בידול תאי קודמן עצבי הנגרמת על ידי שדה חשמלי בהתקנים מיקרופלואידיים
14 באפריל 2021
במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבידול של גזע עצבי ותאי אב (NPCs) המושרה אך ורק על ידי גירוי דופק זרם ישיר (DC) במערכת מיקרופלואידית.
מחקר זה מציג פרוטוקול לבידול של תאי מבשר עצביים הנגרמים אך ורק על ידי גירוי דופק זרם ישיר במערכת מיקרופלואידית. טכניקה זו מספקת גישה מועילה להפחתת זמן ההתקנה הניסיוני, נפח הדגימה ונפח ריאגנט. יתר על כן, שבב MOE מתאים לתצפיות מיקרוסקופיות קונפוקאליות.
טיפול דופק זרם ישיר פשוט יכול לשלוט על גורלם של תאים מבשר עצבי העכבר והוא יכול לשמש לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עבור הפרעות במערכת העצבים. כדי להתחיל, צייר תבניות עבור שכבות PMMA בודדות והקלטת הדו-צדדית המשתמשת בתוכנה המתאימה. הפעל את סופר לייזר פחמן דו חמצני ולחבר אותו למחשב אישי.
פתח את קובץ התבנית המעוצב באמצעות התוכנה. הנח את יריעות ה- PMMA או את הסרט הדו-צדדי על הפלטפורמה של סופר הלייזר ולאחר מכן מקד את הלייזר על פני השטח של יריעות PMMA או על הקלטת הדו-צדדית באמצעות כלי המיקוד האוטומטי. בחר את סופר הלייזר כמדפסת ולאחר מכן השתמש בסופר הלייזר כדי להפעיל את ההבלציה הישירה בגיליון PMMA או בקלטת דו-צדדית.
הסר את סרט המגן מסדיני PMMA ולנקות את פני השטח באמצעות גז חנקן. עבור מליטה יחד שכבות מרובות של יריעות PMMA, מחסנית שלוש חתיכות של יריעות PMMA מילימטר אחד לקשר אותם תחת לחץ של חמישה קילוגרמים לסנטימטר מרובע בונדר תרמי במשך 30 דקות ב 110 מעלות צלזיוס כדי ליצור את זרימת או הרכבת ערוץ גירוי חשמלי. הדבק 12 חתיכות של מתאמים לפתחים הבודדים בשכבה אחת של הרכבה שבב MOE עם דבק cyanoacrylate משחק מהיר.
לחטא את מצעי PMMA מילימטר אחד, את הקלטת דו צדדית, ואת PMMA כיתה אופטית שלושה מילימטר באמצעות הקרנה אולטרה סגולה במשך 30 דקות לפני הרכבת השבב. הדבק את מצעי PMMA מילימטרי אחד על PMMA כיתה אופטית שלושה מילימטר עם קלטת דו צדדית כדי להשלים את הרכבת PMMA. הדבק את כיסויי הכיסוי הנקיים להרכבת PMMA עם הקלטת הדו-צדדית.
אטמו את פתחי מתאמי גשר אגר עם תקעים לבנים צמודים לאצבע. חבר את המחבר התחתון השטוח למכלול שבב ה- MOE באמצעות מתאמי כניסת ושקע הבינוניים ולאחר מכן חבר את מתאם חרוט Luer למכלולי העצירה התלת-כיווניים. הוסף שני מיליליטר של פתרון 0.01%PLL באמצעות מזרק שלושה מיליליטר שמתחבר לעצירה תלת כיוונית של כניסת בינונית, ולחבר מזרק ריק שלושה מיליליטר לעצירה תלת כיוונית של השקע הבינוני.
מלא את אזורי תרבות התאים בתמיסת PLL, ולאט לאט לשאוב את פתרון הציפוי קדימה ואחורה. סגרו את שני העצירה המשולשת כדי לאטום את הפתרון בתוך אזורי התרבות. דגירה שבב MOE ב 37 מעלות צלזיוס לילה באינקובטור מלא 5% פחמן דו חמצני אטמוספירה.
פתח את שני stopcocks שלוש דרך לשטוף את בועות בערוצים על ידי שאיבה ידנית של פתרון הציפוי הלוך ושוב בערוץ באמצעות שני מזרקים. צייר שלושה מיליליטרים של מדיום שלם לתוך מזרק שלושה מיליליטר שמתחבר לעצירה תלת כיוונית של הכניסה הבינונית ולהוסיף אותו כדי להחליף את פתרון הציפוי באזורי תרבות התא. החלף את התקע הלבן ההדוק באצבע במתאם Luer והזרק 3% agarose חם כדי למלא את המתאם.
חבר את מזרק מנעול Luer למתאם Luer והזרק 3% חם agarose דרך באנג גומי שחור כדי למלא את מזרק מנעול Luer. אפשר 10 עד 20 דקות עבור agarose להתקרר ולחזק. התקן את שבב MOE זרע התא על תנור ITO שקוף כי הוא מהודק על שלב ממונע XYZ לתכנות נשמר ב 37 מעלות צלזיוס.
להחדיר את mNPCs על ידי שאיבה ידנית לתוך שבב MOE דרך השקע הבינוני, ולאחר מכן דגירה שבב MOE זרע התא על תנור ITO במשך ארבע שעות. השתמש בחוטי חשמל כדי לחבר מולטיפלקסר EF לשבב MOE באמצעות האלקטרודות בשבב. חבר מולטיפלקסר EF ומחולל פונקציות למגבר כדי ליצור פולסים DC של גל מרובע.
הסר את כל המחבר התחתון השטוח והמתאמים בשבב MOE ומלא את המתאמים ב- PBS ולאחר מכן אטום את פתחי המתאם בפרפילם. לאחר immunostaining, להתבונן בתאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. גירוי הדופק DC הביא MNPCs בו זמנית הבחנה לתוך נוירונים, אסטרוציטים, ו oligodendrocytes במדיום תחזוקת תאי גזע.
אחוזי הנוירונים, האסטרוציטים והאוליגודנדרוציטים בקבוצת הביקורת ובקבוצת הגירוי מוצגים כאן. לאחר טיפול הדופק DC, mNPCs הביעו מספרים גבוהים באופן משמעותי של נוירונים ב DIV שבע, אסטרוציטים ב DIV שלוש, ו oligodendrocytes ב DIV שבע ו DIV 14 היו נוכחים ברמות גבוהות יחסית בקבוצות הגירוי מאשר בקבוצת הביקורת. נוירוספרות שנוצרו על ידי 30 עד 40 תאים עדיפים על ייזום בידול mNPC.
גרימת יתר של mNPCs תפגע בהישרדות התאים במהלך תהליך הבידול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לגילוי של תאי אב עצביים המושרים על ידי גירוי של פולסי זרם ישר במערכת מיקרופלואידית. טכניקה זו מקצרת את זמן הקמת הניסוי ומפחיתה את נפח הדגימות ונפח הריאגנטים, מה שהופך אותה ליעילה עבור יישומים מחקריים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
רקע
- תאי אב עצביים (NPCs) חיוניים להבנת ההתפתחות העצבית.
- גירוי באמצעות פולסים של זרם ישר יכול להשפיע על גורל התא.
- מערכות מיקרופלואידיקה מאפשרות בקרה מדויקת של תנאי הניסוי.
- גישה זו עשויה לסייע בפיתוח טיפולים להפרעות של מערכת העצבים.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן לגביה של תאי NPC.
- שימוש בגירוי באמצעות זרם ישר כשיטה לשליטה על גורל התא.
- הדגמת היעילות של מערכת מיקרופלואידית במחקרים במדעי העצבים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון תבניות עבור שכבות PMMA וסרט דביק דו-צדדי.
- שימוש בחושב לייזר לפחמן דו-חמצני (carbon dioxide) לצורך הייצור.
- יישום גירוי פולסים של זרם ישר על NPCs.
- ביצוע תצפיות במיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- דיפרנציאציה מוצלחת של NPCs באמצעות הפרוטוקול המוצע.
- צמצום בזמן הגדרת הניסוי ובשימוש במשאבים.
- היתכנות של שימוש בשבב MOE לצורך מיקרוסקופיה.
- יישומים פוטנציאליים באסטרטגיות טיפוליות להפרעות של מערכת העצבים.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע גישה יעילה להבחנה של NPC.
- גירוי באמצעות זרם ישר יעיל בבקרת גורל התא.
- מערכות מיקרופלואידיות משפרות את היעילות הניסויית במדעי העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמה מיקרופלואידית זו מאפשרת בקרה מדויקת של התמיינות תאי אב עצביים באמצעות גירוי בפולסים של זרם ישר, ומספקת מודל ניתן להרחבה ויעיל במשאבים לתיקוף מטרות במחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים. על ידי הפחתת המורכבות הניסויית וצריכת הריאגנטים, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים ובביטחון חיזוי באסטרטגיות לוויסות גורל התא. התאימות של המערכת לגירוי ארוך טווח ולדימות אוטומטי מאפשרת את שילובה בתהליכי גילוי המתמקדים בטיפולים למערכת העצבים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של רמזים חשמליים כווסתים של גורל תאי אב עצביים, ובכך תומך בבדיקת השערות לגבי מטרות במסלולים של התפתחות עצבית.
- ערך תפעולי: מפחית את נפחי הדגימות והריאגנטים באמצעות כליאה במיקרופלואידיקה, ובכך מוריד עלויות במערכי סריקה מוקדמים של מטרות.
- ערך ניבוי: מספק קריאות כמותיות של התמיינות נוירונלית, אסטרוציטית ואוליגודנדרוציטית, מה שמאפשר קבלת החלטות מבוססות נתונים לגבי המשך או הפסקת מחקר (go/no-go) עבור מטרות מווסתות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצרי דיפרנציאציה סטנדרטיים וניתנים לשחזור תחת פרמטרים מבוקרים של שדה חשמלי, המתאימים לאופטימיזציה של בדיקות (assays).
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקה של מספר תנאים במקביל באמצעות תכנונים מבוססי תעלות, ובכך מגביר את התפוקה בהערכת תרכובות או גירויים.
- מוכנות לבדיקה: תומך בתרביות ארוכות טווח ובדימוי בשיטת time-lapse, מה שמאפשר פרופיל קינטי של דינמיקת הדיפרנציאציה לצורך תיקוף הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שימוש בתאי אב עצביים של עכברים בסביבה מיקרוסקופית מוגדרת, מה שמגביר את הרלוונטיות לתהליכי התמיינות עצבית in vivo.
- מידול פרה-קליני: תומך ביצירת שושלות גליאליות ונוירונליות מאב קדמון משותף, דבר המועיל למידול הפרעות של מערכת העצבים.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר הערכה של נטיית התמיינות תחת גירוי, מה שמספק מידע עבור פרופיל בטיחות ויעילות מכניסטי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ובמיוחד בשלבי תיקוף המטרה (target validation) וזיהוי מובילים (lead identification), שבהם הבנה מכניסטית של רגולטורים של גורל התא היא קריטית. היא תומכת במערכי סריקה על ידי אספקת מערכת מבוקרת וכמותית להערכת הפעילות הביולוגית של מודולטורים חשמליים או פרמקולוגיים. פלט הפלטפורמה – מדדי דיפרנציאציה ספציפיים לשושלת תאים – מוזן לצנרת ניתוח המשמשת לתעדוף מטרות עם ביטחון חיזוי במנגנוני שיקום עצבי.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות על מסלולי איתות ביו-חשמליים בתאי מוצא עצביים, ובכך מפחית את העמימות לגבי המנגנון המטרה.
- סריקה: מאפשר ביצוע בדיקות דיפרנציאציה כמותיות וניתנות לשחזור תחת גרייה חשמלית מוגדרת, מה שמשפר את מהימנות הבדיקה.
- אנליטיקה: מספק נקודות קצה מדידות (למשל, % neurons, astrocytes, oligodendrocytes) לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: ממדל דינמיקת דיפרנציאציה הרלוונטית להפרעות במערכת העצבים, ובכך תומך ברציפות הפרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכנן לשימוש חוזר במגוון תנאים ניסיוניים, ובכך מקדם סטנדרטיזציה ועקביות בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון באימות המטרה על ידי בידוד הגירוי החשמלי כמשתנה מוגדר בקביעת גורל התא.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דיפרנציאציה באמצעות דיוק מיקרופלואידי, ובכך משפר את השחזוריות בין אתרים וצוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות של go/no-go על ידי אספקת תוצאות מכניסטיות מוקדמות על מחויבות לשושלת תאים (lineage commitment), ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות המווסתות דיפרנציאציה עצבית בהתאמה לסיכון, ובכך משפר את יעילות ההון בפורטפוליים של מדעי העצבים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהרכבת התקני מיקרופלואידיקה, אלקטרופיזיולוגיה ותרבית של תאי גזע עצביים.
- תלוי בגישה לכלי ייצור בלייזר, מחממי ITO, מפלסי EF ומערכות מיקרוסקופיה הפוכה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרמטרים חשמליים (רוחב פולס, תדירות, אמפליטודה) לאורך הניסויים לצורך קבלת תוצאות הדירות.
- הסתגלות לתאי אב עצביים ממקור אנושי עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרמטרי הגירוי ותנאי התרבית.
- יציבות אלקטרודות לטווח ארוך וזיהום ביולוגי (biofouling) במחקרי גירוי כרוניים מהווים מגבלות מעשיות שיש לקחת בחשבון.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
