Name: מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למדו לבנות כלים מותאמים אישית מסיבי Nitinol למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. שיטה זו מאפשרת למדוד בסיס נוקיספטיבי והיפרסנסיטיביות לאחר פציעה ב-Drosophila.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לתומס וואנג על פיתוח אב הטיפוס פון פריי, פטריק ג'יי הואנג על שיפור הבדיקה המכנית, מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה על השליטה (w1118) ו- ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP טסים, וחברי מעבדת גלקו על קריאת כתב היד באופן ביקורתי. עבודה זו נתמכה על ידי R21NS087360 ו R35GM126929 ל MJG.

1. בניית בדיקה מכנית
<ol><li>חותכים כל חוט ניטינול (איור 1B), בניצב לציר הארוך שלו, לאורך שצוין (איור 1M-N) באמצעות חותך תיל קטן (איור 1C). הסיבים מגיעים בשלושה קטרים שונים שנקבעו מראש (איור 1B). הערה: האורכים המפורטים כאן הם מדריך להשגת הלחצים המשוערים שצוינו, באמצעות פרוטוקול דומה לבניית ההר. בסופו של דבר, ללא קשר לאורך חתך הסיבים, ועומק החור בהר, יש למדוד / לכייל את הסיבים על איזון כדי להשיג את ערך הכוח / הלחץ המדויק.</li>
	<li>בדוק את קצה הסיב תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להבטיח שלא יישארו קצוות חדים או לא סדירים מכיוון שאלה עלולים לגרום נזק לרקמות לעור הזחלים ולהפריע לכיול.</li>
	<li>החלק ידנית את הקצוות החדים של הגשושית המכנית באמצעות אבן חידוד עד שלא יימשכו אי-סדרים חדים(איור 1D).</li>
	<li>לעשות חור לקראת הסוף של מקל ארטיק עץ (איור 1E) באמצעות מחט hypodermic (ראה לוח החומרים). הכנס את המחט לפחות באמצע גובה מקל הארטיק (איור 1E). זה יוצר תא להחדרת חוט הניטינול.</li>
	<li>מרחו דבק עץ על חוט ניטינול יחיד (איור 1F)והכניסו את חוט הים מצופה הדבק לחריץ המחט במקל ארטיקמעץ (איור 1G). אפשר להתייבש במשך ~ 5 שעות.</li>
	<li>כייל כל בדיקה מכנית על-ידי לחיצה עליה כנגד סולם עד שהגשושית המכנית תתכופף (איור 1H-L). זוהי הנקודה של כוח מקסימלי שניתן לרשום גרם. בהתאם לקוטרי הסיבים (מוגדרים מראש) והאורכים (שנקבעו על ידי המשתמש) ניתן ליצור מגוון רחב של כוחות ולחצים.</li>
	<li>המר את המסה שנרשמה בשלב 1.6 כדי לכפות במילינוטון (mN) באמצעות הנוסחה f = ma (כוח שווה למסה כפול תאוצה כבידתית). ו: כוח; ז: מסה; a: האצת כבידה (9.8מטר/שניה 2)(איור 1M).</li>
	<li>לבסוף, המר את הכוח המחושב ללחץ (כוח/אזור) בקילפסקאל (kPa) על-ידי חלוקת הכוח הנמדד לפי שטח הפנים של קצה הסיב (איור 1M). כדי לחשב את האזור, להמיר את הקוטר של חוטי nitinol שונים מ אינצ'ים (0.04", 0.06", ו 0.08") לסנטימטרים. לאחר מכן, πr2 (שם, r = רדיוס חוטי הניטינול) קובע את האזור (ראה איור 1M). הכנת בדיקות מרובות באמצעות חוטים בקוטרים ובאורכים שונים תיצור ערכה מלאה המשתרעת על פני טווח התגובה לזחלים של דרוזופילה (ערכת מדגם המוצגת באיור 1N). הערה: בדוק כל בדיקה מכנית לפחות כל 3-4 שבועות. כאשר הלחץ חורג ביותר מ-± 3% מהמדד המקורי, יש לפברק בדיקה מכנית חדשה.</li>
</ol>2. הכנת זחלים
<ol><li>העלה את זן הבקרה(w1118)צאצאי זחלים או זחלים המכילים את הטרנסגנים ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (להדמיית נזק לנוירונים חושיים) על מזון סטנדרטי באינקובטור 25 °C (60 °F). בדרך כלל, מניות נשמרים באופן שגרתי ב 18 °C (69 °F), אבל שני ההורים וצאצאי הזחל גדלים ב 25 °C (69 °F) על מזון קמח תירס סטנדרטי לניסויים. הערה: זבובים בוגרים (חמישה זכרים ועשר נקבות, יחס 1:2) נשמרים בבקבוקוני הזבוב, כדי לאפשר הטלת ביצים, כ-24 שעות. הזמן לאחר הטלת ביצים (AEL) מתחיל ממתי המבוגרים מוסרים.</li>
	<li>לאסוף את הזחלים instar השלישי, לאחר כ 96 שעות של הטלת ביצה, על ידי התזת בעדינות מי ברז לתוך מזון זבוב רך המכיל את הזחלים. זחלים נודדים שעזבו את האוכל, או שהתנצחו על ספירקלים אצטרוריים או אחוריים, גדולים / ישנים מדי לבדיקה זו. זחלי instar השני (~ פחות מ 4 מ"מ אורך) הם קטנים מדי.</li>
	<li>יוצקים את תכולת המזון הזבוב הרך לצלחת פטרי בגודל סטנדרטי נקי (100 מ"מ x 15 מ"מ).</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, מיין כוכב שלישי בינוני, בגודל בינוני, זחלים (ראו איור 2A)מזחלים קטנים יותר (כוכב שני ובכוכב שלישי מוקדם) או זחלים גדולים יותר (כוכב שלישי מאוחר או נודד). מומלץ לבצע מניפולציה עדינה עם מלקחיים כדי למנוע נזק לרקמות לזחלים. הערה: ההעברה באמצעות מלקחיים מבוססת בעיקר על מתח מים ולא על ידי הפעלת לחץ על הזחלים עם להבי המלקחיים. חלופה לשימוש במלקחיים לתמרון זחלים היא מברשות צבע רכות. עם כל אחד מהכלים, המשתמש צריך לתרגל העברת בעלי החיים, כדי לא לגרום נזק לרקמות לא מכוונות שעלול לסבך מדידות התנהגותיות.</li>
	<li>מעבירים את זחלי ה-instar האמצעיים, באמצעות מלקחיים, לצלחת פטרי קטנה (30 מ"מ x 15 מ"מ) המכילה תקע קטן של מזון מעופף לח במים בטמפרטורת החדר. שמור את הזחלים בצלחת פטרי הקטנה עד הניסויים מבוצעים, אבל לא יותר מ 20 דקות. הערה: בדרך כלל, העברת 20-30 זחלים לתקע המזון ייתן מספר הולם במשך 20 דקות של מבחנים התנהגותיים.</li>
</ol>3. מבחני תפיסה מכניים
<ol><li>הנח זחל אינסטאר באמצע השלישי (באמצעות מלקחיים) על משטח דק של ויניל שחור או כהה תחת סטריאומיקרוסקופ שדה בהיר. הצבע הכהה מספק ניגודיות המשפרת את ההדמיה של הזחל. עדיף לקבל חתיכת ויניל כהה מטלטלין בחופשיות כי זה מאפשר למשתמש ליישר את הזחל מבלי לגעת או לפגוע בו.</li>
	<li>שים את אורות הסיבים האופטיים בין עדשות המטרה מיקרוסקופ כרית ויניל שחור או כהה; זה יאפשר תאורת ניגודיות גבוהה נאותה לראיית הזחל.</li>
	<li>השלך זחלים שאינם מפגינים תנועה רגילה לאחר ההעברה לפנקס. אלה יכולים להפריע לתגובה התנהגותית nociceptive נורמלי. לתנועה רגילה, ראה וידאו 1.</li>
	<li>לנגב, באמצעות מגבת נייר, כל מים עודפים המקיפים את הזחל שעלול לגרום הזחל לצוף על כרית ויניל.</li>
	<li>כוון את הזחל על ידי הזזת כרית הויניל הכהה. הראש/הפה של הזחל צריך להצביע שמאלה אם אתה ימני ולהיפך אם אתה שמאלי(איור 2A-B).</li>
	<li>החל את החללית המכנית שנבחרה, בדרך כלל עבור 1-2 שניות, על הצד הגבי האחורי של הזחל בחלק הבטן בקירוב A8 (ראה איור 2B),עד שהגשושית מתכופפת ומעוררת את כמות הלחץ שנמדדה קודם לכן (איור 2C). חשוב שהגשוש ילחץ על פני השטח הגביים של הזחל וידחס את הזחלים לתוך הפנקס שמתחת בנקודת המגע של הגשוש. הערה: בנקודת המגע בין קצה חוט הניטינול לבין קוטיקל-אפידרמיס הגב, בדיקות נמוכות מ -2,300 kPa, בעיקר להתכופף מבלי לחדור את הקוטיקל ואת הרקמות הבסיסיות. בדיקות כאלה משפיעות לעתים רחוקות על תמותתהזחלים 4. בלחצים גבוהים יותר (>5,000 kPa) הבדיקות הן להתכופף, מדי פעם, לחדור את הקוטיקל ואת הרקמות הבסיסיות. ניקוב הזחלים פוגע בהישרדות הזחלים4, ואם נצפה, זחלים אלה מושלכים בדרך כלל מניתוח התנהגותי.</li>
	<li>רשום את התגובה ההתנהגותית עבור כל זחל. תגובה nociceptive חיובית (וידאו 2) מצוין אם הזחל מראה גליל שלם של 360 ° לאורך ציר גופו בתוך 3 s. תגובות אחרות (ניסיון להסתובב, זחילה מהירה ומתנועע) נחשבות שליליות לצורך מבחנה זו. הערה: זחלים מגורה עם גירוי מכני subthreshold (200 kPa) לא לעורר את התגובה nociceptive טיפוסי או מתגלגל (וידאו 3). זחלים מסוימים אכן הציגו תגובות מגע מהירות קדימה או קלות כגון שינויים בכיוון התנועה.</li>
	<li>השלך את הזחל והכן את הבא לבדיקה, חוזר על שלבים 3.1 עד 3.7.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1–3.7 עד להגעה למספר הזחלים הרצוי (שלוש עד שש קבוצות של n = 10 זחלים שימשו כאן עבור כל גשוש). הערה: בעת שימוש בבדיקות מכניות בלחץ נמוך יותר (174-462 kPa), הבדיקה תיקח יותר זמן לכל זחל. הסיבה לכך היא כי קצה חוטים ארוכים יותר מתנדנד יותר, מה שהופך אותו קשה יותר לתקוע את הזחל במרכז קטע A8. תרגול הוא הכרחי עם בדיקות אלה.</li>
</ol>4. מיקרוסקופיה קונפוקלית להערכת מורפולוגיה עצבית
<ol><li>מניחים זחל (של גנוטיפ ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP כדי לתייג נוירונים חושיים) מגורה בעבר עם חוט ניטינול לתוך תא האתריזציה בתוך צנצנת קופלין המכיל 10 מ"ל נושא כדור צמר גפן ספוג ~ 1 מ"ל של אתר diethyl. תן לזחל לשבת בתא ~ 5 דקות. הערה: פרוטוקול מפורט לאתריות מסופק במחקר קודם שפורסם על ידי הקבוצה שלנו12.</li>
	<li>שוטפים את הזחל בעדינות מתא האתריזציה לצלחת פטרי קטנה.</li>
	<li>הכינו שקופית מיקרוסקופ אחת, שני כיסויים קטנים (22 x 22 מ"מ) וכיסוי אחד ארוך (22 x 54 מ"מ) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הוסף טיפות קטנות של אתר:פתרון שמן (1:5 יחס של אתר אתיל לתמיסת שמן halocarbon, ראה טבלה של חומרים) לשני קצות השקופית, ולאחר מכן למקם את כיסויים קטנים על גבי טיפות קטנות. סידור זה יוצר פער חלל קטן שבו הזחל יכול להתאים. הערה: לחץ על הכיסויים הקטנים כנגד שקופית המיקרוסקופ עד שיהיה קשה להחליק.</li>
	<li>הוסף כמה טיפות של אתר:פתרון שמן באמצע שקופית המיקרוסקופ ולאחר מכן למקם את הזחל, באמצעות מלקחיים, על מרכז שקופית מיקרוסקופ (בין coverslips קטן). ודא כי הציר הקדמי של הזחל מקביל לצד הקצר של השקופית וכי הצד הגבי פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>מכסים את הזחלים עם כיסוי ארוך ממוקם על גבי הזחל ואת שני כיסויים קטנים יותר. הערה: לחץ בנדיבות על הכיסוי הארוך עד שהזחל כמעט שטוח.</li>
	<li>קטע תמונה A8 של הזחל באמצעות מיקרוסקופ confocal (ראה טבלה של חומרים)באמצעות אורך גל לייזר 488 (GFP). הערה: תמונה הזחל מיד בגלל הרדמה דרך אתר יתפוגג במהירות (~ 5-10 דקות) ואת הזחל יתעורר ולזוז, אשר יסבך הדמיה נוספת.</li>
	<li>לכוד תמונות מחסנית Z ברזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים באמצעות צמצם מספרי 20x (NA) 0.7 עדשה אובייקטיבית יבשה בזום 1x, גודל צעד של 1.5 מיקרומטר.</li>
</ol>5. כמות של נזק לרקמות
<ol><li>אסוף והמר את תמונות הערימה מסדרת Z, מסעיף 4.8, להקרנת Z יחידה (שיטוח של תמונות מרובות שצולמו במישורי מוקד שונים לתמונה אחת ללא הפרדות צבע). זה יכול להתבצע באמצעות תוכנה מסחרית זמינה (למשל, אולימפוס Fluoview) או כל פלטפורמת קוד פתוח שווה ערך, למשל, פיג'י / תמונה J. שמור את הקרנת Z יחיד בפורמט TIFF.</li>
	<li>פתח את תוכנית ניתוח התמונה פיג'י/ImageJ.</li>
	<li>לחץ על קובץ, מתוך שורת התפריטים ובחר פתח מהחלון המוצג.</li>
	<li>בחר את הקרנת התמונה הבודדת המאוחסנת, שנשמרה בתבנית TIFF, שיש לנתח.</li>
	<li>לחצו על 'עריכה'מתוך שורת התפריטים ובחרו באפשרות 'היפוך' מהחלון המוצג.</li>
	<li>לחץ על התמונה, מתוך שורת התפריטים ולאחר מכן בחר התאם, מהחלון המוצג, ולבסוף בחר באפשרות בהירות/ניגודיות.</li>
	<li>בחרו באפשרות 'צורה ביד חופשית' מתוך סרגל הכלים למדידת אזור הרווח (אם קיים).</li>
	<li>לחצו על 'נתח'מתוך שורת התפריטים ובחרו באפשרות 'מדידה'. זה יציג את האזור של הפער או הפצע.</li>
</ol>

<ol><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
<li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pickpocket+is+a+DEG%2FENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li>
<li>Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+chemical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">An assay for chemical nociception in Drosophila larvae.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282(2019).</li>
<li>Lopez-Bellido, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+signaling+regulates+mechanical+nociception+in+flies+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates.</a> Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).</li>
<li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+and+neuromodulatory+feedback+facilitate+Drosophila+mechanonociceptive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).</li>
<li>Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Drosophila+Piezo+in+mechanical+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception.</a> Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li>
<li>Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-induced+cold+sensitization+in+Drosophila+larvae+involves+behavioral+shifts+that+require+the+TRP+channel+Brv1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1.</a> PloS One. 13 (12), 0209577(2018).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> eLife. 4, 10735(2015).</li>
<li>Cervero, F., Merskey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+noxious+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Forum%22%5BJournal%5D)">What is a noxious stimulus.</a> Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).</li>
<li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837(2012).</li>
<li>Follansbee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+nociceptive+sensitization+requires+BMP+signaling+via+the+canonical+SMAD+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway.</a> Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).</li>
<li>Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+insulin+receptor+regulates+the+persistence+of+injury-induced+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+caspase+activity+is+required+independently+of+apoptosis+to+produce+active+TNF%2FEiger+during+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization.</a> Cell Death & Disease. 8 (5), 2786(2017).</li>
<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li>
<li>Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PPK26+in+Drosophila+larval+mechanical+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception.</a> Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).</li>
<li>Takagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+connectivity+of+homologous+command-like+neurons+mediates+segment-specific+touch+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila.</a> Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שינינו בדיקה מכנית הוקמה1,2,16 באמצעות בדיקות מכניות מותאמות אישית מפוברק חוטי ניטינול. סגסוגת מתכת זו מאפשרת לנו להשתמש חוטים בקוטר קטן יותר המתאימים לגודל של זחלי Drosophila. מונופילמנטים מבוססי קו דיג שלטו בתחום nociception מכני לטוס עד כה2,5,6,16. חוטי הניטינול שלנו שומרים על צורתם ומדדו לחץ במשך כ -3-5 חודשים (מניסיוננו). על ידי שינוי האורך והקוטר של חוטי הניטינול, המשתמש יכול ליצור מגוון רחב של לחצים המשתרעים מתת-כותרת לתגובה מתגלגלת כמעט מלאה. בפרט, ביצוע בדיקות subthreshold הוא פשוט יותר עם חוטי ניטינול בקוטר קטן יותר. באמצעות בדיקות אלה, מצאנו כי לחץ, ולא כוח, מעורר תגובות התנהגותיות nocifensive עקבי יותר4. אנו מדגימים כאן, באמצעות מודל רגישות nociceptive UV-induced מבוסס היטב7,10,13, כי חוטים אלה הם גם כלי שימושי לחקר רגישות יתר מכנית – allodynia ו hyperalgesia.
מחקרים קודמים באמצעות בדיקות מכניות מפוברק מקו דיג הובילו שונות מסוימת בתגובה התנהגותית2,6,16,17. מספר גורמים עשויים להסביר זאת. ראשית, מכיוון שהלחץ הוא המשתנה החשוב, ההבעה של קצה הסיב כך שהוא מעוגל ואין לו קצוות חדים היא קריטית. שנית, דיווח על ערכי לחץ ולא רק כוח חשוב לשחזור הניסויים, מכיוון שבדיקות מכניות שונות המייצרות כוחות דומים יכולות לעורר לחצים שונים4. שלישית, חיוני ליישם רק גירוי מכני אחד לכל זחל באמצעות בדיקות רעילות, מכיוון שבדיקות כאלה מייצרות נזק לרקמות תלויות מינון ברמות האפידרמיס4 והנוירונים החושיים (איור 2E). גירוי מכני רעיל שני או עוקב, לאחר נזק לרקמות כבר המושרה, יכול לפגוע בתפקוד של נוירונים חושיים היקפיים מושפעים לעורר תגובה התנהגותית שונה. במחקר אחר, זחלים מגורה פעמיים עם בדיקות מכניות רעילות הציגו בעיקר תגובה התנהגותיתמשופרת 5, מה שמרמז על התפתחות של רגישות מכנית חריפה (hyperalgesia), אשר עשוי לנבוע נזק לרקמות עורר על ידי הגירוי המכני המזיק הראשון. לעומת זאת, מחברים אחרים 6 דיווחו עלתגובה התנהגותית מעורבת (מוגברת או מופחתת), המצביעה על כך שהתגובה ההתנהגותית שהשתנתה יכולה להיות בגלל נזק/תפקוד לקוי של הרקמה העצבית. גירוי כל זחל רק פעם אחת מבטל שונות אפשרית בתגובות התנהגותיות הנובעות רגישות או נזק לרקמות. רביעית, אנו מגרים מכנית קטע A8, שהוא אחורי יותר מאשר מחקרים קודמים (אזורים מועדפים A3-A4)2,5,16. בדיקות בין ~ 3,900 kPa ו 5,300 kPa להחיל על כל קטע A2 או A8 לא הראה שום הבדלים התנהגותיים4. בנוסף, A8, לעומת A2-A4, קל יותר לעורר עם בדיקות מכניות המייצרות לחצים נמוכים יותר (<300 kPa) כי הזחל הוא דק יותר באזור זה ולכן בקלות רבה יותר דחוס. מחקרים אחרים הראו כי גירוי מכני רעיל של הקצה האחורי של הזחל (מועבר על ידי סיכת חרקים נוקשה, מוחזק עם מלקחיים) עורר בעיקר קטר קדמי, ולא תגובה מרתיעה או מתגלגלת18. תגובה התנהגותית שונה זו יכולה להיות בשל הבדלים במאפיינים של החומרים המשומשים (חוטי ניטינול ניתנים לכיפוף לעומת סיכת חרקים בלתי דחוסה) או ללחצים שונים המועברים לזחלים (ערך הלחץ של סיכת החרקים לא דווח).
הפיתוח של מבחני nociception מכני עבור זחלים Drosophila אפשרה לשדה לגלות כי ערוצי יון חושיים מכניים שונים ומעגלים עצביים לתווך nociception מכני5,6,16,17. עם זאת, המחקר של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) פיגר, לעומת רגישות של אופני החושים האחרים - חום7, 8,10,13,14, קר9, ו כימי3. השהיה זו עשויה לנבוע בחלקה מהיעדר בדיקות מכאניות מתאימות שיכולות ליצור טווח תגובה מלא המשתרע על פני תת-אחיזה ללחצים suprathreshold. חשיבות מיוחדת, במיוחד להערכת allodynia מכני, הם בדיקות subthreshold שאינם מעוררים תגובה מתגלגלת מרתיעה מזחלים לא נפגעים. המשמעות של הבדיקות המכניות המשופרות שלנו היא שניתן לפברק אותן כדי להתפרס על פני גירויים בלתי מזיקים (subthreshold ~ 174 kPa–200 kPa) או את הטווח הנמוך עד רעיל גבוה (suprathreshold ~ 225 kPa כדי ~ 5,116 kPa). כאן, אנו מדגימים באמצעות חוטים דמויי nitinol פון פריי כי זחלים Drosophila לפתח הן allodynia מכני היפרלגזיה מכני לאחר הקרנת UV. הרגישות המכנית מראה כמה הבדלים בהשוואה לרגישות תרמית. הן תחילתה והן שיא הרגישות המכנית מוקדם יותר (~ 4 שעות) בהשוואה לרגישות תרמית (חום) (~ 8 שעות להיפרלגזיה ו ~ 24 שעות לאגודיניה)7. בנוסף, allodynia מכני hyperalgesia הם בו זמנית (שניהם שיא ב ~ 4 שעות). יתר על כן, בעוד רגישות חום (allodynia ו hyperalgesia) פותר לחלוטין בנקודות זמן מאוחר יותר7, רגישות יתר מכנית הציג זנב ארוך שנשאר מעט מעל קו הבסיס. רגישות קרה בדרוזופילה כרוכה במתג בהתנהגויות מעוררות קור 9 ובהופעתן שלהתנהגויות חדשות מעוררות קור – תופעה שאינה נצפית בגירוי מכני. הבדלים אלה בהתנהגויות התפרצות, משך זמן ונצפות מצביעים על כך שכל שיטה חושית עשויה להיות נשלטת על ידי מסלולי איתות שונים. שילוב מבחני הרגישות המתוארים כאן עם הכלים הגנטיים החזקים הזמינים בדרוסופילה אמור לאפשר ניתוח גנטי מדויק של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) שנצפו.

זחלי דרוזופילה מפגינים התנהגות מתגלגלת מרתיעה אופיינית כאשר נחשפים לגירויים רעילים שונים: תרמי1, מכני2, וכימיקל3. התנהגות זו נבדלת בבירור מתנועה רגילה. כאן אנו מתארים מבחנים מכניים משופרים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך nociception מכני ורגישות מכנית.
במחקר שנערך לאחרונה, המצאנו חוטים דמויי פון פריי באמצעות חוטי ניטינול4. בדיקות המפעילות כוחות ולחצים שונים נעשו על ידי שינוי האורכים והקוטרים של חוטי הניטינול היוצרים כל גשוש. בדיקות מכניות כוילו וערכי הכוח הנמדדים (במילינוטון, mN) הוסבו ללחץ (קילופסקל, kPa), בהתבסס על אזור הקצה של כל בדיקה4. ייצור מותאם אישית של בדיקות מכניות מותר לנו ליצור subthreshold (≤200 kPa) כדי suprathreshold (225 kPa כדי 5318 kPa) לחצים, אשר יכול, באופן עקרוני, להיות מועיל לחקר רגישות יתר מכנית. באמצעות חוטים אלה פון פריי מכני משופר, הראינו כי לחץ4, בניגוד לכוח נבדק בעבר2,5,6 בקורלציה עקבית יותר עם היענות התנהגותית מרתיעה בזחלים Drosophila. בדיקה מכנית משופרת המתוארת כאן גם עזר לזהות גורם גדילה אנדותל כלי דם שמורות (VEGF) הקשורות קולטן טירוסין קינאז איתות מסלול המסדיר nociception מכני זבובים וחולדות4.
אלודיניה מכנית והיפרלגזיה, שתי אופנים של רגישות יתר, הם understudied יחסית בזחלים Drosophila, לעומת תרמית (חום וקור) ואמצעים חושיים כימיים3,7,8,9,10. זה כנראה בשל היעדר בדיקות מכניות ספציפיות המשתרעות מגירויים מזיקים לטווח רעיל גבוה2,5,6. גירוי בלתי מזיק בדרך כלל המעורר את התנהגות מתגלגל מרתיע טיפוסי לאחר זחלים Drosophila לחוות נזק לרקמות3,7 נקרא allodynia. תגובה מתגלגלת מוגזמת לגירוי רעיל בדרך כלל ידועה בשם hyperalgesia7. גירויים רעילים מוגדרים ככאלה שמעוררים נזק לרקמות ויכולים להפעיל nociceptors11. גירויים רעילים המועברים לזחלי דרוזופילה פוגעים באפידרמיס המחסום, בנוירונים החושיים ההיקפיים3,4,7, או שניהם.
במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לפברק ולכייל בהתאמה אישית בדיקות מכניות דמויי פון פריי המתאימות לזחלים של דרוזופילה. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בבדיקות אלה כדי לבדוק תגובות נוציפציביות מכניות בזחלי דרוזופילה. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר את התועלת של בדיקות אלה באמצעות אותם כדי להדגים את נוכחותם של רגישות יתר מכנית, הן allodynia והן hyperalgesia, בעקבות נזק לרקמות בזחלים Drosophila (ראה תוצאות מייצגות).

<table><tbody><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-540C</td><td>בקיבולת של 10 מ"ל. כל מיכל דומה יעשה.</td></tr><tr><td>אבן ספסל שחורה (ארקנסו)</td><td>Dan' s Whetstone</td><td>מק"ט: I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td><td>משמש להחלקת כל אי סדרים בקצות חוטי הניטינול. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>FV1000</td><td>כל מיקרוסקופ קונפוקלי שווה ערך יעשה</td></tr><tr><td>קופלין ג'אר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-816</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td></tr><tr><td>דיאתיל אתר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>E138-500</td><td>להרדמת זחלים.</td></tr><tr>תא <td></td><td></td><td>אתריזציה</td><td>זהו תא מותאם אישית תוצרת בית. אנא ראה פרטים על בנייתו במאמר הקודם שפורסם12. מטרת תא האתריזציה היא לאפשר כניסה של אדי אתר דיאתיל אך למנוע בריחת זחלים.</td></tr><tr><td>מדריך אור סיבים אופטיים</td><td>Schott AG</td><td>A08575</td><td>Schott Dual Gooseneck 23 אינץ</td></tr><tr><td>'מלקחיים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>FS-1670</td><td>להעברת זחלים</td></tr><tr><td>דבק</td><td>Aleene's</td><td>N/A</td><td>Aleene's&reg; דבק עץ, שנקרא בעבר (דבק העץ לכל מטרה של אלין) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td></tr><tr><td>מחזיק אחיזה</td><td>Loew Cornell</td><td>N/A</td><td>Loew-Cornell Simply Art Wood Colour Craft Sticks, 500 חתיכות.</td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון 700</td><td>סיגמא</td><td>H8898-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מחט היפודרמית 30 גרם 1/2 אינץ' L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1471286</td><td>BD Precisionglide&reg; מחטי מזרק, מד 30, L 1/2 אינץ'. משמש ליצירת חור במחזיק העץ לחוטי הניטינול</td></tr> בז <tr><td>פטרידיש גדול</td><td></td><td>351007</td><td>60 מ"מ x 10 מ"מ פוליסטירן פטרידיש</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ (Zeiss) Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>NT55-605</td><td>כל מיקרוסקופ שווה ערך יעשה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כיסוי זכוכית 22x22</td><td>פישר</td><td>12-545-B</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית 22x40</td><td>קורנינג</td><td>2980-224</td><td>תקתוק 1 1/2</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>גלובוס סיינטיפיק בע"מ.</td><td>1358Y</td><td></td></tr><tr><td>מיני אלכסוני חותך</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S43981</td><td>לחיתוך חוטי ניטינול</td></tr><tr><td>חוטי ניטינול, קטרים: 0.004 אינץ', 0.006 אינץ', 0.008 אינץ'</td><td>הוזמנו Mailin Co</td><td>N / A</td><td>חמש עשרה חתיכות מכל קוטר באורך 12 אינץ'. https://malinco.com/</td></tr> <tr><td>חתיכת ויניל</td><td>שחור אופיס</td><td>דיפו N / A</td><td>אנו משתמשים בחתיכה קטנה של ויניל שנחתכה מקלסר . צבע כהה מספק ניגודיות. חתיכה קטנה מאפשרת התמצאות של הזחל</td></tr><tr>בז<td>קטן פטרידיש</td><td></td><td>351008</td><td>35 מ"מ x 10 מ"מ פוליסטירן מרית פטרידיש</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>21-401-10</td><td>מרית נירוסטה מיקרו-מחודדת כפולה. משמש להנחת האוכל בצלחת פטרי</td></tr><tr><td>מגבונים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-666A</td><td>Kimpes KMTECH, מותג מדע. משמש לייבוש זחלים של עודף לחות.</td></tr><tr><td>W1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td>זן בקרה לבדיקות התנהגותיות</td></tr><tr><td>ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>8749</td><td>זן לתיוג פלואורסצנטי של נוירונים מסוג IV md</td></tr></tbody></table>

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

מבחנים שפורסמו עבור nociception מכני ב Drosophila הובילו הערכות משתנות של התנהגות. כאן, אנחנו מפוברק, לשימוש עם זחלים Drosophila, מותאם אישית ניקל טיטניום סגסוגת (ניטינול) חוטים. בדיקות מכאניות אלה דומות לסיבים של פון פריי המשמשים בעלי חוליות למדידת תפיסה מכנית. כאן, אנו מדגימים כיצד להפוך ולכייל בדיקות מכניות אלה וכיצד ליצור מינון התנהגותי מלא-תגובה מ subthreshold (טווח מזיק או רעיל) כדי suprathreshold (טווח רעיל נמוך עד גבוה) גירויים. כדי להדגים את התועלת של הבדיקות, חקרנו רגישות יתר הנגרמת על ידי נזק לרקמות בזחלי דרוזופילה. אלודיניה מכנית (רגישות יתר לגירוי מכני בלתי מזיק בדרך כלל) והיפרלגזיה (היענות מוגזמת לגירוי מכני רעיל) עדיין לא הוקמו בזחלים דרוזופילה. באמצעות בדיקות מכניות כי הם בדרך כלל מזיקים או בדיקות כי בדרך כלל לעורר התנהגות מרתיעה, מצאנו כי זחלים Drosophila לפתח רגישות יתר מכנית (הן allodynia ו hyperalgesia) לאחר נזק לרקמות. לפיכך, הבדיקות המכניות והבדיקות שאנו ממחישים כאן יהיו ככל הנראה כלים חשובים לנתח את המנגנונים המולקולריים/גנטיים הבסיסיים של רגישות יתר מכנית.

פיתחנו גשושיות מכניות מותאמות אישית, תוך שימוש בצינור ניטינול(איור 1A,N),כדי לעורר התנהגויות מעוררות מכנית ויצרנו עקומת תגובה מלאה של מינון התנהגותי באמצעות בדיקות מכניות בלתי מזיקות ומזיקות בעוצמה משתנה(איור 2D)המוכיחות כי ניתן להשתמש בבדיקות אלה כדי ללמוד את הבסיס (בהיעדר פציעה) תפיסה מכנית.
תוצאות הבדיקה ההתנהגותית שלנו קבעו כי בדיקות המפעילות לחצים מתחת ל- 200 kPa (~ 1.57 mN) (איור 1M), כאשר הן מוחלות על זחלי דרוסופילה, אינן מעוררות תגובת גלגול מרתיעה (איור 2D ו- Video 3). כצפוי, בדיקות מכניות תת-קרקעיות או לא רעילות אלה (175 kPa או 200 kPa) לא עוררו נזק לרקמות עצביות נראות לעין (איור 2E). בגלל שהם לא לגרום נזק, בדיקות כאלה יכול להיות שימושי כדי להעריך allodynia מכני (רגישות יתר לגירויים מכניים שאינם רעילים בדרך כלל). לעומת זאת, בדיקות suprathreshold או רעילות (מ 462 kPa ל 5,116 kPa), עורר תגובה התנהגותית מוגברת (איור 2D) באופן תלוי מינון - עם לחצים גבוהים יותר לעורר תגובות התנהגותיות חזקות יותר. כצפוי, לחץ מכני suprathreshold גם גרם נזק לרקמות תלויות מינון לנוירונים החושיים ההיקפיים עצמם (איור 2E). האזור הנמדד של נזק לרקמות (בμm2 ± סטיית תקן) שנלקח מארבעה זחלים לכל קבוצה היו: 2,051.03 ± 703.81 (462 kPa), 5,102 29 ± 1,004.67 (2,283 kPa) ו- 12,238.83 ± 3,724.11 (5,116 kPa). לפיכך, לחצים הגדולים או שווים ל- 462 kPa (~ 63 mN), המעוררים תגובת גלגול מרתיעה (ב-25% או יותר מהזחלים) וגורמים לנזק לרקמות עצביות גלויות (איור 2E), עשויים להיות מתאימים לחקר היפרלגזיה מכנית (רגישות יתר לגירויים מכניים מזיקים בדרך כלל). בדיקות מכניות Nociceptive (≥462 kPa) תמיד לגרום נזק לרקמות (n = 10, מוערך באופן איכותי) אבל לא תמיד לעורר תגובה מתגלגלת מרתיעה.
כדי להעריך רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia), השתמשנו במודל זחל Drosophila מבוסס היטב של רגישות nociceptive המשתמשת אור אולטרה סגול (UV) הקרנה כדי לגרום נזק לרקמות7,12. בדיקה זו סייעה לנתח את המנגנונים הגנטיים והתאיים של רגישות יתר תרמית8,9,10,13,14,15. כדי לקבוע אם טיפול UV גורם allodynia מכני, באמצע השלישי כוכב שליטה (w1118)זחלים היו מוקרן מדומה או UV מוקרן (15-20 mJ / cm2) (איור 3A). לאחר מכן, הזחלים נבדקו באופן התנהגותי ב 2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות לאחר הטיפול עם בדיקה מכנית subthreshold בדרך כלל (200 kPa, 1.57 mN). כ-20% מהזחלים הגיבו כבר ב-2 שעות לאחר טיפול UV, בעוד ש-50% השיבו ב-4 שעות, לעומת 6.6% ו-8.3% בעלי חיים מדומים מוקרנים ב-UV, בהתאמה (איור 3B). זה מציין כי נזק לרקמות הנגרמת על ידי UV גורם allodynia מכני ב 4 שעות לאחר הקרנה. בנקודות זמן מאוחרות יותר (8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות) התגובה ההתנהגותית של הזחלים שטופלו UV היה בטווח של 16%-20% מגיבים (ממוצע של n = 3-6 סטים של 10 זחלים כל אחד), גדל מעט (אבל לא מובהק סטטיסטית) לעומת קבוצת הביקורת מדומה מוקרן (בטווח של 3%-6% של המגיבים, ממוצע ממוצע של n = 3-6 קבוצות של זחלים כל אחד) (איור 3B).
כדי לחקור היפרלגזיה מכנית, נעשה שימוש בלחץ suprathreshold (462 kPa, 3.63 mN), שבדרך כלל גורם לתגובה מתגלגלת מרתיעה בכ-20% מהזחלים (איור 2D)וגורם לנזק עצבי לרקמות העצביות (איור 2E). מרחנו את הגשושית 462 kPa על הצד הגבי של הזחלים עם או בלי נזק לרקמות הנגרמות על ידי UV(איור 3A). מצאנו כי זחלים נבדקו ב 4 שעות, 8 שעות, ו 16 שעות לאחר טיפול UV הראו עלייה משמעותית בתגובה מתגלגל מרתיעה, עם 4 שעות להיות השיא של רגישות יתר התנהגותית (~ 60% מגיב); בעלי חיים מדומים מוקרנים UV הראו ~ 27% של תגובה מרתיעה (איור 3C). בדומה לאגודיניה מכנית, התגובה ההתנהגותית ב 8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות של בעלי חיים שטופלו UV (בטווח של 36%-42%) מבחינה סטטיסטית לא ניתן היה להבחין בין הזחלים שאינם מטופלים (בטווח של 20%-26%). הזחלים בשלב ה-instar השלישי המאוחר אכן הראו ירידה קלה בתגובה ההתנהגותית הבסיסית בהשוואה לשלב ה-instar השלישי האמצעי. אנו משערים שזה יכול להיות גם על ידי גודל מוגבר של הזחלים (איור 2A) או עובי מוגבר של הקוטיקל המכסה את הגוף. עובדה זו יכולה להסביר מדוע בשלב מאוחר יותר של הפיתוח הטיפול UV אינו גורם רגישות מכנית גדולה יותר, כפי שנצפה 4 שעות לאחר טיפול UV.
יחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך זחלים Drosophila לפתח הן אלודיניה מכנית hyperalgesia מכני בעקבות נזק לרקמות הנגרמת על ידי UV. זמן השיא של allodynia מכני hyperalgesia זהה, 4 שעות לאחר טיפול UV; עם זאת, hyperalgesia מכני יש זנב זמני בולט יותר כפי שהוא חוזר לבסיס לאט יותר בהשוואה allodynia מכני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg"> איור 1: פיתוח כלי דמוי פון פריי להערכת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. (A) תמונה של בדיקה מכנית המשמשת לחקר תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. (B)חוטי ניטינול וקטריהם היחסיים מוצגים בקנה מידה יחסי. (C)תמונה של חותך התיל האלכסוני המשמש לחיתוך חוטי הניטינול. (ד)החלקת הקצוות החדים של חוט הניטינול החתוך באבן מחדדת. (E)מחט Hypodermic נהג לעשות חור לתוך ידית מקל ארטיק עץ של החללית. קצה המחט צריך להגיע לפחות לחצי מגובה מקל הידית להחדרת חוטים מאובטחת. (F-G) מצורף של חוט הניטינול על ידי הדבקה לתוך ידית מקל ארטיק עץ עם חור הכנסה. (H-L) כיול של בדיקות מכניות על ידי לחיצה עליהם כנגד סולם. (ז)ערכים של כוח (ב- mN) ולחץ (ב kPa) שנוצר על ידי בדיקות מכניות שונות. אורכו של כל חוט ניטינול המשמש לבניית הבדיקות (P1-P10; P: בדיקה) מפורט בסנטימטרים (ס"מ). (N)תמונה של קבוצה שלמה של בדיקות מכניות, החל 174 kPa ל 5,116 kPa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg"> איור 2: מבחני nociception מכניים: חוטים דמויי פון פריי יוצרים עקומת תגובת מינון של התנהגות מתגלגלת מרתיעה וגורמים נזק לרקמות לנוירונים חושיים. (A)תמונות של השלבים השונים (כוכב שני ושלישי) של זחלי דרוזופילה. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (B) קריקטורה של הנוף הגבי של הזחל השלישי instar Drosophila. הנקודה האדומה מציינת את קטע הבטן שבו החללית המכנית מוחלת. T: קטע בית החזה; A: קטע בטן. ציוני דרך אנטומיים אחרים מסומנים. (C) קריקטורה של הבדיקה: בדיקה מכנית מוחלת על הצד הגבי של הזחל עד שהוא מתכופף על פני השטח מתחת ולאחר מכן מוחזק במשך 2 s. אם הלחץ גבוה מספיק, זה מעורר תגובה מתגלגלת מרתיעה עם שחרורו. (D) תגובת מינון התנהגותי; כל נקודה כחולה מייצגת את אחוז הזחלים שהגיבו, בגלגול מרתיע, לגירוי המכני בתוך קבוצה של 10 בעלי חיים. עלילת כינור של אחוז התנהגות מתגלגלת מרתיעה הנגרמת על ידי בדיקות מכניות שונות. kPa: קילופסקלים. התוויית תיבות מייצגת חציון (ירוק), שפם (אדום) מייצג את האחוזונים העשירי וה-90. (ה)נזק לרקמות: זחלי כוכב שלישי (של גנוטיפ ppk-Gal4&gt;UAS-mCD8-GFP לתיוג נוירונים חושיים nociceptive) נבדקו בקטע הגב A8 עם הלחצים שצוינו. לאחר מכן נבדקו הנוירונים החושיים DdaC Class IV המסווגים באופן פלואורסצנטי (על פני קו האמצע הגבי) (ראו סעיפים 4 ו-5). אזורים לבנים (כוכביות אדומות) מייצגים פערים או נזק לרקמות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. בלוח ב', הזחל מוצג בתצוגה הגבית, ואילו ב-C הוא התצוגה לרוחב. בדיקות מכאניות שנלחצו כנגד צד הקוטיקל-אפידרמיס הגבי של הזחל מייצרות כיס דמוי דיכאון בנקודת המגע של קצה הגשוש והסביבה. הקו השחור המוצק המעוקל לכיוון הצד הגחוני הוא החלק העליון של הכיס, ואילו הקו הצדדי האפור המקווקו מייצג את הצד הצדדי ואת תחתית הכיס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg"> איור 3: רגישות יתר מכנית לאחר נזקי UV. (A)סכמטי של העיצוב הניסיוני לבדיקת רגישות. באמצע השלישי כוכב היו מטופלים מדומה (שאינם UV) או UV מוקרן. לאחר מכן בוצעה מבחני nociception מכניים בנקודות זמן שונות (2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 16 שעות ו-24 שעות) לאחר טיפול מדומה או הקרנה. (ב) אלודיניה מכנית: אחוז הזחלים המציגים גלגול מרתיע לאחר בדיקה עם גירוי מכני תת-קרקעי או לא רעיל בדרך כלל (200 kPa, 1.57 mN) בנקודות הזמן שצוינו לאחר טיפול מדומה או הקרנת UV. (ג)היפרלגזיה מכנית: אחוז הזחלים המציגים גלגול מרתיע לאחר חיטוט עם suprathreshold בדרך כלל או גירוי מכני רעיל (462 kPa, 3.63 mN) בנקודות הזמן המצוין לאחר טיפול מדומה או הקרנת UV. קווי שגיאה מציינים ממוצע +/- SEM. נעשה שימוש בבדיקת tדו-זנבית לניתוח סטטיסטי: *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01; ns: לא משמעותי. כל נקודה אדומה, בחלוניות B ו- C, מייצגת את היחס הממוצע של 10 זחלים, n = 3-6 סטים לכל נקודת זמן/תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: תנועה רגילה של זחלי דרוזופילה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
וידאו 2: גירוי מכני רעיל של זחלי דרוזופילה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
וידאו 3: גירוי מכני subthreshold של זחלים Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר למשתמש לבנות כלי שניתן להשתמש בו כדי למדוד במדויק תגובות כאב מכניות בזחלי דרוזופילה הניתנים למעקב גנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בחומרים פשוטים לבניית כלים מותאמים אישית שניתן להשתמש בהם למדידת כאב מכני מטווח תת-הסף לטווח תגובה מלא. ניתן להשתמש בכלים ובשיטות אלה כדי למדוד נוסיספציה מכנית בסיסית ורגישות נוסיספטיבית לאחר פציעה או מחלה.גישוש זחלים עם חוטים מותאמים אישית דורש תרגול. המשתמשים צריכים להיות מסוגלים ליצור עקומות מינון-תגובה עם זחלי בקרה לפני שהם מנסים לבצע ניסוי. כדי לבנות בדיקה מכנית, השתמש בחותך תיל קטן כדי לחתוך כל חוט ניטינול לאורך שצוין בניצב לציר הארוך שלו.החוטים מגיעים בשלושה קטרים שונים שנקבעו מראש. בדוק את קצה החוטים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שלא יישארו קצוות חדים או לא סדירים שעלולים לגרום נזק לרקמות לעור הזחל ולהפריע לכיול. לאחר מכן השתמש באבן השחזה כדי להחליק ידנית את שולי הגשושית עד שלא יימשכו אי סדרים חדים.לאחר מכן, השתמש במחט תת-עורית כדי לתקוע חור בקצה של ארטיק עץ. מרחו דבק עץ על חוט ניטינול בודד והכנסו את החוט המצופה בדבק לתוך חריץ המחט. כאשר הדבק התייבש, לחץ את הגשושית על האבנית עד שהגשושית מתכופפת כדי לקבוע את הכוח המרבי שניתן לרשום בגרמים.השתמש בנוסחה כדי להמיר את המסה המוקלטת לכוח במיליניוטון. לאחר מכן חלקו את הכוח הנמדד בשטח הפנים של קצה החוט כדי להמיר את הכוח המחושב לקילופסקל של לחץ. הכנת בדיקות מרובות באמצעות חוטים בקטרים ואורכים שונים תיצור סט שלם, המשתרע על טווח התגובה של זחלי דרוזופילה.כדי להכין זחלי דרוזופילה לניסוי, יש לגדל את צאצאי הזחלים על מזון סטנדרטי באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס למשך כ-96 שעות. כאשר הזחלים מגיעים לשלב הכוכב השלישי, הכינו פקק של מזון זבובים בצלחת פטרי קטנה לבדיקת הזחלים והשתמשו במלקחיים כדי למיין בעדינות את הזחלים בגודל בינוני של אמצע כוכב שלישי מהכוכב השני הקטן יותר ותחילת הכוכב השלישי והזחלים הגדולים יותר של הכוכב השלישי המאוחר או הנודד. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להעביר 20 עד 30 זחלי כוכב אמצע השליש לצלחת פטרי קטנה המכילה פקק קטן של מזון זבובים שהורטב במים בטמפרטורת החדר.כדי לבצע בדיקת כאב מכנית, השתמש במלקחיים כדי למקם זחל כוכב באמצע השליש על משטח ויניל דק כהה מתחת למיקרוסקופ סטריאו Brightfield ולסדר אורות סיבים אופטיים בין עדשות האובייקט של המיקרוסקופ לבין הרפיד. השתמשו במגבת נייר כדי לנגב את עודפי המים המקיפים את הזחל והזיזו את הכרית כדי לכוון את הראש והפה של הזחל לעבר היד הלא דומיננטית של החוקר. בחר בדיקה מכנית והחל את הגשושית על הצד הגבי האחורי של הזחל בערך בקטע הבטן A8 למשך שנייה עד שתיים, תוך דחיסת הזחל בזהירות לתוך הכרית הבסיסית בנקודת המגע של הגשושית עד שהגשושית מתכופפת ומעוררת את כמות הלחץ שנמדדה קודם לכן.תגובה נוסיספטיבית חיובית מסומנת אם הזחל מראה גלגול חולץ פקקים שלם של 360 מעלות לאורך ציר גופו תוך שלוש שניות. רשום את התגובה ההתנהגותית עבור כל זחל. לאחר מכן השליכו את הזחל שנבדק והכינו את הזחל הבא לבדיקה.ניתן להשתמש בבדיקות מכניות מותאמות אישית אלה עם חוטי ניטינול כדי לעורר התנהגויות מעוררות מכנית וליצור עקומת מינון-תגובה התנהגותית מלאה באמצעות בדיקות מכניות תמימות ומזיקות בעוצמה משתנה. כפי שתוצאות הבדיקה ההתנהגותית הללו מוכיחות, בדיקות המפעילות לחץ של 200 קילופסקל או פחות אינן מעוררות תגובת גלגול מרתיעה בזחלי דרוזופילה. כצפוי, בדיקות מכניות תת-סף או לא מזיקות אלה אינן מעוררות נזק גלוי לרקמות עצביות.לעומת זאת, סף סופר או בדיקות מזיקות מעוררים תגובה התנהגותית מוגברת כמו גם נזק לרקמות לנוירונים החושיים ההיקפיים עצמם באופן תלוי מינון. בדיקות אלו יכולות לשמש גם למדידת רגישות יתר מכנית לאחר פציעה. כ-20% מהזחלים מגיבים בגלגול מרתיע כבר שעתיים לאחר הטיפול ב-UV, בעוד ש-50% הגיבו ארבע שעות בהשוואה לבעלי חיים מדומים שעברו קרינת UV.מכיוון שהגשושית ששימשה לניתוח זה הייתה בדרך כלל תת-סף של 200 קילופסקל, תגובה זו נחשבה לאלודיניה מכנית. בנקודות זמן מאוחרות יותר, התגובה ההתנהגותית של הזחלים שטופלו ב-UV מוגברת מעט אך אינה שונה סטטיסטית מזו של קבוצת הביקורת המוקרנת המדומה. זחלים שנבדקו עם בדיקה של 462 קילופסקל בארבע, שמונה ו-16 שעות לאחר הטיפול ב-UV הראו עלייה משמעותית בתגובת הגלגול המרתיע כאשר ארבע שעות היו שיא רגישות היתר ההתנהגותית מכיוון שהגירוי היה מזיק בתחילה.התגובה נחשבה להיפרלגזיה מכנית. הכנת בדיקה ובחירת זחלים ודחיסה הם קריטיים להצלחת התהליך. באמצעות בדיקות אלה הביא את הכאב הבסיסי וניתן למדוד רגישות יתר נוסיספטיבית מכנית לאחר פציעה.באמצעות כלים ובדיקות אלה, ניתן למדוד את הבסיס המולקולרי והגנטי של כאב מכני ורגישות יתר נוסיספטיבית במודל דרוזופילה הניתן למעקב גנטי.

an-improved-assay-tools-for-measuring-mechanical-nociception

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception...

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

לזחלי דרוזופילה יש נוירונים חושיים ייעודיים – nociceptors – שתגובתם לגירויים תרמיים שעלולים להיות מזיקים מעוררת התנהגויות מרתיעות – או מה שמכונה "nocifensive" – אצל החיה. סרטון זה מתאר שיטה להערכת נוסיספטציה תרמית על ידי רישום התנהגות הזחל בתגובה ליישום מקומי של בדיקת חום על הקוטיקולה. שיטה זו נקראת, אם כן, בדיקת חום מקומית.

בדיקת חום מקומית: שיטה להערכת נוסיספטציה של טמפרטורות גבוהות בזחלי דרוזופילה

רמות של מולקולת האיתות התאית הדלקתית תחמוצת החנקן (NO) נבדקות בדרך כלל באמצעות מגיב גריס. בפרוטוקול זה, יצרנו בדיקת גריס מותאמת תוך שימוש ברקמת מוח חיה של דרוזופילה על מנת לזהות הפרשת NO בשיטה פשוטה, ניתנת לכימות וניתנת לחזרה רבה.

בדיקה כמותית חדשה של רקמה שלמה של רמות תחמוצת החנקן בתגובה נוירו-דלקתית של דרוזופילה

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

מדידות פון פריי אלקטרוניות הן אלטרנטיבה יעילה ומשופרת לחוטי פון פריי הקלאסיים, מכיוון שהן מאפשרות מדידה מהירה ומדויקת של שינויים בספי הנסיגה המכאניים של מכרסמים לגירוי לחץ המופעל ברציפות לפני ואחרי אירוע דלקתי.

מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

כאן אנו מתארים שיטה למדידה מהירה ומדויקת של ביצועי טיסה בדרוזופילה, המאפשרים תפוקה גבוהה הקרנה.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

על מנת לזהות מוטציות חדשות המשפיעות על תחושה מכנית, תכננו בדיקה המודדת את התגובה ההתנהגותית לגירוי מישוש של זיפי זבובים בשיבוטים מוטנטיים שנוצרו בשיטת MARCM. שילוב הטכניקות מאפשר לזהות מוטציות רגישות למכניקה שאחרת היו קטלניות.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

גישת הדמיית סידן מאפשרת להקליט תגובות הנגרמות על ידי טעם במוחם של זבובים ערים בזמן שתמיסה מוחלת על התווית. תגובות טעם ראשוניות ב-Drosophila melanogaster משמשות כדוגמה, אך ניתן להתאים פרוטוקול זה לחקר נוירונים במורד הזרם או מינים אחרים.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובות עצביות הנגרמות על ידי טעם בדרוזופילה בוגרת

למדו לבנות כלים מותאמים אישית מסיבי Nitinol למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. שיטה זו מאפשרת למדוד בסיס נוקיספטיבי והיפרסנסיטיביות לאחר פציעה ב-Drosophila.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים