Name: טבילה חלופית בגלוקוז כדי לייצר היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: למדו פרוטוקול לא פולשני ליצירת היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש באמצעות טבילה חלופית בגלוקוז. שיטה זו מאפשרת לחקור את ההשפעות הפיזיולוגיות והרשתיות של סוכרת מסוג שתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להכיר VPC, CJR, ו MCP לפיתוח פרוטוקול זה. EMM קיבלה תמיכה כספית מהמכללה האמריקאית לאמנויות ולמדעים לתואר שני בתמיכת סטודנטים לביצוע מחקר זה. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרס מלון הפקולטה של האוניברסיטה האמריקאית ומימון באמצעות המכללה האמריקאית לאמנויות ולמדעים (שניהם ל- VPC).

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה האמריקאית.
1. הכנת מיכלי הפתרון
<ol><li>השג שישה מיכלים, שניים לכל קבוצת ניסוי (גלוקוז, מניטול ומים). סמן את אחד משני הטנקים 'מיכל דיור' (הוא יאכלס את הדגים) ותתייג את 'מיכל הפתרון' השני (הוא יחזיק את הפתרון). הערה: קבוצת הטיפול במניטול היא השליטה האוסמוטית, וקבוצת הטיפול במים היא בקרת טיפול/מתח. חשוב להפריד בין הטנקים, חברות התעופה/אבני האוויר, המכסים ואספקת הניקוי לכל קבוצת טיפול</li>
	<li>השתמש במיכל 2 L אם המספר הכולל של דגים בשימוש הוא פחות מ 20. השתמש במיכל 4 L אם המספר הכולל של דגים בשימוש הוא יותר מ 20. הערה: יש להשתמש ב-N של 5-10 לכל קבוצת טיפול לכל נקודת זמן דגימה.</li>
	<li>שמור את המיכלים באמבט מים ב 28-29 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת המים.</li>
	<li>ביום הראשון, הניחו את הדגים בפתרונות הטיפול המתאימים להם (גלוקוז, מניטול, מים) למשך 24 שעות ('מים לטיפול'). ביום השני, העבירו את הדגים מפתרונות הטיפול שלהם למים למשך 24 שעות ('טיפול למים'). ביום השלישי מעבירים את הדגים ממים לפתרונות טיפול ('מים לטיפול'). חשיפה מתחלפת זו נמשכת עד סוף הניסוי (איור 1). מעבירים מדי יום דגי בקרה מטופלים במים למים.</li>
	<li>ודא כי הדגים ניזונים ומועברים בתוך אותו חלון של שעתיים בכל יום לאורך כל הניסוי.</li>
</ol>2. הכנת הדגים
<ol><li>השתמש זברה למבוגרים (4 חודשים – 1 שנה)5.</li>
	<li>להאכיל את הדגים הקרקע פתיתי Tetramin מדי יום עם ההגעה למעבדה.</li>
	<li>רשום את ה- pH ואת הטמפרטורה של כל המיכלים ותעד את מצבם הכללי של הדגים.</li>
</ol>3. העברת דגים
<ol><li>מעבירים דגים בכל קבוצת טיפול ממיכל הדיור למיכל הפתרון המתאים באמצעות רשת דגים סטנדרטית.</li>
	<li>מניחים את המיכל המכיל את הדג בחזרה באמבט המים, להחליף את אבן האוויר ואת מכסה הטנק. טנק זה הוא כיום "מיכל הדיור" והמיכל שהחזיק בעבר את הדגים הוא כיום "מיכל הפתרון".</li>
	<li>השלך את הפתרון הישן ונקה את המיכל, יחד עם מכסי המיכלים, חברות התעופה, אבני האוויר והרשתות כדי למנוע הצטברות של גלוקוז ומניטול. הערה: אין לשטוף פריטים עם סבון. השתמש במים מברשת קרצוף ייעודי / ספוג עבור כל מצב טיפול כדי לנקות כראוי את המיכלים.</li>
	<li>יבש את 'מיכלי הפתרון' החדשים שנוקו במגבת נייר. הכן את הפתרונות ליום המחרת באמצעות טנק זה. ודא שהפריטים האחרים מיובשים ומופרדים על ידי קבוצות טיפול מתאימות. הערה: שמור יומן של הפתרונות שהדגים מועברים מהם ולתוך כל יום, כמו גם את הפתרונות המוכנים ליום המחרת. לדוגמה: דגים מועברים מגלוקוז ל- H2O, פתרון גלוקוז חדש של 1% שהוכן למחר.</li>
</ol>4. הכנת פתרון לאחר ההעברה
<ol><li>הכנת פתרונות סוכר<ol>
<li>מלאו כל מיכל פתרון ב-2 ליטר (או 4 ליטר) של מי מערכת (מי מערכת מוגדרים כמים שטופלו ביחס הנכון לפתרון המלח והם באותה טמפרטורה כמו מיכלי מלאי וטיפול).</li>
		<li>למדוד את הכמות הנכונה של גלוקוז מניטול (ראה שלב 5 להלן) באמצעות סולם טעינה העליון סירות לשקול נפרד עבור כל כימיקל.</li>
		<li>מוסיפים את גלוקוז שקל או aliquot מניטול למיכל פתרון מתאים, ניקה, אשר מכיל רק מים מערכת.</li>
		<li>מערבבים את פתרונות הגלוקוז והמניטול עם מוטות ערבוב זכוכית נפרדים עד שהסוכרים מומסים לחלוטין.</li>
		<li>להחזיר מיכלי פתרון לאמבט המים ולכסות עם העפעפיים המתאימים שלהם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת פתרונות מים<ol>
<li>מלא מיכלי ניסוי (2 L או 4 L) במי מערכת.</li>
		<li>החזירו את 'מיכלי הפתרון' האלה לאמבט המים וכסו במכסים המתאימים להם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. שינוי אחוזים
<ol><li>לשמור על הדג בתמיסה 1% במהלך 2 השבועות הראשונים של הטיפול: 40 גרם של גלוקוז או מניטול במיכל 4 L.</li>
	<li>לשמור על הדג בתמיסה 2% במהלך שבועות 3 ו 4 של טיפול: 80 גרם של גלוקוז או מניטול במיכל 4 L.</li>
	<li>לשמור על הדג בתמיסה 3% עבור 4 השבועות האחרונים של הטיפול: 120 גרם של גלוקוז או מניטול במיכל 4 L.</li>
</ol>6. מדידת רמות הגלוקוז בדם ואיסוף רקמות
<ol><li>יש למרדים דגים 2 בכל פעם בתמיסת 0.02% טריקאין.</li>
	<li>ערפו את ראשם של הדגים ממש מאחורי הזימים בעזרת סכין גילוח.</li>
	<li>למדוד את ערך הסוכר בדם. הערה: אנו משתמשים מד גלוקוז בדם (למשל, פריסטייל לייט) כדי למדוד את רמת הגלוקוז בדם ומניחים את רצועת הבדיקה ישירות על הלב החשוף (דגימת דם לב).</li>
	<li>לנתח את הרקמה המבוקשת מהדגים (מוח, שריר וכו ').</li>
	<li>יש לאחסן רקמות שנאספו על ידי הקפאת בזק על קרח יבש ואחסון במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס, תיקון ב-4% paraformaldehyde, או הצבת פתרון חיץ לשימוש מיידי.</li>
</ol>

<ol><li>Rubinstein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+from+disease+modeling+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: from disease modeling to drug discovery.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).</li>
<li>Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Associative learning in zebrafish (Danio rerio).</a> Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> BioMed Research International. , (2012).</li>
<li>Moss, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+pancreas+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the pancreas in adult zebrafish.</a> Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).</li>
<li>Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+immersion+in+an+external+glucose+solution+differentially+affects+blood+sugar+values+in+older+versus+younger+zebrafish+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults.</a> Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).</li>
<li>Etuk, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studying+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture+and+Biology+Journal+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Animal models for studying diabetes mellitus.</a> Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+immunoreactivity+and+neuronal+cell+changes+in+rats+with+STZ-induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes.</a> Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).</li>
<li>Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+activity+in+retinas+from+non-insulin-dependent+diabetic+Goto-Kakizaki+rats%3A+correlation+with+blood-retinal+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability.</a> Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).</li>
<li>Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrophysiological+study+of+retinal+function+in+the+diabetic+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).</li>
<li>Biessels, G. J., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+diabetes+on+cognition%3A+what+can+be+learned+from+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models.</a> Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).</li>
<li>Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+diabetes+mellitus+and+metabolic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e50232(2013).</li>
<li>Sarras, M. P., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+as+a+disease+model+provides+a+unique+window+for+understanding+the+molecular+basis+of+diabetic+metabolic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+on+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory.</a> Research on Diabetes. , iConcept Press Ltd. Hong Kong. (2013).</li>
<li>Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+hyperglycaemia+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+leads+to+morphological+changes+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetologica%22%5BJournal%5D)">Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina.</a> Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).</li>
<li>Capiotti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+induces+memory+impairment+linked+to+increased+acetylcholinesterase+activity+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio).</a> Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).</li>
<li>Capiotti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+impaired+glucose+metabolism+in+a+zebrafish+hyperglycemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).</li>
<li>Capiotti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+alters+E-NTPDases%2C+ecto-5%27-nucleotidase%2C+and+ectosolic+and+cytosolic+adenosine+deaminase+activities+and+expression+from+encephala+of+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).</li>
<li>Ali, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+Degeneration+Accompanies+Vascular+Changes+in+a+Zebrafish+Model+of+Diabetic+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43(2020).</li>
<li>Wiggenhauser, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Retinal+Angiogenesis+in+Hyperglycemic+pdx1-%2F-+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants.</a> Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).</li>
<li>Chen, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+HMGB1+mediated+signalling+pathway+in+diabetic+retinopathy%3A+evidence+from+type+2+diabetic+rats+and+ARPE-19+cells+under+diabetic+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition.</a> Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).</li>
<li>Costa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+exposure%2C+pH%2C+osmolarity%2C+and+solvent+on+the+retinal+pigment+epithelial+toxicity+of+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes.</a> American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).</li>
<li>Alvarez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+cone+photoreceptor+dysfunction+in+a+hyperglycemic+model+of+non-proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy.</a> Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).</li>
<li>Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+retinal+neurons+and+glia+during+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Optometry%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes.</a> Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).</li>
<li>Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+abnormality+as+predictors+of+progression+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy.</a> Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).</li>
<li>Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+immunoreactivity+and+neuronal+cell+changes+in+rats+with+STZ-+induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes.</a> Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).</li>
<li>Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+retinal+occludin+and+glial+fibrillary+acidic+protein+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).</li>
<li>Lieth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+reactivity+and+impaired+glutamate+metabolism+in+short-term+experimental+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 47, 815-820 (1998).</li>
<li>Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+reactivity%2C+an+early+feature+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).</li>
<li>Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+microglial+response+in+the+retina+of+streptozotocin-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).</li>
<li>Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+changes+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Muller cell changes in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 47, 445-449 (1998).</li>
<li>Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+month+of+hyperglycemia+alters+spectral+responses+of+the+zebrafish+photopic+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram.</a> Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).</li>
<li>Hancock, H. A., Kraft, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+potential+analysis+and+ERGs+of+normal+and+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).</li>
<li>Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+potentials+and+the+b-wave%3A+partial+masking+and+interdependence+in+dark+adaptation+and+diabetes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archives+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat.</a> Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).</li>
<li>Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+damage+in+experimental+diabetes%3A+electroretinographical+and+morphological+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations.</a> Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).</li>
<li>Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+inner+retinal+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).</li>
<li>Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+photoreceptor+dysfunction+in+diabetes%3A+activation%2C+deactivation%2C+and+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

סוכרת היא בעיה כלל ארצית. מחקרים מראים כי עד 2030, כ 400 מיליון אנשים יהיו צורה כלשהי של סוכרת. במודלים מכרסמים, סוג 2 DM נחקר באמצעות מניפולציה גנטית. בחולדות, חולדות שומן סוכרתי צוקר (ZDF), ואת חולדות שומן Otsuka לונג-אוונס Tokushima (OLETF), מספקים מידע נוסף על ההשפעות של סוג 2 DM10. בנוסף, דיאטות עתירות שומן שימשו מכרסמים כדי לגרום היפרגליקמיה. פעולה זו משקפת את ההליך הלא פולשני המוצע במאמר זה. באמצעות הפרוטוקול הלא פולשני שלנו, אנו יכולים לגרום היפרגליקמיה עד 8 שבועות, ולכן מדמה היפרגליקמיה מ...

זברהפיש(דניו rerio)הופכים במהירות מודל בעלי חיים בשימוש נרחב לחקור הן מחלה קוגניציה1. הקלות של מניפולציה גנטית ושקיפות עוברית בשלבים ההתפתחותיים המוקדמים, הופכים אותם למועמדים עיקריים לחקור מחלות אנושיות עם בסיס גנטי ידוע. לדוגמה, דגי זברה שימשו לחקר תסמונת הולט-אורם, קרדיומיופתיות, מחלת כליות גלומרולוציסט, ניוון שרירים וסוכרת (DM) בין מחלות אחרות1. בנוסף, מודל זברה הוא אידיאלי בגלל גודלו הקטן של המין, קלות התחזוקה, פוריות גבוהה2,3.
הלבלב של דג הזברה דומה הן מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית ללבלב היונקים4. לכן, המאפיינים הייחודיים של גודל, פוריות גבוהה, ומבנים אנדוקריניים דומים להפוך זברהפיש מועמד מתאים ללימוד סיבוכים הקשורים DM. ב זברה, ישנן שתי שיטות ניסיוניות המשמשות כדי לגרום היפרגליקמיה ממושכת האופיינית DM: זרם של גלוקוז (דוגמנות סוג 2) והפסקת הפרשת אינסולין (דוגמנות סוג 1)5,6. באופן ניסיוני, כדי לעצור את הפרשת האינסולין, תאי β הלבלב יכולים להיהרס כימית באמצעות זריקות סטרפטוזוטוצין (STZ) או Alloxan. STZ שימש בהצלחה מכרסמים וזברה, וכתוצאה מכך סיבוכים הקשורים רטינופתיה7,8,9, ליקויים קוגניטיביים10, והתחדשות הגפיים11. עם זאת, ב zebrafish, β תאים להתחדש לאחר הטיפול, גרימת "זריקות המאיץ" של STZ להיות נחוץ כדי לשמור על תנאי סוכרת12. לחלופין, ניתן להסיר את הלבלב של דג הזברה6. שניהם הליכים פולשניים מאוד, בשל זריקות מרובות, וזמן התאוששות נרחב.
לעומת זאת, היפרגליקמיה יכולה להיגרם באופן לא פולשני באמצעות חשיפה לגלוקוז אקסוגני. בפרוטוקול זה, דגים שקועים בתמיסת גלוקוז מרוכזת מאוד במשך 24 שעות5,13 או ללא הרף במשך שבועיים14,15,16. גלוקוז אקסוגני נלקח transdermally, על ידי בליעה, ו /או על פני הזימים וכתוצאה מכך רמות סוכר גבוהות בדם. מכיוון שטכניקה לא פולשנית זו אינה מבצעת מניפולציה ישירה ברמות האינסולין, היא אינה יכולה לטעון שהיא מעוררת DM מסוג 2. עם זאת, ניתן להשתמש בו כדי לבחון סיבוכים הנגרמים על ידי היפרגליקמיה, שהוא אחד הסימפטומים העיקריים של סוג 2 DM.
לאחרונה, מוטציית הזברה pdx1-/- פותחה על ידי מניפולציה של גן homeobox הלבלב והתריסריון 1, גן הקשור לגורם הגנטי של סוג 2 DM בבני אדם. באמצעות מוטציה זו, חוקרים הצליחו לשכפל הפרעה להתפתחות הלבלב, רמת סוכר גבוהה בדם, וללמוד רטינופתיה סוכרתית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה17,18.
במאמר זה, אנו מתארים שיטת אינדוקציה היפרגליקמיה לא פולשנית המשתמשת בפרוטוקול טבילה לסירוגין. פרוטוקול זה שומר על תנאים היפרגליקמיים עד 8 שבועות עם סיבוכים הבאים שנצפו. בקצרה, דגי זברה בוגרים ממוקמים בתמיסת סוכר במשך 24 שעות ולאחר מכן פתרון מים במשך 24 שעות. בניגוד לטבילה מתמשכת בפתרונות גלוקוז חיצוניים, ימים מתחלפים בין סוכר למים מחקים את עלייתו ונפילתו של רמת הסוכר בדם בסוכרת. פרוטוקול גלוקוז לסירוגין מאפשר גם היפרגליקמיה להיות המושרה לפרקי זמן ארוכים יותר, כמו זברהפיש אינם מסוגלים לפצות על תנאי גלוקוז חיצוניים גבוהים. כהוכחה לעיקרון, אנו מספקים נתונים המראים כי היפרגליקמיה הנגרמת באמצעות פרוטוקול זה משנה כימיה רשתית ופיזיולוגיה.

<table><tbody><tr><td>צינורות תעופה</td><td>petsmart</td><td>5291863</td><td>זה יכול לשמש במיכל כדי להפיץ אוויר</td></tr><tr><td>משאבת אוויר</td><td>petsmart</td><td>5094984</td><td>זה יכול לשמש במיכל כדי להפיץ אוויר</td></tr><tr><td>Airstones</td><td>petsmart</td><td>5149683</td><td>זה יכול לשמש במיכל כדי להפיץ אוויר</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270-5KG</td><td></td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>אקרוס אורגני</td><td></td><td></td>AC125340050</tr><tr><td>Freestyle Lite Meter</td><td>אמזון</td><td>B01LMOMLTU</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Lite רצועות</td><td>אמזון</td><td>B074ZN3H2Z</td><td></td></tr><tr><td>נטו</td><td>petsmart</td><td>5175115</td><td></td></tr><tr><td>טנקים</td><td>אמזון</td><td>B0002APZO4</td><td></td></tr></tbody></table>

טבילה חלופית בגלוקוז כדי לייצר היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

דגי זברה(דניו ריו)הם מודל מצוין לחקור את ההשפעות של היפרגליקמיה כרונית, סימן ההיכר של סוכרת מסוג II (T2DM). פרוטוקול טבילה חלופי זה הוא שיטה לא פולשנית, צעד חכם של גרימת היפרגליקמיה עד שמונה שבועות. דגי זברה בוגרים חשופים לסירוגין לסוכר (גלוקוז) ומים למשך 24 שעות כל אחד. דג הזברה מתחיל את הטיפול בתמיסת גלוקוז של 1% למשך שבועיים, לאחר מכן פתרון של 2% למשך שבועיים, ולבסוף פתרון של 3% במשך 4 השבועות הנותרים. בהשוואה לבקרות מטופלים במים (מתח) ומניטול (אוסמוטי), לזברה שטופלה בגלוקוז יש רמות סוכר גבוהות משמעותית בדם. הזברה שטופלה בגלוקוז מראה את רמות הסוכר בדם של פי 3 מאלה של פקדים, מה שמרמז כי לאחר ארבעה ושמונה שבועות ניתן להשיג היפרגליקמיה. היפרגליקמיה מתמשכת הייתה קשורה לחלבון חומצי גילאי מוגבר (GFAP) ולהגברת רמות הגורם הגרעיני קאפה B (NF-kB) ברשתית וירידה בתגובות פיזיולוגיות, כמו גם גירעונות קוגניטיביים המצביעים על כך שניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לדגמן סיבוכים במחלות.

באמצעות פרוטוקול זה (איור 1), ערכי הסוכר בדם גבוהים באופן משמעותי לאחר טיפול של 4 שבועות ו-8 שבועות (איור 2A), כאשר היפרגליקמיה מוגדרת כ-3x מהממוצעים בשליטה הן מקבוצות שטופלו במים והן מקבוצות המטופלות במניטול. בקרות המטופלות במים מועברות פנימה והחוצה מהמים מדי יום, ומספקות בקרת לחץ/טיפול. מניטול משמש כשליטה אוסמוטית במחקרי גלוקוז במבחנה19,20, כפי שהוא סוכר 6 פחמן כמו גלוקוז אבל לא נלקח על ידי תאים. כדי ל...

פרוטוקול זה אינו פולשני גורם היפרגליקמיה ב zebrafish עד 8 שבועות. באמצעות פרוטוקול זה, מחקר מעמיק של ההשפעות השליליות של היפרגליקמיה יכול להתבצע.

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

פרוטוקול זה גורם היפרגליקמיה בדגי זברה בדפוס עלייה ונפילה המחקה את היפרגליקמיה הנראית בסוכרת מסוג 2. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא טכניקה פולשנית המאפשרת להבטיח כי היפרגליקמיה היא הגורם לכל שינויים שנצפו דגים היפרגליקמיים. פרוטוקול זה יכול לשמש באופן פוטנציאלי כדי לחקור אפיקים טיפוליים או תרופות כי היעד סיבוכים של היפרגליקמיה.פרוטוקול זה יש הרבה צעדים, אבל כאשר השלבים מתבצעים כראוי ובזהירות, זה צריך להפוך במהירות טבע שני. זכור עם זאת, תמיד להתייחס לבעלי החיים בעדינות ובהומאניות לאורך כל הפרוטוקול. התחל על ידי הקמת שישה טנקים, שניים לכל קבוצת ניסוי.השתמש שני מיכלי ליטר, אם המספר הכולל של דגים הוא פחות מ 20 וארבעה מיכלי ליטר אם המספר הכולל של דגים הוא יותר מ 20. סמן את אחד משני הטנקים, מיכל הדיור ואת מיכל הפתרון השני. שמור את המיכלים באמבט מים ב 28 עד 29 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת המים.ביום הראשון, מניחים את הדגים בפתרונות הטיפול שלהם במשך 24 שעות. ביום השני, מעבירים את הדגים מפתרונות הטיפול שלהם למים למשך 24 שעות. ביום השלישי, להעביר את הדגים ממים לפתרונות טיפול.המשיכו בחשיפה לסירוגין להמשך הניסוי. העברת מים מטופלים דגי בקרה ממים למים מדי יום. ודא שהדגים ניזונים ומועברים באותו חלון של שעתיים בכל יום לאורך כל תקופת הניסוי.מעבירים דגים בכל קבוצת טיפול ממיכל הדיור למיכל הפתרון המתאים באמצעות רשת דגים סטנדרטית. מניחים את המיכל המכיל את הדגים בחזרה באמבט המים ומחליפים את אבן האוויר ואת מכסה המיכל. הטנק הזה הוא עכשיו מיכל הדיור והמיכל שהחזיק בעבר את הדגים הוא עכשיו מיכל הפתרון.השלך את הפתרון הישן ונקה את המיכל יחד עם מכסי המיכל, קווי האוויר, אבני האוויר והרשתות כדי למנוע הצטברות של גלוקוז ומניטול. השתמש במים וספוג ייעודי עבור כל מצב טיפול כדי לנקות כראוי את המיכלים. יבש את מיכלי הפתרון החדשים שנוקו במגבת נייר והכן את הפתרונות ליום המחרת באמצעות מיכל זה.ודא שהפריטים האחרים מיובשים ומופרדים על ידי קבוצות טיפול מתאימות. כדי להכין את פתרונות הסוכר, מלאו כל מיכל פתרון בשניים או ארבעה ליטרים של מי מערכת. למדוד את הכמות הנכונה של גלוקוז ומניטול באמצעות סולם טעינה העליון וסירות שקילה נפרדות עבור כל כימיקל.מוסיפים את גלוקוז שקל או aliquot מניטול למיכל פתרון נקי המתאים. מערבבים את הפתרונות עם מוטות ערבוב זכוכית נפרדים עד שהסוכרים מומסים לחלוטין. ואז להחזיר את מיכלי הפתרון לאמבט המים ולכסות אותם עם העפעפיים המתאימים שלהם.כדי להכין את פתרון המים, מלאו מיכלים ניסיוניים במים מערכתיים החזירו מיכלי פתרונות אלה לאמבט המים וכיסו אותם במכסים המתאימים להם. ערכי הסוכר בדם היו גבוהים באופן משמעותי לאחר טיפולי גלוקוז של ארבעה שבועות ושמונה שבועות. עם היפרגליקמיה מוגדרת פי שלושה מהממוצעים בשליטה הן מקבוצות מטופלות במים והן מקבוצות מאניטול.רקמת רשתית שנאספו לאחר ארבעה שבועות של היפרגליקמיה היה עלייה בחלבון חומצי פרפור גליה או רמות GFAP. ביטוי GFAP נצפתה בתאי גליה מולר ברשתית, אשר משתנים רטינופתיה סוכרתית. עלייה זו GFAP היה קשור לעלייה ברמות קאפה-בי גורם גרעיני.מה שמרמז על כך שההיפרגליקמיה המושרה מעוררת תגובה דלקתית וגליוזיס תגובתי. הקלטות ERG לאחר ארבעה שבועות של טיפול זיהו ירידה בתגובה ברשתית שטופלה בגלוקוז בהשוואה לבקרות מטופלים מניטול. אמפליטודות של רכיבי פוטורצפטור ותאים דו קוטביים ירדו בדגים היפרגליקמיים.הליך זה יכול להיות בתוספת בדיקות אחרות של היפרגליקמיה. לדוגמה, ניתן להשתמש בפקודת זיכרון כדי לבחון ליקויים קוגניטיביים או לתעד תגובות מבוססות ויזואלית כגון התגובה האופטו-מוטורית להערכת סיבוכים מבוססי ראייה. לאחר טכניקה זו הוקמה, המעבדה שלנו היה מסוגל להשתמש בו כדי לחקור סיבוכים הנגרמת היפרגליקמיה במודל דג זברה.ראינו סיבוכים אלה במהירות יחסית, לאחר ארבעה שבועות של טיפול.

alternate-immersion-glucose-to-produce-prolonged-hyperglycemia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

סרטון זה מתאר את הטכניקה של יצירת מודל דג זברה לסוכרת מסוג 1 בעזרת התרופה סטרפטוזוצין, כדי ללמוד את הפתופיזיולוגיה של סיבוכי סוכרת וזיכרון מטבולי.

טיפול בסטרפטוזוצין: מודל דג זברה של סוכרת מסוג 1

זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון...

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הומאוסטזיס אנרגטי.  על ידי שימוש במחוון חמצון חיזור רגיש NADH2, alamar Blue, פיתחנו בדיקה המודדת את קצב חילוף החומרים של זחלי דג הזברה בפורמט צלחת של 96 בארות וניתן ליישם אותה לגילוי תרופות או גנים.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

עבודה זו מתארת ​​שיטות להקמת מודלים של היפרגליקמיה חריפה וכרונית בדג הזברה. המטרה היא לחקור את ההשפעה של היפרגליקמיה על תהליכים פיזיולוגיים, כגון נוירוגנזה מכוננת ופציעה המושרה. העבודה גם מדגיש את השימוש דג הזברה כדי לעקוב אחר מולקולות radiolabeled (כאן, [ 18 F] -FDG) באמצעות PET / CT.

מודלים חריפים כרוניים של היפרגליקמיה דג הזברה: שיטה להעריך את ההשפעה של היפרגליקמיה על נוירוגנזה ועל ביודיסטריבוצי של מולקולות Radiolabeled

כאן, אנו נדון פרוטוקול השיטה אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה neoangiogenesis ושינויים מבניים.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

תאי בטא פונקציונליות חשוב הומאוסטזיס הגלוקוז בדם, אשר מוערך ברזולוציה תא בודד באמצעות כתב גנטית מקודד עבור זרם סידן.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

אנו מציגים תא התנהגותי שנועד להעריך את הביצועים הקוגניטיביים. אנו מספקים נתונים המראים כי לאחר שנרכשו, דגי זברה זוכרים את המשימה 8 שבועות לאחר מכן. אנו גם מראים כי דגי זברה היפרגליקמיים שינו את הביצועים הקוגניטיביים, מה שמצביע על כך שפרדיגמה זו חלה על מחקרים המעריכים קוגניציה וזיכרון.

המשימה ההתנהגותית של בחירה תלת-תאית באמצעות דג זברה כמערכת מודל

הפרדיגמה הקלאסית מיזוג פחד הותאם עבור המשתתפים האדם בסביבה מציאות וירטואלית לחלוטין immersive. באמצעות פרדיגמה אפליה, פחד מותנה, אות וזיכרון שימור הקשר, הכחדה נמדדה עם תגובה מוליכות העור כדי נחשים ועכבישים וירטואלי דינמי (גירויים מותנים) בשני הקשרים שונים וירטואלית.

התניית פחד האדם שנערך מציאות שליטת טבילה 3-Dimensional וירטואלי

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

למדו פרוטוקול לא פולשני ליצירת היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש באמצעות טבילה חלופית בגלוקוז. שיטה זו מאפשרת לחקור את ההשפעות הפיזיולוגיות והרשתיות של סוכרת מסוג שתיים.

טבילה חלופית בגלוקוז כדי לייצר היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש

גלה סרטונים נוספים