4% מהפרחים שהאבקו את עצמם נשארו בעץ, מה שמצביע על כך שזן זה תואם את עצמו.גרגרי אבקה ברי קיימא הראו צינור אבקה ארוך יותר מאורכו לאחר 24 שעות במדיום התרבית וגרגרי אבקה שאינם ברי קיימא לא נבטו. במהלך ההאבקה הועברו גרגרי האבקה לצלקת. כל גרגר אבקה נובט ייצר צינור אבקה, שגדל דרך מבני העלי.בזנים שאינם תואמים את עצמם, צינור האבקה הפסיק לצמוח בשליש העליון של הסגנון. עם זאת, בזנים התואמים לעצמם, צינור האבקה יכול לצמוח דרך הסגנון, להגיע לשחלה ולהפרות ביצית. ניתוח PCR בוצע באמצעות פריימרים מהאזורים השמורים של sRNAs של דובדבן מתוק ושזיף יפני, מה שאפשר לקבוע את גודל אללי ה-S בכל זן.חושב אורך תקופת הפריחה בסך הכל ארבע שנים. הפריחה בתנאי המטע אפשרה לקבוע אילו זנים חופפים בזמן הפריחה בכל שנה. כאשר מנסים פרוטוקול זה, הקפידו להשתמש במספר גבוה יותר של פרחי שזיף יפני להאבקה ידנית מכיוון שאחוז סט הפרי נמוך מאוד בהשוואה למיני שזיפים אחרים.לא ניתן לקבוע אי התאמה עצמית על ידי גישות מולקולריות. נדרשת עבודה נוספת של ריצוף אלל S כדי להעריך אם חלק מהאללים קשורים לתאימות עצמית. השילוב של גישות שדה ומעבדה הביא למידע רב ערך לתכנון מטעים מסחריים חדשים וניתן להשתמש בו במינים אחרים של עצי פרי.

establishing-pollination-requirements-japanese-plum-phenological

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פיתחנו מתודולוגיה לביצוע צלבים בviridis Setaria (ס 'viridis). השיטה כוללת גיזום המכבד לפני טיפול במים חמים כדי להרוג את האבקה ובת קיימא. צלבים מבוצעים הבא משטר צמיחה מבוקרת היטב ובדרך כלל לגרום להתאוששות של 1 עד 7 האבקה צולבת זרע / s לכל מכבד.

שיטות לביצוע צלבים ב<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, מערכת דגם חדש לעשבים

כדי לחשוף את האפקטיביות המאביק של מיני צמחים נתונים, מספר שיטות של ניסויי שדה פותחו. מחקר זה מדגים את השיטות הבסיסיות של ניסויי שדה לאקולוגית אבקה באמצעות מקרה המבחן של Lycoris sanguinea var. Sanguinea ומנגנון אבקת הרומן, אבקה שוברת ניצן.

ניסויי שדה לאקולוגית אבקה: המקרה של<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכפות פורחים עצי מנדרינה בתנאים phytotron. מים הלחץ, עוצמת הארה גבוהה ו- photoperiod האביב מדומה מותר פרחים קיימא כדי להשיגן תוך תקופה קצרה של זמן. מתודולוגיה זו מאפשרת לחוקרים יש מספר תקופות פריחה ב 1 שנה.

פריחה בכפייה בעצים מנדרין בתנאים Phytotron

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

אנו מציגים מתודולוגיה להקמת הצרכים של האבקה של משמש (שזיף armeniaca L.) המשלבים את התאימות העצמית (in) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR.

קביעת יחסי התאימות של העצמי והאינטר-(ב) משמש שילוב יד-האבקה, מיקרוסקופיה וניתוחים גנטיים

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה לקביעת תאימות אבקה ואי התאמה בזני הדרים.

קביעת יחסי תאימות עצמית (In) ותאימות בין (In) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S

כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana מתוארת כאן. השיטה החדשה מציעה רזולוציה גבוהה יותר, אינה פולשנית וניתנת לשחזור רב. הפרוטוקול מהווה כלי חדש לניתוח עדין יותר של התהליכים המווסתים את השלבים המוקדמים של ההאבקה.

בדיקה ביולוגית ברזולוציה גבוהה, מדגן יחיד, In Vivo אבקת הידרציה עבור Arabidopsis thaliana

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

כדי לחקור את מנגנון ניצול השומנים בקרומי שק החלמון בשלבים המאוחרים של התפתחות עוברי העופות, הקמנו מערכת תרבית תאי אפיתל אנדודרמלי עובריים ראשונית של שליו יפני.

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

חקור את דרישות ההאבקה בשזיף יפני באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג PCR. השיטה משלבת גישות שדה ומעבדה לזיהוי מזהמים מתאימים ושיפור היבול.

קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני על ידי ניטור פנולוגי, האבקות ביד, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג מולקולרי

גלה סרטונים נוספים