Name: שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: למד שיטת תרבית לשמירה על תאי גזע המטופואיטיים אנושיים במצב קוויאסנטי בתנאי מעבדה הדומים לסביבת מח העצם. הפרוטוקול מאפשר בחינת תרכובות המשפיעות על הישרדות והתמיינות התאים ללא שימוש במודלים בעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למ. הרגוצ'י וס. טמקי על התמיכה הטכנית וניהול המעבדות ולק. שירושיטה על הצילומים. HK נתמך בחלקו על ידי מענק KAKENHI מ MEXT / JSPS (מענק מס '19K17847) והמרכז הלאומי לבריאות ורפואה גלובלית. KT נתמך בחלקו על ידי מענקי KAKENHI מ MEXT / JSPS (מענק מס '18H02845 ו 18K19570), המרכז הלאומי לבריאות ורפואה גלובלית (מענק מס '26-001 ו 19A2002), AMED (מענק מס '. JP18ck0106444, JP18ae0201014, ו JP20bm0704042), קרן המחקר הרפואי אונו, קרן המחקר הרפואי Kanzawa, קרן טקדה למדע.

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות המרכז הלאומי לבריאות ורפואה גלובלית. כל ההליכים הניסיוניים המבוצעים בעכברים מאושרים על ידי הוועדה הלאומית לניסויים בבעלי חיים של המרכז הלאומי לבריאות ורפואה. הערה: סקירה כללית של הפרוטוקול מאוירת באיור 1.
1. הכנת שומנים
<ol><li>להמיס את השומנים הבאים מתנול בצינורות זכוכית בריכוזים המצוינים: נתרן פלמיטט, 16 מ"ג / מ"ל; נתרן אולאט, 30 מ"ג/מ"ל; וכולסטרול, 4 מ"ג / מ"ל. יש לאחסן את תמיסת השומנים ב-30°C ולהפשיר את הדגימה לפני השימוש.</li>
	<li>מערבבים את פתרונות השומנים שהוכנו בשלב 1.1 בצינור זכוכית טרי במינונים הדרושים כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל פלמיאט, 100 מיקרוגרם / מ"ל oleate, ו 20 מיקרוגרם / מ"ל כולסטרול. לדוגמה, בעת הכנת 10 מ"ל של מדיה תרבותית, לערבב 62.5 μL של פתרון palmitate, 33 μL של פתרון oleate, ו 50 μL של פתרון כולסטרול בצינור הזכוכית.</li>
	<li>אידו את המתנול על ידי העברת גז חנקן דרך תמיסת השומנים (איור 2A ו-2B). אם גז חנקן אינו זמין, להעביר אוויר דרך הפתרון באמצעות פיפטה סיוע.</li>
	<li>לאדות לחלוטין את המתנול הנותר על ידי חימום צינור הזכוכית באמבט מים ב 37 °C(איור 2C). הערה: השימוש בריכוז גבוה של גז N2 בחלל סגור עלול להזיק. למרות נפח המשמש בפרוטוקול כדי לאדות מתנול מוגבל ולכן נחשב בטוח, אוורור החדר כראוי ותיוג אזורים של ריכוזים גבוהים פוטנציאליים של גז N2 חשוב אם דליפת גז בלתי צפויה להתרחש.</li>
</ol>2. הכנה בינונית
<ol><li>הכינו את מדיום הנשר (DMEM)/F12 הבינוני של Dulbecco (עם HEPES וגלוטמין). מוסיפים פניצילין וסטרפטומיצין גופרתי למדיום לריכוז הסופי של 50 יחידות ו-50 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה. DMEM / F12 בינוני המכיל אנטיביוטיקה ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 חודשים.</li>
	<li>הוסף 4% w/v של אלבומין סרום שור (BSA) למדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/F12 בינוני (עם HEPES וגלוטמין).</li>
	<li>כוונן את רמת ה- pH של המדיום ל- pH 7.4-7.8 באמצעות פתרון NaOH, בדרך כלל ל- pH 7.6.</li>
	<li>מוסיפים את המדיום לצינור הזכוכית שהוכן בשלב 1. כדי להשיג פתרון עם מסיסות מקסימלית, תוספת של 3-15 מ"ל בינוני מומלץ.</li>
	<li>ממיסים לחלוטין את השומנים על ידי sonication (אופטימלי: יותר מ 20 דקות של sonication). לאחר BSA ושומנים מומסים, המדגם צריך להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס ומשמש בתוך 2 חודשים. הפשרה מיד לפני השימוש.</li>
	<li>הוסף 1/1,000 של אינסולין, transferin, נתרן סלניט, ואתנולאמין (ITS-X) תערובת DMEM/F12. סנן את המדיה המעורבת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר (המוגדר כ"מדיית תרבות"). לפני השימוש, להוסיף גורם תא גזע אנושי (SCF) ו תרומבופויאטין אנושי (TPO) למדיה התרבות בריכוז הסופי של 3 ng/mL כל אחד. לאחר הוספת ציטוקינים ו- ITS-X, לא ניתן לאחסן את המדיום.</li>
	<li>מאגר כתמים: הוסף 10% FCS לתמיסת מלח (PBS) נטולת פוספטים ללא Ca ו-Mg. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 שבועות.</li>
	<li>הפשרת מדיה: הוסף 10% FCS ל- DMEM/F12. פתרון זה הוא חד-פעמי.</li>
	<li>פתרון מלאי ציטוקינים: להמיס כל SCF אנושי או TPO אנושי ב PBS (Ca- ו Mg-free) ב 20 מיקרוגרם / מ"ל. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס לפחות שנה אחת ללא אובדן פעילות. לאחר הפשרה, לאחסן את פתרון המלאי ב 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בתוך 1 חודש. הערה: בדוק את המגרש לאחר כל רכישה כדי למנוע שונות במזהמים ב- BSA. תרבות HSCs באותו זמן עם קבוצות שונות של BSA ולבחון את מספר HSC פנוטיפי ביום 7 כמתואר להלן. אם אצוות BSA מציגה מספר נמוך או תדירות נמוכה של תאי CD34+ (למשל פחות ממחצית ממספר תאי הקלט), הימנע משימוש באצווה זו.</li>
</ol>3. הכנת מח עצם אנושי CD34+ תאים
<ol><li>לרכוש CD34 אנושי+ תאי מח עצם ולאחסן את התאים חנקן נוזלי עד השימוש. לחלופין, ניתן להשתמש בתאי מח עצם ממתנדב בריא או מתאי דם טריים לאחר אישור ועדת האתיקה של המכון והסכמת התורם.</li>
	<li>חם 10 מ"ל של מדיה הפשרה בצינור חרוט 15 מ"ל באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להפשיר את התאים הקפואים בבקבוקונים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בתוך 2 דקות. לאחר ניגוב הבקבוקון עם 70% אתנול להסרת מזהמים, להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל את המדיום שחומם מראש משלב 3.2.</li>
	<li>צנטריפוגה צינור 15 מ"ל ב 200 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant בזהירות כדי לשמור על גלולה שלם (משאיר < 50 μL של בינוני). לשים מחדש את התאים עם המדיום הנותר ולהעביר אותם צינור 1.5 מ"ל על הקרח. הערה: חשיפה לדגימות שמקורן בבני אדם ישירות ברירית כולל העין או הרקמה הפצועה עלולה לגרום לזיהום על ידי פתוגנים ידועים או לא ידועים; לכן, כפפות ומשקפיים מומלץ בעת טיפול בתאים אנושיים. גם אם CD34שנרכש + תאים לבדוק שלילי עבור וירוס הפטיטיס B (HBV), וירוס הפטיטיס C (HCV), וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV1), ניטור זהיר צריך להתבצע על פי הנחיות מוסדיות אם מתרחשת שכיחות חשיפה. פעל בהתאם להנחיות המוסדיות בעת סילוק חומרים החשופים לתאים אנושיים.</li>
</ol>4. מיון HSCs
<ol><li>סמן את התאים בנוגדנים מצומדים בפלואורוכרום. יש לערבב 50 μL של מאגר כתמים בתוספת 10 μL של אנטי CD34-FITC, 2 מיקרו-ל של אנטי-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 מיקרו-ל של אנטי-CD90-PE-Cy7 ו-10 מיקרו-ל של אנטי-CD45RA-PE. להחזיר את גלולת התא בתערובת הנוגדנים. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חיץ כתמים לשטוף את הנוגדנים. צנטריפוגה הצינורות ב 340 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את הסופרנט.</li>
	<li>Resuspend גלולת התא ב 0.5 מ"ל של חיץ כתמים + 0.1% פרופידיום יודיד. להעביר את ההשעיה לתוך צינור 5 מ"ל באמצעות מסנן 40 מיקרומטר.</li>
	<li>שער HSCs פנוטיפי בתוך PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- שבר באמצעות FACS אריה-IIIu ולמיין את התאים לתוך צינור 1.5 מ"ל מלא 500 μL של מדיה תרבותית (איור 3). באמצעות אסטרטגיית הגטינג המוצגת באיור 3, ~ 10% מהתאים CD34+ צפויים להיות HSCs פנוטיפיים. הערה: אסטרטגיית gating מבוצעת כמתואר קודםלכן 16 תוך השמטת מכתים סמן שושלת בהתחשב בביטוי הנמוך של סמני שושלת ב CD34 + CD38- שבר מאנשים בריאים17 .</li>
	<li>צנטריפוגה התאים ממוינים ב 340 × g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. בזהירות לשאוף את supernatant כדי להבטיח כי גלולה נשאר שלם.</li>
	<li>אחסן את התאים הממוינים בקרח עד לתרבות. הערה: פיצוי פלואורסצנטי של חפיפה ספקטרלית צריך להתבצע במהלך הניסוי הראשון.</li>
</ol>5. תרבות התאים
<ol><li>העבר 200 μL של מדיה תרבות המכיל ציטוקינים מוכנים בשלב 2 לתוך שטוח למטה 96-באר צלחות.</li>
	<li>כדי למנוע אידוי של המדיום, למלא את כל בארות שאינם בשימוש עם 100-200 μL של PBS.</li>
	<li>התחדשו ב- HSCs הממוינים במדיית תרבות ללא ציטוקינים ב- 60 תאים/μL.</li>
	<li>Aliquot 600 HSCs / באר (10 μL של השעיית תא) לתוך כל באר. ניתן לשנות את מספר התא. פחות מ-300 תאים יובילו לשינוי טכני גדול יותר, ולכן יש צורך ביותר בארות לכל תנאי כדי לזהות הבדלים ביולוגיים. Culturing יותר מ 1000 תאים בבאר אחת יש להימנע בגלל ציטוקינים / מחסור בחומרים מזינים או הצטברות של ציטוקינים שליליים / כימוקינים.</li>
	<li>תרבית את התאים באינקובטור מרובה גזים לח ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 ו 1% O2 אטמוספרה.</li>
	<li>עבור תרבויות מעל 7 ימים, מומלץ להחליף מחצית מנפח המדיה כל 3-4 ימים. בזהירות לשאוף 100 μL של מדיה על ידי pipetting ולהוסיף 100 μL של מדיה תרבות שהוכן לאחרונה המכיל ציטוקינים לכל באר. יש לחמם מראש את המדיה התרבותית ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>6. ניתוח של פנוטיפים סמן באמצעות ציטומטריית זרימה
הערה: למרות שהתאים צריכים להיות מנותחים לאחר 7 ימים של תרבות, משך התרבות ניתן לשנות.
<ol><li>השלך 170 μL של המדיום באמצעות פיפטה 8 ערוצים.</li>
	<li>תווית התאים עם תערובת הנוגדנים. יש לערבב 0.5 μL של אנטי-CD34-FITC, 0.1 מיקרו-ל' של אנטי-CD38-PerCP-Cy5.5, 0.25 מיקרו-ל' של אנטי-CD90-PE-Cy7, 0.5 מיקרו-ל' של אנטי-CD45RA-PE ו-9 מיקרו-μL של מאגר כתמים לבאר. מוסיפים 10 μL של התערובת לצלחת 96-באר להדגיר את התאים במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
	<li>כדי לשטוף את הנוגדנים, להוסיף 100 μL של חיץ כתמים לבארות צנטריפוגה הצלחות ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס באמצעות תאוצה נמוכה והאטה בינונית.</li>
	<li>בזהירות לשאוף 100 μL של supernatant כדי לשמור על התאים בתחתית בארות, ולאחר מכן resuspend התאים ב 200 μL של חיץ כתמים + 0.1% v / v של PI + 1% v / v של מיקרוספרות פלואורסצנטיות (למשל, פלואורוספירות Flow-Check).</li>
	<li>הגדר את מכשיר ציטומטריית הזרימה. להשיג נתונים עבור הדגימות במצב מהיר עם מצב מדגם מעורב על נפחי ספיגה של 100 μL.</li>
	<li>יצא את הנתונים בתבנית FCS ונתח אותם באמצעות תוכנה כגון FlowJo. ניתן לקבוע מספרי תאים באמצעות ספירת החרוזים הפלואורסצנטית. לדוגמה, אם החוקר מוסיף 2000 חרוזים לבאר וספירת החרוזים היא 700, הכפל את מספר התא של כל שבר ב- 2000/700 כדי להעריך את מספר התא הכולל של השבר בבאר. הערה: מיקרוספרות פלואורסצנטיות רעילות לתאים בתרבית בגלל נוכחות של פורמלדהיד. זה עלול לגרום למוות תאי במהלך הניתוח. צמצם את מספר הבארות (<50 בארות) שנותחו ברציפות כדי למנוע הטיה.</li>
</ol>7. השתלת HSCs אנושיים
הערה: פעילות אכלוס מחדש של תאים תרבותיים מאומתת על ידי השתלה לעכברים immunodeficient. כל ההליכים חייבים להיות מאושרים על ידי ועדות ניסוי בעלי חיים או המקבילים שלהם.
<ol><li>כתורמים, הכינו מספר מספיק של עכברי NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) של 8-12 שבועות. כמו עכברי NOG רגישים מאוד לזיהום, לשמור על כלובי הרבייה נקי ככל האפשר להאכיל את העכברים עם דיאטה מעוקרת ומים.</li>
	<li>תרבות מספר הולם של HSCs להשתלה כמתואר בשלב 5. לדוגמה, כאשר 5000 HSCs (יום 0 שווה ערך) מושתלים ל 6 עכברים נמען, תרבות 35,000-40,000 HSCs ב 40 בארות של צלחת 96-באר (200 μL של מדיה תרבותית לבאר) או ב 8 בארות של צלחת 24-באר (1 מ"ל של מדיה תרבות לבאר). תרבות התאים במשך 2 שבועות עם חצי מדיה משתנה כל 3-4 ימים באינקובטור מרובה גז לח ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2 ו 1% O2. ניתן לשנות את משך התרבות.</li>
	<li>הקרנת עכברי NOG ב 2.5 Gy ב 6-24 שעות לפני ההשתלה.</li>
	<li>לאסוף את HSCs תרבית בצינורות 1.5 מ"ל. צנטריפוגה הצינורות ב 340 ×גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בזהירות לשאוף את supernatants ו resuspend התאים במאגר כתמים קרח קר סטרילי בצפיפות תאים של 5000 HSCs (יום 0 שווה ערך) לכל 200 μL. להעביר את ההשעיה ל 3 צינורות פוליפרופילן מ"ל. כדי לעקר את מאגר הכתמים, סנן אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>לפני ההשתלה, הרדמה את העכברים על ידי sevoflurane או שאיפת isoflurane.</li>
	<li>כדי להשתיל 5000 של HSCs תרבותי (יום 0 שווה ערך), להזריק 200 μL של השעיית התא לתוך וריד הזנב או סינוס מסלולית רטרו של עכברי NOG מוקרן בשלב 7.1 באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 27-מד. HSCs מח עצם מבודד טרי או מופשר ניתן להשתיל כפקד. כפפות צריך להיות מעוקר עם 70% v / v אתנול בין כל הליך.</li>
</ol>8. ניתוח התדירות של תאים שמקורם בבני אדם בדם ההיקפי
<ol><li>כדי לבחון אכלוס מחדש של תאים אנושיים, לאסוף את הדם ההיקפי ב 1, 2, ו 3 חודשים לאחר ההשתלה.</li>
	<li>לפני איסוף הדם ההיקפי, הרדמה את העכברים על ידי שאיפת sevoflurane.</li>
	<li>לאסוף 40-80 μL של דם היקפי מן הסינוס רטרו מסלולית באמצעות צינורות נימי זכוכית heparinized ולהשעות מדגם זה ב 1 מ"ל של PBS + הפרין (1 U / mL) ב 1.5 צינורות מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה השעיית הדם ב 340 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS + 1.2% w / v dextran (200 kDa) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את supernatant לצינור אחר 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 340 × גרם במשך 3 דקות.</li>
	<li>עבור תמוגה של תאי דם אדומים, resuspend התאים ב 0.17 M NH4Cl במשך 5 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה התא השעיה 340 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend התאים ב 50 μL של חיץ מכתים המכיל 0.3 μL של נגד עכבר Fc-block. דגירה מדגם זה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסף את הנוגדנים הבאים עבור כתמי סמן פני השטח: 0.3 μL של העכבר CD45-PE-Cy7, 0.3 μL עכבר Ter-119-PE-Cy7, 0.3 μL של CD45-BV421 אנושי, 0.3 μL של CD13-PE אנושי, 1.2 μL של CD33-PE אנושי, 0.3 μL של CD19-APC אנושי, 0.3 μL של CD3-APC-Cy7 אנושי. דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.</li>
	<li>לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של חיץ כתמים צנטריפוגה ב 340 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 200 μL של מאגר כתמים + 0.1% v / v של PI.</li>
	<li>להעביר את המתלה התא לצלחת שטוחה שטוחה 96-טוב ולרכוש נתונים באמצעות cytometer זרימה במצב מהיר עם מצב מדגם לערבב על נפח ספיגה של 100 μL.</li>
	<li>יצא את הנתונים בתבנית FCS לניתוח באמצעות תוכנה כגון FlowJo.</li>
	<li>תארגן את ציטומטר הזרימה. לרכוש נתונים עבור הדגימות במצב מהיר עם מצב מדגם לערבב על נפח ספיגה של 100 μL.</li>
	<li>יצא את הנתונים בתבנית FCS לניתוח באמצעות תוכנה כגון FlowJo.</li>
</ol>

<ol><li>Scala, S., Aiuti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+human+hematopoietic+stem+cells%3A+novel+concepts+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions.</a> Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).</li>
<li>Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awakening+dormant+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Awakening dormant haematopoietic stem cells.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).</li>
<li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).</li>
<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
<li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).</li>
<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).</li>
<li>Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+lineage+fate+in+native+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis.</a> Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).</li>
<li>Pineault, N., Abu-Khader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+umbilical+cord+blood+stem+cell+expansion+and+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li>
<li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li>
<li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+using+single+UM171-expanded+cord+blood%3A+a+single-arm%2C+phase+1-2+safety+and+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Haematology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study.</a> Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).</li>
<li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
<li>Mendelson, A., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+niche+maintenance+during+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration.</a> Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+targets+on+the+surface+of+CD34%2BCD38-+bone+marrow+cells+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes.</a> Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li>
<li>Bai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+primitive+human+hematopoietic+stem+cells+by+culture+in+a+zwitterionic+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel.</a> Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Optimization+Enables+Maintenance+of+Quiescent+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li>
<li>Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+SCID-repopulating+cells+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).</li>
<li>Kikushige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Flt3+is+expressed+at+the+hematopoietic+stem+cell+and+the+granulocyte%2Fmacrophage+progenitor+stages+to+maintain+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+All-Recombinant+Protein-Based+Culture+System+Specifically+Identifies+Hematopoietic+Stem+Cell+Maintenance+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים הקשור למחקר זה.

לאחרונה, מספר שיטות להרחבת HSCs עם בידול מינימלי דווחו18,19,20,21. למרות שיטות אלה מצוינים, HSCs נאלצים להפעיל את מחזורי התא שלהם בנוכחות רמות גבוהות של ציטוקינים, אשר שונה ממצב in vivo שבו HSCs להראות רכיבה מינימלית. פרוטוקול זה שימושי לשמירה על HSCs כמו רגיעה, כפי שנצפה vivo, על ידי recapitulating microenvironment מח העצם.
על ידי culturing HSCs אנושי תחת ציטוקינים נמוכים, שומנים עשירים, תנאים היפוקסיים, HSCs הראו רכיבה מינימלית תוך שמירה על פנוטיפים סמן שלהם. השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא הכנת מדיום המכיל ריכוז גבוה של חומצות שומן וכולסטרול וריכוזי ציטוקינים נמוכים ותרבות תחת היפוקסיה (שלב 1, שלב 2 ושלב 4). ללא כולסטרול ו/או חומצות שומן, שיעור התחזוקה של HSCs תחת ריכוזי ציטוקינים נמוכים מקטין22. Culturing של תאים בתנאים היפוקסיים חשוב גם, כפי שדווח בעבר23.
תנאי התרבות היו דומים לאלה המשמשים HSCs מורין, למעט ריכוזי ציטוקינים. HSCs מורין לשרוד ללא TPO, ואילו HSCs אנושי דורשים לפחות 2 ng/mL של TPO עם 3 ng/mL של SCF22. כמו ריכוז של TPO הוא הרבה יותר גבוה מזה בסרום אנושי (~ 100 pg/mL), התנאים המשמשים בפרוטוקול זה עשוי להיות חסר גורמים ספציפיים כדי לתמוך בהישרדות של HSCs אנושי. FLT3 מתבטא HSCs אנושי24. תוספת של FLT3LG ligand שלה מקטין מעט את הדרישה עבור TPO כדי לשמור על HSCs22.
HSCs אנושי דורש ריכוז גבוה יותר של כולסטרול לעומת HSCs מורין, ככל הנראה בגלל חוסר היכולת לגרום לביטוי של אנזימים סינתזה כולסטרול רגישות lipotoxicity תחת ריכוזים גבוהים (>400 מיקרוגרם / מ"ל) של חומצות שומן22. למרות שרק השילוב של חומצות פלמיטיות, אולאיות, לינולאיות וסטאריות נבדק, אשר נמצאות בשפע בסרום האנושי, יש להעריך שילובים אחרים של שומנים כדי להפחית ליפוטוקסיות ולשפר את קצב השמירה על HSCs תפקודיים.
למרות שפעילות אכלוס מחדש של HSCs אנושיים תרבותיים בעכברים immunodeficient לאחר שבועיים של תרבות אושרה22, מערכת תרבות זו אינה מסכמת באופן מלא את פונקציות הנישה של HSCs ב vivo. הביטוי של CD45RA דווח להגדיל את קיבולת אכלוס מחדש הוא נחות מזה של HSCs22מיון טרי . עם זאת, ניתן לייעל את ריכוזי החומרים המזינים, כגון גלוקוז, חומצת אמינו, פירובט ואינסולין, המתווסף למדיום ברמות סופראפיזיולוגיות. מזהמים ב- BSA עלולים גם לסכן את התחזוקה של HSCs18,25. בנוסף, חלק מהתאים המתורבתים עוברים מוות תאי, בעוד שאחרים עוברים חלוקת תאים; לפיכך, ייתכן שהתחזוקה של מספר התא הכולל לא תציין את המצב המרגיע של כל תא.
למרות מגבלות אלה, תנאי התרבות המתוארים בפרוטוקול שפותח במחקר זה יסייעו לקדם את המחקר וההנדסה של HSCs, במיוחד בתנאים כמעט פיזיולוגיים. תנאי תרבות השומרים על HSCs עם בידול מינימלי ופעילות רכיבה על אופניים יתאימו לבדיקת תרכובות ביולוגיות וכימיות הפועלות במיוחד על HSCs, מניפולציה HSCs באמצעות התמרת lentivirus או עריכת גנום ללא אובדן גזע, ומבהיר את הצעד הראשוני של טרנספורמציה הנגרמת על ידי גנים הקשורים לוקמיה.

תאי גזע hematopoietic (HSCs) ותאי אב רב-פוטנטיים (MPPs) יוצרים באופן מתואם מאגר לחידוש מתמשך של תאים מובחנים כדי לשמור על hematopoiesis לאורך כל החיים בבני אדם1. השבתה במחזור התא היא תכונה בולטת של HSCs, המבדילה אותם מ- MPPs2. באופן קונבנציונלי, HSCs נחשבים להתגורר בשיא ההיררכיה של מערכת hematopoietic, לייצר את כל תאי הדם מובחנים. מודל היררכי זה הסיק בעיקר מניסויי השתלה3. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו על כך שהדינמיקה של HSCs שונה ב- vivo בהשוואה לאלה בניסויי השתלה4,5,6,7. ניסויי מעקב שושלת באמצעות מספר מערכות barcoding גילה כי HSCs מורין phenotypic אינם סוג תא ייחודי התורם hematopoiesis מצב יציב, ו MPPs, אשר מציגים פעילות התחדשות עצמית מוגבלת על הגדרות ההשתלה, ברציפות לספק תאידםבוגרים 4,5,8. לעומת זאת, התרומה של HSCs לתאים בוגרים משופרת לאחר פגיעה במחהעצם 4. ניתן לייחס זאת לשינויים דרסטיים במיקרו-ווירונימנט בעקבות אבלציה של מח העצם, כולל השתלת מח עצם. למרות החלת מעקב שושלת של תאי מורין על תאים אנושיים קשה, ניתוח פילוגנטי המשלב בידוד מושבה חד-תאית ריצוף הגנום כולו גילה תכונה דומה של מערכת hematopoietic, שבו הן HSCs ו MPPs אחראים לייצור היומי של תאים בוגרים7. לכן, למרות השתלה חיונית לבדיקת פעילות מורין או אדם HSC, מודלים ניסיוניים אחרים נדרשים כדי להבין את ההתנהגויות של HSCs בתנאים פיזיולוגיים.
שיטות Culturing עבור HSCs נחקרו בפירוט כדי להבין את היישומים הקליניים שלהם ואת המאפיינים. HSCs אנושי ניתן להרחיב במבחנה באמצעות שילוב של ציטוקינים, שחזור של מטריצות חוץ תאיות, הסרת יריבים להתחדשות עצמית, תרבות משותפת עם תאים mesenchymal או אנדותל, תוספת של אלבומין או החלפתו, התמרה של גורמי שעתוק עצמית, ותוספת של תרכובות מולקולה קטנה9,10. חלק משיטות אלה, כולל תוספת של תרכובות קטנות SR111 ו UM17112, נבדקו בניסויים קליניים עם תוצאות מבטיחות9. בהתחשב באופי רגיעה של HSCs ב vivo, שמירה על HSCs עם רכיבה על אופניים תא מינימלי הוא קריטי עבור recapitulating התנהגות HSC במבחנה. HSCs רגיעה ושגשוג להפגין ערך מחזור תאים דיפרנציאלי13, מצב מטבולי14, וסובלנות נגד לחצים מרובים15 . השיטות המשמשות לשמירה על רגיעה של HSCs אנושי במבחנה מוגבלות.
על ידי חיקוי microenvironment של מח העצם (היפוקסי ועשיר שומנים) ואופטימיזציה של ריכוז ציטוקינים, HSCs אנושי יכול להישמר מובחן ורגיעה תחת התרבות. סיכום מחדש של האופי המרגיע של HSCs במבחנה ישפר את ההבנה של תכונות המצב היציב של HSCs ויאפשר מניפולציה ניסיונית של HSCs.

<table><tbody><tr><td>מח עצם אנושי CD34+ תאי אב</td><td>Lonza</td><td>2M-101C</td><td></td></tr><tr><td>NOD / Shi-scid, IL-2R&gamma;KO Jic</td><td>In-Vivo Science Inc.</td><td></td><td></td>https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html</tr><tr><td>אנטי אנושי CD34-FITC (שיבוט: 581)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 560942; RRID: AB_10562559</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD38-PerCP-Cy5.5&nbsp;</td><td>BD מדעי הביולוגיה</td><td>Cat# 551400; RRID: AB_394184</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD45RA-PE</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 555489; RRID: AB_395880</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD90-PE-Cy7 (שיבוט: 5E10)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561558; RRID: AB_10714644</td><td></td></tr><tr><td>CD13-PE אנטי אנושי (שיבוט: WM15)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 301703; RRID: AB_314179</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD33-PE (שיבוט: WM53)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561816; RRID: AB_10896480</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD19-APC (שיבוט: SJ259)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 363005; RRID: AB_2564127</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD3-APC-Cy7 (שיבוט: SK7)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561800; RRID: AB_10895381</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD45-BV421 (שיבוט: HI30)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 563880; RRID:AB_2744402</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45-PE-Cy7 (שיבוט: 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 103114; RRID: AB_312979</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Ter-119-PE-Cy7 (שיבוט: TER-119)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 557853; RRID: AB_396898</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (נגד עכבר CD16/32) (שיבוט: 2.4-G2)</td> <td>BD Biosciences</td><td>Cat# 553142; RRID: AB_394657</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Nacalai Tesque</td><td>Cat# 14249-24</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 בינוני</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11320-033</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 51500056</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>מייג'י סייקה</td><td></td><td></td>PGLD755</tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Meiji Seika</td><td>SSDN1013</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>חתול # A4503</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלמיטט</td><td>טוקיו תעשייה כימית ושות', בע"מ</td><td>Cat# P0007</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אולאט</td><td>טוקיו תעשייה כימית ושות', בע"מ</td><td>Cat# O0057</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>טוקיו תעשייה כימית ושות', בע"מ</td><td>Cat# C0318</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 017-2995</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן פחמתי</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 191-01305</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2Na</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Heparine Na</td><td>MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., &nbsp;LTD.</td><td>Cat# 224122557</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 193-17791</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Nacalai Tesque</td><td>Cat#&nbsp; 10927-54</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי</td><td>SCF PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי TPO</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-18</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי Flt3 ligand</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Life Technologies</td><td>Cat# P3566</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check Fluorospheres</td><td>בקמן קולטר</td><td>Cat# 7547053</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo גרסה 10</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria3u</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VELVO-CLEAR VS-25 (סוניקטור)</td><td>VELVO-CLEAR</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר גז חנקן</td><td>KOIKE SANSHO CO., LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ווסת גז</td><td>Astec</td><td>Cat# IM-055</td><td></td></tr><tr><td>חממת מולטיגז</td><td>Astec</td><td>Cat# SMA-30DR</td><td></td></tr><tr><td>צינור זכוכית, 16 מ"ל</td><td>תאגיד Maruemu</td><td>N-16</td><td></td></tr><tr><td>צינור זכוכית, 50 מ"ל</td><td>תאגיד Maruemu</td> יחידת מסנן מזרק <td>NX-50</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP, 0.22&nbsp; ומיקרו; M, פוליאתרסולפון, 33&nbsp; מ"מ, גמא מעוקר</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

תאי גזע hematopoietic אנושי (HSCs), כמו HSCs יונקים אחרים, לשמור על hematopoiesis לכל החיים במח העצם. HSCs נשארים רגיעה vivo, בניגוד אבות מובחנים יותר, ולהיכנס למחזור התא במהירות לאחר כימותרפיה או הקרנה לטיפול פגיעה במח העצם או בתרבות במבחנה. על ידי חיקוי microenvironment מח העצם בנוכחות חומצות שומן בשפע, כולסטרול, ריכוז נמוך של ציטוקינים, היפוקסיה, HSCs אנושי לשמור על שביעות שפל במבחנה. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לשמירה על HSCs פונקציונליים במצב השבתה במבחנה. שיטה זו תאפשר מחקרים על התנהגותם של HSCs אנושיים בתנאים פיזיולוגיים.

לאחר 7 ימים של culturing HSCs מטוהרים, עד 80% מהתאים הציגו פנוטיפים סמן של CD34+CD38- (איור 4A). מספר התאים הכולל היה תלוי בריכוז הציטוקינים (איור 4B). ריכוזים גבוהים יותר של SCF ו- TPO גרמו לכניסה למחזור התא, התפשטות ובידול (איור 4B). מספר HSCs פנוטיפיים המאופיינים בפנוטיפי סמן של CD34+CD38-CD90+CD45RA- גדל ביחס לריכוזי SCF או TPO (איור 4B), בעוד התדירות בקרב כלל התאים ירדה (איור 4C). המספרים הכוללים של התאים היו שווים ב- SCF של 1.5 ng/mL וב- 4 ng/mL TPO ובשילובי 3 ng/mL SCF 3 ו- 2 ng/mL TPO, דבר המצביע על כך ש- HSCs הם רגיעה במהלך הפעלת מחזור תאים מינימלית. בהתחשב בהבדלים האינדיבידואליים, ציטוקינים מומלץ עבור כל תורם מח עצם.
לאחר 3 חודשים של השתלת HSCs מח עצם למבוגרים מתורבתים, ניתן להעריך את התדירות שלהם בדם ההיקפי של תאי CD45+ murine CD45- Ter119 אנושיים. שלושה שושלת, כולל תאי CD19+ B, תאים מיאלואידיים CD13/CD33+ ותאי CD3+ T, שוחזרו בעכברי NOG שהושתלו ב- HSCs שהופשרו זה עתה או ב- HSCs מתורבתים (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig01.jpg"> איור 1. מבט כולל על ההליך. סיכום גרפי של ההליך כלל מיון, culturing, וניתוח תאי גזע hematopoietic אנושי (HSCs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig02.jpg"> איור 2. הליך לאידוי מתנול מתמיסת השומנים. A) גליל גז חנקן עם ווסת גז. ב) נוהל להעברת גז חנקן דרך תמיסת השומנים המומסת במתנול. ג) שומנים הדבקים בתחתית צינור הזכוכית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig03.jpg"> איור 3. אסטרטגיית גטינג למיון HSCs. העלילות מציגות CD34מגודר +CD38-CD90+CD45RA- תאים. כ-10% מהתאים CD34+ היו HSCs פנוטיפיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig03large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig04.jpg"> איור 4. מספרי תאים מייצגים לאחר 7 ימים של פולחן. א) נציג פלואורסצנטיות מופעל תא מיון העלילה לאחר culturing HSCs ב SCF (3 ng/mL) ו TPO (2 ng/mL). שבר 1 הועשר עבור תאים חיים, שבר 2 הועשר לתאים מתים, וחלק 3 הועשר לפסולת. מספרים הצבועים בוורוד מציינים את התדירות (%) של השבר המגודר. ב) מספר כל HSCs, CD34+CD38- תאים, ו CD34+CD38-CD90+CD45RA- תאים לאחר culturing 600 HSCs בתנאי ציטוקינים המצוין. קווים מקווקווים אדומים מציינים את המספר ההתחלתי של תאי קלט. S: SCF, T: TPO. ממוצע ± סטיית תקן, n = 4. המספרים הבאים S ו- T מציינים את הריכוז (ng/mL) של כל ציטוקינים. ג) תדירות של CD34+CD38- ו- CD34+CD38-CD90+CD45RA- תאים בתנאי ציטוקינים שצוינו. S: SCF, T: TPO. ממוצע ± סטיית תקן, n = 4. קווי השגיאה עבור תאים המחורבתים ב- SCF (1 ng/mL) וב- TPO (0 ng/mL) הושמטו עקב הערכים הגבוהים שלהם (37.7 ו- 47.9, בהתאמה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig05.jpg"> איור 5. נציג FACS חלקות של עכברים תורמים לאחר 3 חודשים של השתלה. בסך הכל 5000 מופשר טרי (לוחות עליונים) ו 2 שבועות מתורבת HSCs (3 ng/mL SCF ו 3 ng/mL TPO; לוחות תחתונים) הושתלו לתוך עכברי NOG. hCD19 מסמן תאי B אנושיים, hCD13 ו hCD33 מסמנים תאים מיאלואידיים אנושיים, ו- hCD3 מסמן תאי T אנושיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig05large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מאפשר שמירה על תאי גזע המטטופיאטיים אנושיים רגיעה במבחנה על ידי חיקוי microenvironment מח העצם באמצעות חומצות שומן בשפע, כולסטרול, ריכוזים נמוכים יותר של ציטוקינים, והיפוקסיה.

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

השבתה במחזור התא היא תכונה מרכזית של תאי גזע hematopoietic. פרוטוקול זה מסייע להבין את ההתנהגות של HSCs אנושיים רגיעה במבחנה בתנאים פיזיולוגיים קרובים. באמצעות פרוטוקול זה, החוקרים יכולים לבדוק את ההשפעה של תרכובות שונות, חומרים מזינים, או חלבונים המסדירים את מצב מחזור התא, כמו גם בידול של HSCs באופן מדרגי ללא שימוש במודלים של בעלי חיים.תרופות נגד סרטן יש השפעות משתנות על ההישרדות של HSCs השבתה ורוכבי אופניים אבות. פרוטוקול זה מאפשר למצוא סוכנים שחוסכים HSCs רגיעה או סוכנים שפוגעים באופן סלקטיבי בתאי גזע לויקמיים רגיעה. מי שידגים את ההליך יהיה הירושי קוביאשי, עמית מחקר בכיר ממעבדת טאקובו.כדי להתחיל, להמיס 16 מיליגרם לכל מיליליטר נתרן פלמיטט, 30 מיליגרם למיליליטר נתרן oleate, וארבעה מיליגרם לכולסטרול מיליליטר במתנול בצינורות זכוכית. אחסן את פתרונות השומנים ב 30 מעלות צלזיוס שלילי להפשיר אותם לפני השימוש. בצינור זכוכית טרי, מערבבים את פתרונות השומנים כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר פלמיאט, 100 מיקרוגרם למיליליטר אולאט, ו -20 מיקרוגרם לכולסטרול מיליליטר.לאדות את מתנול על ידי העברת גז חנקן דרך תמיסת השומנים. לחלוטין לאדות את המתנול הנותר על ידי חימום צינור הזכוכית באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. הכינו את מדיום DMEM/F-12 עם HEPES וגלוטמין.מוסיפים פניצילין וסטרפטומיצין גופרתי לריכוז סופי של 50 יחידות ו-50 מיקרוגרם למיליליטר בהתאמה. ניתן לאחסן את המדיום בארבע מעלות צלזיוס למשך חודשיים לפחות. הוסיפו 4% מ-BSA למדיום DMEM/F-12 עם HEPES וגלוטמין, ולאחר מכן התאימו את רמת ה-pH של המדיום ל-7.6 באמצעות פתרון נתרן הידרוקסידי.מוסיפים את המדיום לצינור הזכוכית עם השומנים. ממיסים לחלוטין את השומנים על ידי sonication. אם המדיום אטום לאחר sonication, להאריך את זמן sonication.כאשר BSA ושומנים מומסים, הדגימות צריך להיות מאוחסן שלילי 80 מעלות צלזיוס ומשמש בתוך חודשיים. הוסף 0.001X של אינסולין, transferin, נתרן סלניט, ואתנולאמין תערובת DMEM / F-12 ולאחר מכן לסנן את המדיום המעורב באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני השימוש, להוסיף גורם תא גזע אנושי או SCF וטרומבופויאטין אנושי או TPO למדיה התרבות בריכוז הסופי של שלושה ננוגרם למיליליטר כל אחד.העבר 200 מיקרוליטרים של מדיית התרבות שהוכנה בעבר עם ציטוקינים לצלחות שטוחות תחתונות של 96 באר. כדי למנוע אידוי של המדיום, למלא את כל בארות שאינם בשימוש עם 100 כדי 200 microliters של PBS. התחדשו בתאי הגזע ההמטוטופיאטיים הממוינים או ב-HSCs במדיית תרבות ללא ציטוקינים ב-60 תאים למיקרוליטר.Aliquot 600 תאים לתוך כל באר. פחות מ 300 תאים יוביל וריאציה טכנית גדולה יותר culturing יותר מ 1, 000 תאים בבאר אחת יש להימנע בגלל מחסור בחומרים מזינים או הצטברות של ציטוקינים שליליים או כימוקינים. תרבית את התאים באינקובטור מרובה גזים לח ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני ו-1% חמצן.לאחר שבעה ימים של culturing HSCs מטוהרים, עד 80% מהתאים הציגו סמן CD34 חיובי CD38 פנוטיפים שליליים. מספר התא הכולל היה תלוי בריכוז הציטוקינים. ריכוזים גבוהים יותר של SCF ו- TPO המושרה כניסה לתוך מחזור התא, התפשטות ובידול.מספר HSCs פנוטיפיים המאופיינים על ידי הסמן CD34 חיובי, CD38 שלילי, CD90 חיובי CD45 RA פנוטיפים שליליים גדל ביחס ריכוזי SCF או TPO ואילו התדירות בין התאים הכולל ירד. לאחר שלושה חודשים של השתלה של HSCs מח עצם למבוגרים מתורבתים, שחזור ניתן להעריך כפונקציה של התדירות שלהם בדם ההיקפי של אדם CD45 חיובי מורין, CD45 שלילי Ter119 תאים שליליים. שלושה שושלת כולל CD19 חיובי B תאים, CD13 שלילי, CD33 תאים מיאלואידים חיוביים, ו CD3 חיובי T תאים היו מחדש בעכברים NOG מושתל עם או מופשר טרי או מתורבת HSCs.בעקבות התרבות, HSCs יכול להיות נתון פרופיל ביטוי גנים כגון PCR בזמן אמת רצף RNA. אימות תפקודי באמצעות השתלה לעכברים לקויי חיסון יכול להתבצע גם. חוקרים יכולים להשוות ישירות רכיבה על אופניים HSCs רגיעה בתנאים מוגדרים על ידי התאמת ריכוזי ציטוקינים.זה יעזור להבין את תוכניות ההתחדשות העצמית הספציפיות ל- HSC, מנגנוני התנגדות ללחץ ותכונות מטבוליות, שקשה לבדוק בהגדרות vivo.

a-culture-method-to-maintain-quiescent-human-hematopoietic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מדגים כיצד לשמור על בריאות, מובחן האדם גזע עובריים (ES) התאים.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אופטימלי של תרבית גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPC) לחריטה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.

עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד תאי גזע המטופויטיים ארוכי טווח (LT-HSCs) ותאי HSC לטווח קצר (ST-HSCs) באמצעות מערכת הדיווח Hoxb5.

שיטת בידוד לתאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר

מוצג כאן פרוטוקול לייזום, תחזוקה וניתוח של תרביות תאי גזע המטופויטיים של עכברים באמצעות הרחבה מבוססת אלכוהול פוליוויניל ex vivo , כמו גם שיטות למניפולציה גנטית שלהם על ידי התמרה לנטיווירלית ואלקטרופורציה.

אקס ויוו הרחבה ומניפולציה גנטית של תאי גזע המטופויטיים של עכברים בתרביות מבוססות אלכוהול פוליוויניל

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

מסורתית, שני ממדי התרבות טכניקות תא לעיתים לגרום מאפיינים שינו לגבי סמנים בידול, ציטוקינים וגורמי גדילה. תלת ממדי התרבות תאים במערכת מסתובבת תרבית תאים (RCCS) reestablishes הביטוי של רבים מהגורמים הללו כפי שמוצג כאן עם קו trophoblast extravillous התא.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

יש לנו אופטימיזציה טכניקה מיקרואנקפסולציה כפלטפורמה 3D יעיל להפצת והבחנה בתאי גזע עובריים כדי האנדודרם ואת דופאמין (DA) נוירונים. הוא גם מספק הזדמנות בידוד החיסונית של תאים המארח במהלך ההשתלה. פלטפורמה זו ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

למד שיטת תרבית לשמירה על תאי גזע המטופואיטיים אנושיים במצב קוויאסנטי בתנאי מעבדה הדומים לסביבת מח העצם. הפרוטוקול מאפשר בחינת תרכובות המשפיעות על הישרדות והתמיינות התאים ללא שימוש במודלים בעלי חיים.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

גלה סרטונים נוספים