מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה
29 באוקטובר 2020
מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.
פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר למשתמש לבנות כלי שניתן להשתמש בו כדי למדוד במדויק תגובות כאב מכניות בזחלי דרוזופילה הניתנים למעקב גנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בחומרים פשוטים לבניית כלים מותאמים אישית שניתן להשתמש בהם למדידת כאב מכני מטווח תת-הסף לטווח תגובה מלא. ניתן להשתמש בכלים ובשיטות אלה כדי למדוד נוסיספציה מכנית בסיסית ורגישות נוסיספטיבית לאחר פציעה או מחלה.
גישוש זחלים עם חוטים מותאמים אישית דורש תרגול. המשתמשים צריכים להיות מסוגלים ליצור עקומות מינון-תגובה עם זחלי בקרה לפני שהם מנסים לבצע ניסוי. כדי לבנות בדיקה מכנית, השתמש בחותך תיל קטן כדי לחתוך כל חוט ניטינול לאורך שצוין בניצב לציר הארוך שלו.
החוטים מגיעים בשלושה קטרים שונים שנקבעו מראש. בדוק את קצה החוטים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שלא יישארו קצוות חדים או לא סדירים שעלולים לגרום נזק לרקמות לעור הזחל ולהפריע לכיול. לאחר מכן השתמש באבן השחזה כדי להחליק ידנית את שולי הגשושית עד שלא יימשכו אי סדרים חדים.
לאחר מכן, השתמש במחט תת-עורית כדי לתקוע חור בקצה של ארטיק עץ. מרחו דבק עץ על חוט ניטינול בודד והכנסו את החוט המצופה בדבק לתוך חריץ המחט. כאשר הדבק התייבש, לחץ את הגשושית על האבנית עד שהגשושית מתכופפת כדי לקבוע את הכוח המרבי שניתן לרשום בגרמים.
השתמש בנוסחה כדי להמיר את המסה המוקלטת לכוח במיליניוטון. לאחר מכן חלקו את הכוח הנמדד בשטח הפנים של קצה החוט כדי להמיר את הכוח המחושב לקילופסקל של לחץ. הכנת בדיקות מרובות באמצעות חוטים בקטרים ואורכים שונים תיצור סט שלם, המשתרע על טווח התגובה של זחלי דרוזופילה.
כדי להכין זחלי דרוזופילה לניסוי, יש לגדל את צאצאי הזחלים על מזון סטנדרטי באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס למשך כ-96 שעות. כאשר הזחלים מגיעים לשלב הכוכב השלישי, הכינו פקק של מזון זבובים בצלחת פטרי קטנה לבדיקת הזחלים והשתמשו במלקחיים כדי למיין בעדינות את הזחלים בגודל בינוני של אמצע כוכב שלישי מהכוכב השני הקטן יותר ותחילת הכוכב השלישי והזחלים הגדולים יותר של הכוכב השלישי המאוחר או הנודד. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להעביר 20 עד 30 זחלי כוכב אמצע השליש לצלחת פטרי קטנה המכילה פקק קטן של מזון זבובים שהורטב במים בטמפרטורת החדר.
כדי לבצע בדיקת כאב מכנית, השתמש במלקחיים כדי למקם זחל כוכב באמצע השליש על משטח ויניל דק כהה מתחת למיקרוסקופ סטריאו Brightfield ולסדר אורות סיבים אופטיים בין עדשות האובייקט של המיקרוסקופ לבין הרפיד. השתמשו במגבת נייר כדי לנגב את עודפי המים המקיפים את הזחל והזיזו את הכרית כדי לכוון את הראש והפה של הזחל לעבר היד הלא דומיננטית של החוקר. בחר בדיקה מכנית והחל את הגשושית על הצד הגבי האחורי של הזחל בערך בקטע הבטן A8 למשך שנייה עד שתיים, תוך דחיסת הזחל בזהירות לתוך הכרית הבסיסית בנקודת המגע של הגשושית עד שהגשושית מתכופפת ומעוררת את כמות הלחץ שנמדדה קודם לכן.
תגובה נוסיספטיבית חיובית מסומנת אם הזחל מראה גלגול חולץ פקקים שלם של 360 מעלות לאורך ציר גופו תוך שלוש שניות. רשום את התגובה ההתנהגותית עבור כל זחל. לאחר מכן השליכו את הזחל שנבדק והכינו את הזחל הבא לבדיקה.
ניתן להשתמש בבדיקות מכניות מותאמות אישית אלה עם חוטי ניטינול כדי לעורר התנהגויות מעוררות מכנית וליצור עקומת מינון-תגובה התנהגותית מלאה באמצעות בדיקות מכניות תמימות ומזיקות בעוצמה משתנה. כפי שתוצאות הבדיקה ההתנהגותית הללו מוכיחות, בדיקות המפעילות לחץ של 200 קילופסקל או פחות אינן מעוררות תגובת גלגול מרתיעה בזחלי דרוזופילה. כצפוי, בדיקות מכניות תת-סף או לא מזיקות אלה אינן מעוררות נזק גלוי לרקמות עצביות.
לעומת זאת, סף סופר או בדיקות מזיקות מעוררים תגובה התנהגותית מוגברת כמו גם נזק לרקמות לנוירונים החושיים ההיקפיים עצמם באופן תלוי מינון. בדיקות אלו יכולות לשמש גם למדידת רגישות יתר מכנית לאחר פציעה. כ-20% מהזחלים מגיבים בגלגול מרתיע כבר שעתיים לאחר הטיפול ב-UV, בעוד ש-50% הגיבו ארבע שעות בהשוואה לבעלי חיים מדומים שעברו קרינת UV.
מכיוון שהגשושית ששימשה לניתוח זה הייתה בדרך כלל תת-סף של 200 קילופסקל, תגובה זו נחשבה לאלודיניה מכנית. בנקודות זמן מאוחרות יותר, התגובה ההתנהגותית של הזחלים שטופלו ב-UV מוגברת מעט אך אינה שונה סטטיסטית מזו של קבוצת הביקורת המוקרנת המדומה. זחלים שנבדקו עם בדיקה של 462 קילופסקל בארבע, שמונה ו-16 שעות לאחר הטיפול ב-UV הראו עלייה משמעותית בתגובת הגלגול המרתיע כאשר ארבע שעות היו שיא רגישות היתר ההתנהגותית מכיוון שהגירוי היה מזיק בתחילה.
התגובה נחשבה להיפרלגזיה מכנית. הכנת בדיקה ובחירת זחלים ודחיסה הם קריטיים להצלחת התהליך. באמצעות בדיקות אלה הביא את הכאב הבסיסי וניתן למדוד רגישות יתר נוסיספטיבית מכנית לאחר פציעה.
באמצעות כלים ובדיקות אלה, ניתן למדוד את הבסיס המולקולרי והגנטי של כאב מכני ורגישות יתר נוסיספטיבית במודל דרוזופילה הניתן למעקב גנטי.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג בדיקה משופרת למדידת נוציצפציה מכנית בזבובי Drosophila בשלב הזחל, תוך הדגשת קיומה של רגישות מכנית יתר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התנהגותית
- גנטיקה
רקע
- נוציצפציה מכנית חיונית להבנת מנגנוני הכאב.
- זחלי דרוזופילה משמשים כמודל לחקר תגובות נוציצפטיות.
- כלים מותאמים אישית יכולים לשפר את הדיוק של מדידות נוציצפציה.
- הבנת אלודיניה והיפראלגזיה בזחלים עשויה לתרום למחקר רחב יותר על כאב.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה מהימנה להערכת נוציצפציה מכנית בזחלי Drosophila.
- בחינת התגובות ההתנהגותיות הקשורות לרגישות יתר מכנית.
- מתן מסגרת למחקרי גנטיקה ומולקולריה עתידיים בנושא נוציצפציה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בניית גששים מכניים באמצעות סיבי Nitinol.
- הכנת זחלי Drosophila לבדיקות נוציספציה.
- הפעלת לחץ מבוקר להערכת תגובות התנהגותיות.
- תיעוד וניתוח של תגובות הזחלים לגירויים מכניים.
תוצאות עיקריות
- גששים המפעילים פחות מ-200 kilopascals אינם מעוררים תגובות סלידה.
- גששים בלחץ גבוה יותר גורמים לרגישות יתר התנהגותית משמעותית.
- התגובות משתנות עם הזמן לאחר הפגיעה, מה שמעיד על שינויים נוציצפטיים דינמיים.
- אלודיניה מכנית והיפראלגזיה נצפו בזחלים שטופלו ב-UV.
מסקנות
- גששים מכניים מותאמים אישית יעילים לחקר נוציספציה (תחושת כאב) בזחלים.
- ניתן למדוד באופן כמותי נוציספציה בסיסית ורגישות-יתר.
- בדיקה זו מספקת תובנות לגבי הבסיס הגנטי של תגובות נוציספטיביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת מדידה כמותית של נוציצפציה מכנית ורגישות-יתר במודל שניתן לטיפול גנטי, ובכך היא תומכת בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים במחקר הכאב. באמצעות מתן יכולות של תגובה למנה, מגירויים שאינם מזיקים ועד לגירויים מזיקים, היא מקלה על סריקה פרה-קלינית של מועמדים לאנלגזיים ועל גילוי סמנים ביולוגיים. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מידול של פנוטיפים של אלודיניה והיפראלגזיה דמויי-אדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי כאב מכניים ומנגנוני רגישות יתר.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות באיתות נוציצפטיבי.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי מידול פנוטיפים של רגישות יתר הרלוונטיים לבני אדם (allodynia ו-hyperalgesia).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכשרת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות בהמשך התהליך באמצעות גירויים מכניים סטנדרטיים.
- ערך תפעולי: הבטחת הדירות של הבדיקה ותוצרים כמותיים בין מעבדות שונות ובין סדרות ניסויים.
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת משנים גנטיים או מולקולות קטנות המשפיעות על ספי nociceptive.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מדגים רגישות-יתר רלוונטית למחלה בעקבות נזק לרקמות, בדומה למצבי כאב קליניים.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מבוססות סיכון על ידי כימות של רגישות נוציצפטיבית לאורך זמן לאחר הפגיעה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקד בתיקוף חזוי של מטרות המודולות רגישות-יתר מכנית, ולא רק בנוציצפציה בסיסית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני של מועמדים לאנלגזיה.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות של גנים ומסלולים המודולצים רגישות מכנית ופלסטיות מושרית-פציעה.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות גששים מכויילים היוצרים עקומות תגובה-מינון בטווח לחצים מתחת לסף ועד למעלה מהסף.
- אנליטיקה: מספק תוצאות התנהגותיות כמותיות (תגובת גלגול סולדת) ומדידות לחץ (kilopascals) המאפשרות השוואות בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מתחבר לתיקוף פרה-קליני על ידי מידול אלודיניה מכנית והיפראלגזיה הנצפות בכאב נוירופתי בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ניתנת לשימוש חוזר לתיקוף מטרות של כאב כרוני בפרויקטים ובתחומי טיפול מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי כאב.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מדידות נוציצפציה על פני רקעים גנטיים שונים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go, יעילות הון בסריקה מוקדמת, והפחתת כשלים בשלבים מאוחרים עקב מחסור במודלים חיזויים של כאב.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לאנלגזיים בהתבסס על יעילות הוויסות של רגישות-יתר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, במיקרו-כירורגיה ובכיול מכני.
- דורש ציוד הכולל מיקרוסקופים סטריאוסקופיים, מדי כוח וכלי להכנת סיבים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של נהלי ייצור הגששים וקביעת שלבי ההתפתחות של הזחלים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת השיטה למודלים של חרקים אחרים או לשלבי התפתחות שונים.
- מוגבל בשל הצורך בכיול ידני של הגשש ובשימור עקביות היישום התלויה במפעיל.
