הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

השיטה הקיימת במבחנה לחקירת נדידת MSCs כוללת פרוטוקולי Transwell או ריפוי פצעים. ניתן להשתמש בשיטה המתוארת כאן כדי לעקוב אחר נדידת MSCs לשתילה בזמן אמת. מבחינת תרבות אקספלנט, היתרון של שיטה זו בהשוואה לאחרות הוא בכך שהיא משיגה הפחתה בזמן ובעלות, כמו גם פישוט של שלבי הניסוי.

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לצפות בביות תאי גזע למטרה בזמן אמת, מה שמוביל לפיתוח מודלים עם יעילות ביות אופטימלית. הסרת קרום טקטוריאלי קשה לחוקרים חסרי ניסיון. בהתאם לשלב הפיתוח, הבנת הזמן הנכון להסרת הממברנה הטקטוריאלית חשובה להצלחת פרוטוקול זה.

שידגים את ההליך יהיו ד"ר ג'ונג-און פארק Dr.Su הון לי, פרופסורים חוקרים מהמעבדה שלי. התחל בעיקור מכסה המנוע של תרבית רקמת הזרימה הלמינרית על ידי הדלקת האור האולטרה סגול למשך כ-30 דקות. רססו את כל המשטחים באתנול 70% לפני השימוש והניחו להם להתייבש.

הניחו מכשירי חיתוך באתנול 70% למשך 10 דקות, ולאחר מכן יבשו אותם לפני השימוש. לאחר עריפת ראשו של עכבר בן שלושה עד ארבעה ימים, יש להשרות את החזית באתנול 70% ולהניח אותו מתחת למיקרוסקופ סדרתי במכסה הזרימה הלמינרית. יש להשרות במהירות את הרקמה בתמיסת חיתוך רקמות כדי להסיר את האתנול.

חותכים את קו המרכז של הגולגולת עם הלהב הכירורגי, ואז חושפים את הגולגולת על ידי משיכת העור כלפי מטה וחיתוך תעלת השמע החיצונית של האוזן. חותכים מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הגולגולת על פני קו העין, ואז פותחים את הגולגולת ומסירים את המוח הקדמי, המוח הקטן וגזע המוח בעזרת מלקחיים קהים. בעזרת מיקרו-מלקחיים, הפרד את השבלול מהעצם הטמפורלית והעביר אותו לצלחת פטרי המכילה תמיסת חיתוך רקמות.

נתחו בזהירות את כל קפסולת השבלול והשאירו רק את הרקמה הרכה הפנימית של השבלול. החזק את המודיולוס של השבלול עם מלקחיים ואת צינור השבלול עם זוג מלקחיים נוסף, ואז הפרד לאט את שתי הרקמות. הסר את כלי הדם והקרום הטקטוריאלי על ידי קילוף עדין שלהם.

הנח כיסוי פלסטיק מעוקר בתמיסת חיתוך רקמות חדשה, ולאחר מכן הנח את איבר קורטי על הכיסוי וודא שהקרום הבסיסי פונה כלפי מטה. קבעו את הרקמה על ידי לחיצה על קרום רייסנר ורקמת המודיולוס הנותרת על הכיסויהחלקה בעזרת מלקחיים. העבירו את הכיסוי עם הרקמה המוטמעת למרכז צלחת קונפוקלית בגודל 35 מילימטר.

מניחים את גליל שיבוט הזכוכית על הכלי כשצמח השבלול ממוקם במרכז הכלי ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית אקספלנט לתוך הגליל. הניחו 5,000 תאי גזע מזנכימליים או MSCs שמקורם במח עצם בשני מיליליטר של מדיום תרבית מחוץ לגליל הזכוכית והכניסו את הצלחת לחממה. לאחר תרבית התאים כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, שאפו את כל המדיום בתוך הגליל ומחוצה לו והוציאו את גליל הזכוכית מהצלחת הקונפוקלית.

הוסף למנה שני מיליליטר של מדיום תרבות טרי. מניחים אותו בחממה לחה עד שהוא מוכן לניתוח. השתמש במערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם חממה עליונה לבמה.

הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי, אור הפלורסנט והמחשב. הגדר את תנאי החממה העליונה של הבמה ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% אטמוספירה של פחמן דו חמצני. הנח את צלחת הדגימה על כלי קיבוע הכלים, כסה אותה במכסה קיבוע הכלים וסגור את החדר עם מכסה החימום העליון.

התאם את הזום והמיקוד כדי למקם את האיבר של Corti ו-MSC בשדה הראייה. פתח את תוכנת עיבוד התמונה. תחת אפשרות המיקום, בחר אובייקט אפוכרומטי של 20X או צמצם מספרי 0.8 ואזור חיתוך של 0.5X.

תחת רכישה, לחץ על הגדרה חכמה ובחר EGFP. פתח את לשונית הערוץ ברכישה והגדר את עוצמת הלייזר ל-0.2%את חור הסיכה ל-44 מיקרומטר, את הרווח הראשי ל-750 וולט ואת הרווח הדיגיטלי ל-1.0. לחץ על ESID תחת הגדרת הדמיה והגדר את רווח ה-ESID לארבע ואת הרווח הדיגיטלי ל-7.5.

לחץ על אריחים והימור כדי לייצר 210 אריחים. פתח את אסטרטגיית המיקוד ובחר את מצב המיקוד. תחת סדרות זמן, הגדר את משך הזמן ל-24 שעות ואת המרווח ל-10 דקות.

ברכישה, הגדר את גודל המסגרת ל-512 על 512 פיקסלים, מהירות הסריקה לשמונה, הכיוון לדו-כיווני, הממוצע ל-4X והסיביות לפיקסל ל-16. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל את הניסוי. הנתיב הדו-ממדי של תאי גזע מזנכימליים או MSCs נבדק בשיטת ריפוי פצעים על ידי שימוש בגליל זכוכית כמחסום בין MSCs לאיבר קורטי.

כאשר האיבר של קורטי תורבת, פיברובלסטים צמחו מהר מאוד החוצה מתאי השיער החיצוניים בשכבה החיצונית ביותר. רוב MSCs המסומנים ב-GFP נדחקו החוצה על ידי פיברובלסטים שגדלים במהירות. עם זאת, חלקם חדרו לשכבת הפיברובלסטים ונדדו בהצלחה לאיבר קורטי.

התוצאות מ-72 שעות דגירה הראו כי MSCs נדדו לאיבר של קורטי והיו ממוקמים בעיקר במודיולוס ובאזור עם סיבי עצב השבלול המופרדים מהמודיולוס. המורפולוגיה של MSCs שונתה לצורה רדיאלית הדומה לזו של סיבי עצב. התאים הפכו לצורה ליניארית לאורך קו הלימבוס, ולא לאזור תאי השערה.

ה-MSCs הצליחו לנדוד ולגדול באזור איסוף סיבי העצב על ידי חדירה לשכבות התאים השונות ולמחסומים הפיזיים. כאשר נזק לתאי השיער נגרם על ידי טיפול של 16 שעות בקנמיצין והתאים תורבבו במשך 72 שעות נוספות לאחר הסרת הקנמיצין, MSCs היו ממוקמים לא רק במודיולוס, אלא גם בתאי השיער החיצוניים. קיבוע הרקמה הוא שלב חשוב בפרוטוקול זה בו מחובר האיבר של קורטי.

זה לא נופל בקלות. זהו טיפ טריוויאלי, אך מועיל לתרבית אקספלנט מוצלחת. שיטה זו עשויה להיות מותאמת לחקר היעילות של אקסוזומים המופרשים מ-MSCs.