בניית מערכת תאורה פשוטה ומגוונת לניסויים אופטוגנטיים
12 בינואר 2021
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים אופטוגנטיים לבקרת ביטוי גנים באור אדום ואדום רחוק באמצעות PhyB ו-PIF3. כלולות הוראות שלב אחר שלב לבניית מערכת תאורה פשוטה וגמישה, המאפשרת שליטה על ביטוי גנים או אופטוגנטיקה אחרת באמצעות מחשב.
המערכת מאפשרת לחוקרים לבנות בקלות מערכת תאורה זולה ורב-תכליתית לניסויים אופטוגנטיים. היתרונות של טכניקה זו כוללים את היכולת לתכנת את תזמון תאורת ה- LED באורכי גל זמינים המשתרעים על פני ספקטרום ה- IR הקרוב הנראה, וכי ניתן להשתמש בנורות ה- LED במגוון הקשרים כדי לבנות מעגל חשמלי, חבר את לוח המעגל המודפס על הידיים המסייעות והכנס את חוטי המגשר, חיבור אותם ליצירת חורי הסיכה A1 ו- A3 לקרקע, חוט המגשר D2 לתוך חור הסיכה D6, וספק הכוח בתוספת חוטי המגשר מספר שבע לתוך חור הסיכה A7. כופפו את הטרמינלים 45 מעלות והוסיפו שטף.
לאחר ההלחמה, קצצו את גב החוטים. הכנס קצה אחד של החוט הנשי המולחם למחבר חוט לתוך חור A5. לאחר מכן חבר קצה אחד של הנגד לחור A5.
חבר את הקצה השני של המחבר לאדמה. לאחר מכן חברו את הקצה השני של הנגד לקרקע והלחכו את החיבור. עבור מחבר הארדואינו, כווץ את קצות החוט למחברי חוט ודחף את הקצוות המכווצים דרך המחבר המלבני.
כדי להגדיר את נורות ה-LED, יש לצבוע חוט על ידי חימום מלמטה תוך הוספת הלחמה מלמעלה. הניחו כמות נדיבה של הלחמה על קצה ההלחמה הגדול והשתמשו בקצה כדי לחמם את בסיס הלד במגע המכיל שטף. לאחר מספר שניות, גררו בנפרד את ההלחמה על פני כל מגע וקבעו את החוט השחור על הקתודה באמצעות קליפס לשיער.
הניחו כמות נדיבה של הלחמה על קצה ההלחמה הגדול, ולחצו את הקצה על החוט עד שההלחמה בבסיס הלד נמסה. החזיקו את החוט והסירו את מגהץ ההלחמה תוך החזקת החוט במקומו. הניחו כמות קטנה של משחת הלחמה על הרפידות עבור חיבורי ה-LED והשתמשו במלקחיים כדי להניח את ה-LED מעל הרפידות.
החזק את החוט האדום המשומר מראש על האנודה והשתמש בקליפס לשיער כדי לגזור את החוט. מוסיפים את ההלחמה לקצה הגדול כפי שהודגם ולוחצים את הקצה על החיבור עד שההלחמה בבסיס הלד נמסה ומשחת ההלחמה נמסה והופכת לכסף. להכנת חוטי ה- LED, הניחו צינור כיווץ 4.76 מ"מ מעל החוט החתוך לאורך וצינור כיווץ 3.18 מ"מ מעל מחבר החוט לחוט.
מפשיטים ומוסיפים שטף לקצוות החוטים. השתמש בידיים המסייעות כדי לחבר את החוט למחבר חוט ולסובב את קצה המחבר בקצה חוט אחד. הלחמתו את החומרים יחד וחברו את החוט השני למערך באותו אופן והלחמה.
לאחר מכן חבר את חוטי ה- LED לידיים המסייעות עם סרט מתחת לבסיס ה- LED. לאחר מכן, מערבבים אפוקסי בהתאם להוראות היצרן ומפזרים את האפוקסי על החלק העליון של נורית ה- LED המולחמת. באמצעות מקדח שפכטל, קדח חור של 1.5 ס"מ דרך החלק העליון של הקופסה שעליו תוצב נורית ה- LED והשתמש בכלי סיבובי במהירות גבוהה כדי ליצור חריץ בצד אחד של החור כדי לפנות מקום לחוט ה- LED.
הדביקו סרט פרטיות בקוטר 25 עד 30 מ"מ על הקופסה השחורה המכסה את החור שהנורית תאיר דרכו והדביקו את ה-LED מחוץ לקופסה השחורה על גבי החור. עבור מערכת בקרה בעלת ארבע נוריות, קדח ארבעה חורים בקוטר 0.83 ס"מ זה מזה בהפרש של 3.81 ס"מ לתוך מכסה התיבה והשתמש בכלי סיבובי במהירות גבוהה כדי לחתוך חור מלבני בגודל 1.19 על 1.90 ס"מ לפינה השמאלית העליונה. בעזרת מקדח שפכטל, קודחים חור של 1.5 ס"מ בחלק האחורי של הקופסה ומכניסים גרומט לתוך החור.
עבור נוריות LED הנשלטות על ידי מחשב, נייר זכוכית את האזור שבו המיקרו-בקר יודבק בקופסה, כמו גם את הצד התחתון של מחזיק המיקרו-בקר. הצמד את המיקרו-בקר למחזיק ולאחר מכן אפוקסי את המחזיק ואת הקופסה יחד לפני שאבטח את המחזיק בקופסה השחורה. לאחר מכן הניחו סרט דו-צדדי על התפס ואבטחו את הקליפ בתוך הקופסה.
בדגימות שעברו ביטוי לפיטוכרום B אך לא לפיקוציאנין בילין, הדליפה גדלה ככל שכמות הדנ"א של הכתב גדלה. בנוסף, כאשר כל מתג הגן של פיטוכרום B, כולל כרומופור פיקוציאנין בילין המייצר פלסמיד, מוארים באור אדום רחוק, ביטוי הלוציפראז גדל גם הוא עם הכמויות ההולכות וגדלות של מבנה הכתב בתוך תערובת הטרנספקציה. באופן דומה, כאשר התאים הרגישים לאור מוארים באור אדום, ביטוי לוציפראז גדל גם הוא עם כמות המדווח הגדלה.
כאשר משווים את רמות האינדוקציה של התאים שטופלו באור אדום לתאים שטופלו באור אדום רחוק, נמצאה ירידה קטנה בהפעלת הקיפול עם כמויות הולכות וגדלות של כתבים. חשוב לעקוב בקפידה אחר כל שלב בעת בניית המעגל החשמלי ולבדוק שוב את מספרי חורי הסיכה שורה אחר שורה לפני הלחמה של כל רכיב. פרוטוקול זה יכול לשמש לגירוי אופטי של סוגים רבים של דגימות או כלים אופטוגנטיים באמצעות מגוון אורכי גל ומאפשר תכנות של לוחות זמנים של תאורה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את בנייתו של מערכת תאורה רב-תכליתית לניסויים אופטוגנטיים, המאפשרת שליטה בביטוי גנים עם אור אדום ואור אדום רחוק. הוראות שלב אחר שלב מסופקות לבניית המערכת ותכנות תאורת ה-LED.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אופטוגנטיקה
- שליטה בביטוי גנים
- מערכות תאורה
רקע
- אופטוגנטיקה מאפשרת שליטה מדויקת בפונקציות תאיות באמצעות אור.
- PhyB ו-PIF3 הם רכיבים מרכזיים בוויסות גנים רגישים לאור.
- ניתן לתכנת LED ללוחות זמנים שונים של תאורה.
- מערכת זו מתוכננת להיות חסכונית וניתנת להתאמה להגדרות ניסויים שונות.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לבניית מערכת תאורה אופטוגנטית.
- לאפשר לחוקרים לשלוט בביטוי גנים באמצעות אורכי גל ספציפיים.
- להקל על השימוש בכלים אופטוגנטיים בהקשרים ניסיוניים מגוונים.
שיטות בשימוש
- בניית מעגל חשמלי לבקרת LED.
- תכנות זמני תאורת LED ואורכי גל.
- הרכבת מיקרו-בקר לשליטה אוטומטית.
- בדיקת המערכת עם מבני רפורטרים שונים.
תוצאות עיקריות
- בנייה מוצלחת של מערכת תאורה גמישה.
- עלייה בביטוי לוציפראז שנצפתה עם כמויות DNA רפורטר גבוהות יותר.
- הוכחת שליטה על ביטוי גנים באמצעות אור אדום ואור אדום רחוק.
- המערכת מאפשרת גירוי אופטי על פני סוגי דגימות שונות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לניסויים אופטוגנטיים.
- חוקרים יכולים להשתמש במערכת זו ליישומים שונים בוויסות גנים.
- הקפדה על הפרוטוקול מבטיחה תוצאות מוצלחות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
