ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי
5 בדצמבר 2020
אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.
מחקרים מולקולריים מסורתיים של המוח הקטן נעשו על תמציות שלמות של המוח הקטן, מה שעשוי להסוות כל הבחנה בין אזורים ספציפיים במוח הקטן. פרוטוקול זה מאפשר להעריך אזורים מובחנים של המוח הקטן בנפרד ומאפשר לחקור מנגנונים מולקולריים שעשויים לעמוד בבסיס תרומתם הייחודית למגוון התנהגויות והתקדמות המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת דיסקציה ניתנת לשחזור ומהיר של ארבעה אזורי מוח קטן, גרעיני המוח העמוק, קליפת המוח הקדמית והאחורית של ורמיס וקליפת המוח הקטן של חצאי הכדור.
לאחר עריפת ראשו של העכבר שהורדם, בצע חתך עם סכין גילוח לאורך הקו הסגיטלי המדיאלי של הראש, החל מהאף והמשך כל הדרך חזרה. הפרד את העור והשתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך את השריר מכל צד, ולחתוך מעבר לתעלות האוזן. בעזרת מספריים מנתחים, חתוך אזורים רבים בחוט השדרה עד למקום שבו גזע המוח פוגש את המוח הקטן, והקפיד לא לפגוע במוח הקטן.
הכנס את אחד מלהבי המספריים של כלי הדם לחלל שבין גזע המוח לעמוד השדרה וחתוך לכיוון תעלת האוזן, הרם כלפי מעלה תוך כדי חיתוך כדי להגביל את הנזק לרקמה. המשיכו לחתוך לאורך קצה הגולגולת כלפי מעלה לכיוון נורות הריח. בעזרת המלקחיים הקהים, קלפו בעדינות את החלק האחורי של הגולגולת הזו כדי לחשוף את האזור האחורי של המוח והמוח הקטן.
מקם את המלקחיים הקהים לאורך הקצה החתוך של הגולגולת וקילף את הגולגולת למעלה ומעל המוח. חתוך את שאר הגולגולת עם המספריים של כלי הדם והמלקחיים הקהים, ונקה את רובה מהחלק העליון של המוח. הרם מעט את המוח בעזרת מרית המיקרו כדי להסיר את נורות הריח מהגולגולת שנותרה ולנתק את סיבי דרכי הראייה.
המוח אמור להשתחרר בקלות בשלב זה. הכניסו את המוח לתוך צלחת הפטרי, יושבים על קרח והסירו את כל הגולגולת שנותרה או פסולת אחרת. הנח בעדינות את המוח לתוך מטריצת המוח כשהצד הגבי כלפי מעלה.
וודא שהוא מוגדר ברמה במטריצה ושקו האמצע נמצא במרכז. הנח סכין גילוח אחד לאורך קו האמצע הסגיטלי, וודא שהלהב דוחף עד לתחתית המטריצה. הנח סכין גילוח נוסף מילימטר אחד לצד הלהב הראשון.
הניחו שני להבים נוספים וכתוצאה מכך שלושה להבים ממוקמים בצד אחד של המוח, כולם במרחק של מילימטר אחד זה מזה. חזור על זה בצד השני. תפוס בזהירות את הקצה הקדמי והאחורי של סכיני הגילוח, והרם אותם ישר מהמטריצה.
השלך את הרקמה בחלק החיצוני של סכיני הגילוח. לאט, הפרד סכין גילוח אחד בכל פעם מהאחרים והקפיד לא לפגוע בקטעי הרקמות. החלק את חלק הטישו מסכין הגילוח ואל מגלשת הזכוכית בעזרת מרית המיקרו
.יש לאסוף שישה קטעי מוח סגיטליים. בחלקים הרוחביים הקדמיים יהיה DCN גלוי. כדי לבודד את ה-DCN, החזק קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר בניצב מעל ה-DCN ודחף כלפי מטה דרך הרקמה המתנדנדת בחוזקה לכל הכיוונים.
הרם את הפיפטה כלפי מעלה ואשר חזותית את נוכחות הרקמה בקצה. הניחו אצבע אחת בחלק העליון של הקצה ודחפו כלפי מטה, מה שגורם לרקמה לבלוט החוצה. הכנס את הקצה לתוך צינור מיקרופיש עם תווית נכונה וודא שאגרוף הרקמה ממוקם בתחתית הצינור.
חזור על כך עבור שלושת החלקים הנותרים, והנח את אגרופי ה-DCN באותו צינור. הבזק הקפיא את הצינור בחנקן נוזלי. דחפו את שאר רקמת המוח סביב המוח הקטן בחלקים שבהם חולץ ה-DCN.
השתמש במלקחיים קהים כדי להרים בעדינות את חלקי קליפת המוח הקטן הללו בחצי הכדור ולהניח אותם בצינורות המיקרופיש המתאימים, ואז להקפיא אותם במהירות הבזק. עבור שני החלקים הוורמליים האחרונים, דחפו את רקמת המוח שמסביב כדי להשאיר רק את המוח הקטן. בעזרת סכין גילוח, בצע חתך המפריד בין השפתיים הקדמיות לשפתיים האחוריות.
ודא שהחתך הוא מיד לאחר היווצרות השפתיים שש ואינו כולל שפתיים 10. בעזרת מלקחיים קהים, הניחו בזהירות את חלקי קליפת המוח הקדמית ואת חלקי קליפת המוח האחורי לתוך צינורות המיקרופיש שלהם והקפיא אותם על ידי השארת הצינורות בחנקן נוזלי למשך חמש דקות. הניחו את צינורות המיקרופיש על קרח כדי למנוע מהרקמה להפשיר מהר מדי ומרחו 150 מיקרוליטר של תמיסת בידוד RNA קרה בצינור המיקרופיש, ואז הפכו להומוגניזציה עם עלי מעוקר.
לאחר שהרקמה הומוגנית, פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה כדי להבטיח שלא נותרה רקמה שלמה. יתר על כן, שברו את כל חלקי הרקמה הקטנים על ידי משיכתם למעלה למזרק אינסולין מספר פעמים. מוסיפים עוד 350 מיקרוליטר של המגיב, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב ונותנים לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
מוסיפים 150 מיקרוליטר כלורופורם לצינור ומנערים אותו במרץ, ואז נותנים לו לנוח שתיים-שלוש דקות. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G ב -15 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר בזהירות את הצינורות מהצנטריפוגה והגדר את טמפרטורת הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס.
העבירו רק את השלב המימי הצלול לצינור חדש, והקפידו לא לשבש את השלב האטום. שמור או השליך את התמיסה שנותרה בצינורות. הוסף 100% אלכוהול איזופרופיל ביחס של אחד לשניים וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
הניחו לדגימה לנוח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לזרז את ה-RNA מהתמיסה. צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך הצבת כל הצינורות באותו כיוון כדי להקל על הדמיית הגלולה. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הצינורות והסר את הסופרנטנט עם הפיפטה, והקפד לא לשבש את הגלולה.
הגלולה דמוית ג'ל וקשה לראות, אז העריכו היכן היא מבוססת על כיוון הצינורות בצנטריפוגה. לאחר הסרת כל הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר של אתנול 75%, מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 7, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט בזהירות, מבלי לשבש את הגלולה.
השאירו את הפקקים פתוחים לייבוש הדגימה למשך חמש עד 10 דקות. לאחר הייבוש, השעו מחדש את הגלולה במים החופשיים של ה-DNA ב-20 מיקרוליטר לדגימות עבור DCN ו-30 מיקרוליטר עבור כל האחרים. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
פרוטוקול זה שימש לניתוח ארבעה אזורים נפרדים במוח הקטן של העכבר ולחקירת הבדלים אזוריים בביטוי גנים. רמות הביטוי של אלדולאז C, פרוואלבומין ו-KCNG4 הוערכו באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. אלדולאז C מתבטא יותר בוורמיס המוח האחורי.
אך נמוך יותר ב- DCN ובאזור הקדמי של הוורמיס בהשוואה לדיסקציה המוחי בתפזורת. פרוואלבומין קיים באופן דומה בוורמיס הקדמי DCN, הוורמיס האחורי וקליפת המוח ההמוחי של חצי הכדור, בהשוואה לתמציות מוח בתפזורת. KCNG4 מועשר באופן משמעותי ב-DCN ובוורמיס הפנימי, אך לא בוורמיס האחורי או בהמיספרות בהשוואה למיצוי בתפזורת.
כדי להשוות ישירות את הביטוי של אלדולאז C על פני קליפת המוח הקטן, רמות הביטוי הושוו לוורמיס הקדמי. רמת הביטוי של אלדולאז C הייתה גבוהה משמעותית בוורמיס האחורי ומגמת עלייה בהמיספרות המוח הקטן. ה-RNA המופק מאזורים אלה יכול לשמש גם בריצוף RNA, ניסויים.
השוואת RNA לאזורי המוח הקטן תספק מידע מפורט יותר על מנגנונים מולקולריים, העומדים בבסיס הפונקציות הבדידות של אזורים אלה. כמו גם הבדלים פוטנציאליים בפגיעות שלהם במחלות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לניתוח מהיר וניתן לשחזור של אזורים מובחנים בדגיון (cerebellum)—במינהם ההמיספרים, האזורים הקדמיים והאחוריים של התולעת (vermis), והגרעינים העמוקים של הדגיון. המטרה היא להבהיר הבדלים מולקולריים בביטוי גנים העשויים להוות בסיס לפלטי התנהגות ייחודיים הקשורים לאזורים ספציפיים בדגיון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- ביטוי גנים
רקע
- המוח הקטן (cerebellum) ידוע כמשפיע על פלטי התנהגות שונים.
- מחקרים מסורתיים מנתחים לעיתים קרובות תמציות של המוח הקטן כולו, דבר שעלול להסוות הבדלים אזוריים.
- גישה ממוקדת עשויה לסייע בחשיפת מנגנונים מולקולריים ספציפיים באזורים נפרדים של המוח הקטן.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לבידוד RNA מאזורים ספציפיים בדגימות של המוחיקל (cerebellum).
- השוואת ביטוי גנים בין אזורים שונים במוחיקל.
- סיוע בחקר הבסיס המולקולרי של התנהגות ומחלות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השיטה כוללת דיסקציה של אזורי המוח הקטן מעכברים שהורדמו.
- המודל הביולוגי המרכזי כולל רקמות מהמוח הקטן של עכבר.
- RNA מבודד מעובד לצורך ניתוח ביטוי גנים.
- שלבים פרוצדורליים קריטיים כוללים דיסקציה זהירה, הקפאה מהירה (flash freezing) והומוגניזציה של הרקמה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר זיהוי של הבדלים מולקולריים בין אזורים שונים בדגמרי (cerebellum).
- הממצאים כוללים תובנות לגבי האופן שבו אזורים ספציפיים עשויים לתרום באופן ייחודי להתנהגות.
- תהליך זה מאפשר בחינה של שינויים בביטוי גנים הרלוונטיים לתפקוד הדגמרי.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה חדשנית להפרדה ולניתוח של אזורים בדגיליה (cerebellum) לצורך מחקרים מולקולריים.
- גישה זו מקלה על הבנת הקשר בין מנגנונים הספציפיים לאזורים בדגיליה לבין תוצאות התנהגותיות.
- התובנות שיושגו עשויות לקדם את הידע על הבסיס המולקולרי של מעורבות הדגיליה במחלות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח אזורי של ה cerebelllum מאפשר ניתוח מולקולרי מדויק של אזורי מוח מובחנים, ובכך נותן מענה למגבלה מרכזית במחקרי מדעי המוח שבה תמציות של רקמה שלמה מטשטשות את ההטרוגניות התפקודית. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי קישור דפוסי ביטוי גנים לתתי-אזורים ספציפיים של ה-cerebellum המעורבים במסלולי תנועה, קוגניציה, רגש ותגמול. על ידי הבטחת בידוד הדירות של רקמה מאזורים אנטומיים מוגדרים, השיטה מגבירה את הביטחון בניבוי במודלים פרה-קליניים ומספקת מידע להפחתת סיכונים מכניסטיים בתוכניות לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד חתימות מולקולריות מאזורים בדגידון המעורבים בבקרה מוטורית ובתפקודים נוירופסיכיאטריים.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית לניתוח של גרעיני דגידון עמוקים, קורטקס ורמיסלי (vermal cortex) וקורטקס המיספירות, ובכך מפחית שונות בניתוחים אומייים (omics) המשכיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תכלילי RNA ספציפיים לאזורים המתאימים ל-qPCR ול-RNA-seq, מה שמאפשר השוואה כמותית של ביטוי גנים בין תתי-אזורים של המוח הקטן (cerebellum).
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הקפאה מהירה (flash-freezing) ופרוטוקולי הומוגניזציה עקביים, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על חקר הפגיעות האזורית במודלים של מחלות באמצעות השוואת פרופילים מולקולריים בין אזורי דגינקלום (cerebellum) המוגדרים אנטומית.
- ערך תפעולי: מאפשר ביו-בנקינג של רקמות מופרדות בטמפרטורה של −80°C, ובכך תומך במחקרי אורך ובהשוואות בין ניסויים במסגרת תהליכי תיקוף מטרות (target validation).
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בזיהוי מטרות מונחה-השערות ובתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת נתונים מולקולריים ברזולוציה אנטומית מהמוח הקטן (cerebellum).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות להצלבת ביטוי גנים (למשל, Aldolase C, parvalbumin, KCNG4) עם תפקוד אזורי של ה-cerebellum.
- סריקה: מייצרת תמציות RNA סטנדרטיות המתאימות לזיהוי ברגישות גבוהה, ובכך מקלה על השוואה מהימנה של מצבים מולקולריים בין תנאים ניסיוניים שונים.
- אנליזה: יוצרת קריאות כמותיות מ-qPCR ו-RNA-seq המאפשרות לצוויות להעריך מעורבות של מטרה (target engagement) וסיגנל של מסלולים בדיוק אזורי.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים מולקולריים לפנוטיפים התנהגותיים על ידי מתן אפשרות לניתוח אזורים הקשורים לרגש, קוגניציה וקוורדינציה מוטורית במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מסגרת ניתוחים שניתן להשתמש בה מחדש ושיש יישום עבורה במגוון זני עכברים ומודלים של מחלות, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול ומסבסד.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי חשיפת מנגנונים מולקולריים ספציפיים לאזור, אשר מוסתרים בניתוחים של כלל הדגיאלון (cerebellum).
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שלבי נתיחה, הקפאה ובידוד RNA סטנדרטיים, ובכך מצמצם שונות טכנית.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי מתן בהירות מנגנונית לגבי מטרות בדגיאלון, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים בתוכניות CNS.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון על בסיס דפוסי ביטוי אזוריים ורלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנורו-אנטומיה ובטכניקות של דיסקציה מיקרו-כירורגית כדי להבטיח הפרדה נקייה של אזורי המוח הקטן.
- תלוי בגישה לציוד קריוגני (חנקן נוזלי, מקפיא −80°C) ובכלי דיוק (מספרי vectory, פינצטה קהה, מיקרו-ספטולה) לטיפול ברקמה.
- מחייב הדרכה סטנדרטית של הצוותים כדי לשמור על עקביות בעומק דגימת הרקמה (tissue punch) ובזיהוי האזורים.
- חייב לקחת בחשבון סיכונים לפירוק RNA על ידי מזעור זמן העיבוד ושמירה על שרשרת קירור מהדיסקציה ועד לסספנסיה מחדש.
- מוגבל על ידי תנובת הרקמה מאזורים קטנים כמו DCN, מה שדורש אופטימיזציה של כמויות הקלט עבור יישומים המשכיים כגון low-input RNA-seq.
