Name: הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: חקור היגרציה של תאי גזע מזנכימליים בזמן אמת אל איבר קורטי פגוע באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר אחר תהליכי הומינג של תאי גזע לרקמות מטרה ומפשטת את הפרוטוקול הניסיוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר (NRF-2018-R1D1A1B0705050175, HURF-2017-66) מקרן המחקר הלאומית (NRF) של קוריאה וקרן המחקר של אוניברסיטת האלים.

כל פרוטוקולי המחקר מעורבים עכברי ICR אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת Yonsei במכללת וונג'ו לרפואה. הניסויים בוצעו על פי הקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית. בפרוטוקול זה, עכברי ICR בהריון הוחזקו במחזור אור / כהה 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.
1. ניתוח קוכליאה
<ol><li>לעקר את מכסה המנוע של רקמת הזרימה למינארית על ידי הפעלת האור האולטרה סגול במשך ~ 30 דקות, ולרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול לפני השימוש. אפשר למשטחים להתייבש.</li>
	<li>מניחים מכשירי ניתוח ב 70% אתנול במשך 10 דקות, ויבש לפני השימוש.</li>
	<li>השתמש בלהב הפעלה כדי לערוף את ראשם של עכברים בני 3-4 ימים לאחר הלידה (איור 2A).</li>
	<li>מניחים את הגולגולת מתחת לסטריאומיקרוסקופ במכסה המנוע של זרימת הלמינארי, ומשרים את הרקמה ב-70% אתנול.</li>
	<li>להשרות במהירות את הרקמה בתמיסת ניתוח רקמות (1x פתרון מלח מאוזן של האנק, 1 מ"מ HEPES) כדי להסיר את האתנול.</li>
	<li>חותכים את קו האמצע של הגולגולת בלהב כירורגי(איור 2B,C).</li>
	<li>חשוף את הגולגולת על ידי משיכת העור לפני זמן מה וחיתוך תעלת השמיעה החיצונית של האוזן(איור 2D).</li>
	<li>חותכים מהקצה השני לחלק האחורי של הגולגולת לאורך קו העין(איור 2E).</li>
	<li>פתחו את הגולגולת והסירו את המוח הפתח, המוח הקטן וגזע המוח בעזרת מלקחיים קהים(איור 2F,G).</li>
	<li>בעזרת מלקחיים זעירים, הפרד את השבלול מעצם הזמן(איור 2H).</li>
	<li>מעבירים את השבלול לצלחת פטרי המכילה תמיסת ניתוח רקמות.</li>
	<li>נתק בזהירות את כל קפסולת שיבולת השועל, והשאיר רק את הרקמה הרכה הפנימית של השוליאר (איור 2I,J).</li>
	<li>החזיקו את המודיעין של השבלול עם מלקחיים ותעל השבלול עם זוג מלקחיים נוסף, והפרידו לאט לאט בין שתי הרקמות (איור 2K).</li>
	<li>הסירו את הווסקולאריס ואת הקרום הטקטורלי על ידי קילוף עדין שלהם(איור 2L,M).</li>
	<li>מניחים כיסוי פלסטיק מעוקר בתמיסת ניתוח רקמות חדשה, ולאחר מכן מניחים את האיבר של קורטי על כיסוי בקוטר 9 מ"מ, מוודאים שהממברנה הבזילארית פונה כלפי מטה (איור 2N-P).</li>
	<li>לשתק את הרקמה על ידי לחיצה על קרום רייסנר ואת רקמת modiolus הנותרים על מכסה עם מלקחיים (איור 2N-P).</li>
	<li>מעבירים את הכיסוי עם הרקמה המוטבעת למרכז צלחת קונפוקלית בקוטר 35 מ"מ.</li>
	<li>מניחים את גליל שיבוט הזכוכית על המנה, עם explant שבלול ממוקם במרכז המנה, ומוסיפים 100 μL של מדיום תרבות explant (DMEM / F12, 10% סרום שור עוברי (FBS), 1% תוספת N2, ampicillin (10 מיקרוגרם / מ"ל))10 בתוך הצילינדר (איור 2Q).</li>
	<li>צלחת 5 ×10 3 תאים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שמקורו בעצם העכבר, MSCs מתויגים ב-2 מ"ל של מדיום תרבות (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% תוספת N2, 10 מיקרוגרם/מ"ל של אמפיצילין) מחוץ לגליל הזכוכית (איור 2R).<ol>
<li>כאשר MSCs הם 80-90% confluent, להעביר אותם על ידי ניתוק אותם עם חומצה טטראאצטית טריפסין-אתילנדיאמין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעבירים בזהירות את המנה הקונפוקלית לאינקובטור לח ומדגרים לילה ב-37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2.</li>
	<li>שאפו את כל המדיום בתוך ומחוץ לצילינדר, ולאחר מכן הסירו את גליל הזכוכית מהצלחת הקונפוקלית.</li>
	<li>מוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבות טרי לצלחת הקונפוקלית, ומדגירה את מנת תרבית הרקמה באינקובטור לח עד שהיא מוכנה לניתוח.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> איור 2. ניתוח של לכישלת עכבר ושיתוף פעולה של האיבר של קורטי ו- MSCs. עריפתראשו של העכבר, (B) ו - (C) ניתוח קשתי של הראש, (D) ו - (E) ניתוח קורנל של המוח, (F) ו - (G) הסרת המוח ועצם הזמן, (H) השבלול, (אני) הסרת קיר השבלול הגרמי, ( J ) בידוד של השבלול, ( K ) הפרדת צינור השבלול מן modiolus, (J) בידוד של השבלול, (K) הפרדת צינור השבלול מן modiolus, (L) הפרדת סטריה vascularis (SV) ורצועה ספירלית (SL) מהאיבר של קורטי, (M) הסרת קרום tectorial, (N-P) קיבוע של שבלול על תלוש כיסוי פלסטיק, (Q) מיקום של coverlip ו גליל זכוכית בצלחת confocal, (R)חיסון של MSCs. בר בקנה מידה לבן (A-E) = 1 ס"מ; כתום (F, G, P) ו פס בקנה מידה צהוב (H,I) = 1 מ"מ; פס בקנה מידה ירוק (J-O) = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. הדמיה לשגות בזמן
<ol><li>לניסויים המוצגים כאן, השתמש במערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם מערכת אינקובטור הבמה העליונה.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקאלי, את האור הפלואורסצנטי ואת המחשב.</li>
	<li>הגדר את התנאים של החממה הבמה העליונה להציב על הבמה של מיקרוסקופ confocal ל 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 אטמוספרה.</li>
	<li>מניחים את צלחת המדגם על כלי התיקון של המנה, מכסים במכסה תיקון המנה וסוגר את התא עם מכסה התנור העליון.</li>
	<li>התאם את גודל התצוגה ואת המוקד כדי להתאים לשפות אחר האיבר של Corti ו- MSCs בשדה התצוגה.</li>
	<li>פתח את תוכנת עיבוד התמונה. תחת אפשרות האיתור, בחר באובייקט 20x Plan-Apochromat (צמצם מספרי 0.8) ובאזור חיתוך של 0.5x.</li>
	<li>תחת רכישה, לחץ על התקנה חכמה ובחר EGFP.</li>
	<li>פתח את כרטיסיית הערוץ תחת רכישה, והגדר את עוצמת הלייזר ל- 0.2%, את חור הפינה ל- 44 מיקרומטר, את הרווח הראשי ל- 750 Vואת הרווח הדיגיטלי ל- 1.0.</li>
	<li>לחץ על ESID תחת הגדרת הדמיה, והגדר את רווח ESID ל- 4 ואת הרווח הדיגיטלי ל- 7.5.</li>
	<li>לחץ על אריחים יתד לייצר 210 אריחים.</li>
	<li>פתח את אסטרטגיית מיקוד ובחר את מצב המוקד.</li>
	<li>תחת סידרת זמן, הגדר את משך הזמן ל- 24 שעות ואת מרווח הזמן ל- 10 דקות.</li>
	<li>תחת רכישה, להגדיר את גודל המסגרת ל 512 x 512 פיקסלים, מהירות הסריקה ל 8, הכיוון דו כיווני, הממוצע ל 4x, ואת הסיביות לפיקסל ל 16.</li>
	<li>לחץ על להתחיל ניסוי כדי להתחיל את הניסוי.</li>
</ol>3. שינוי קובץ תמונה
<ol><li>תחת עיבוד, לחץ על תפירה, ולהגדיר את הכיסוי המינימלי ל 5% ואת המעבר המקסימלי ל 10%.</li>
	<li>לחץ על ייצוא הסרט, להגדיר לא דחוס, ולהגדיר את המהירות ל 7.5.</li>
</ol>4. חיסון
<ol><li>שאפתן את המדיום בזהירות, ולשטוף את המדגם פעמיים עם מלוחים אגירה פוספט (PBS) במשך 5 דקות.</li>
	<li>לתקן את המדגם עם 4% פורמלין ב PBS במשך 15 דקות, ולשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.</li>
	<li>לחלחל המדגם ב 0.1% טריטון X-100 ב PBS במשך 10 דקות, ולשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 250 μL של phalloidin-iFluor 647 מגיב (1:1000 דילול PBS), ולהדגיר את המדגם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר.</li>
	<li>לשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.</li>
	<li>מעבירים את הכיסוי לשקופית הזכוכית ומוסיפים 2 טיפות של פתרון הרכבה.</li>
	<li>הנח כיסוי בשקופית בעדינות.</li>
	<li>לאטום את הכיסוי עם לק ברור ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בחושך עד התאים נצפו.</li>
	<li>צלם את השקופית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מסנן מתאים בהתרגשות/פליטה (Ex/Em)=650/665 ננומטר עבור פאלודין וב- Ex/Em=488/507 nm עבור EGFP.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+hearing+loss+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MSC+from+selected+species%3A+Features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li>
<li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells%3A+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li>
<li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+homing%3A+Mechanisms+and+strategies+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li>
<li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction%3A+a+systemic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li>
<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cochlea%3A+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li>
<li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li>
<li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Audiology+and+Otology%22%5BJournal%5D)">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li>
<li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+regeneration%3A+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השתלת MSCs לאתרים פגומים כדי לקדם את ההתחדשות של תאים פגומים נחקרה בהרחבה, ואת ההשפעה הטיפולית ניכרת. ההשתלה והבידול הבאים של MSCs דווחו כדי לשחזר את השמיעה בחולדות עם אובדן שמיעה המושרה על ידי חומצה 3-nitropropionic13. למרות לי ואח 'להחיל MSCs על בני אדם טרנס-ורידים, הם לא השיגו שום שיפור משמעותי בשמיעה14. עד לאחרונה, כמעט 12 ניסויים נערכו כדי לשחזר את השמיעה במודל המכרסמים על ידי השתלת MSC. למרות התוצאה אינה ברורה במקצת בגלל הטרוגניות, יש אינדיקציה מסוימת כי MSCs יכול לקד...

אובדן שמיעה יכול להתרחש מולדת או יכול להיגרם בהדרגה על ידי מספר גורמים, כולל הזדקנות, תרופות, ורעש. אובדן שמיעה הוא לעתים קרובות קשה לטפל כי זה מאוד מאתגר לשחזר תפקוד לקוי פעם תאי השיער האחראים על השמיעה פגומים1. על פי ארגון הבריאות העולמי, 461 מיליון בני אדם ברחבי העולם מעריכים כי יש אובדן שמיעה, המהווה 6.1% מאוכלוסיית העולם. מבין הסובלים מירידה בשמיעה, 93% הם מבוגרים ו-7% הם ילדים.
מספר גישות נוסו לטפל באובדן שמיעה; יש לציין כי גישת התחדשות באמצעות MSCs התפתחה כטיפול מבטיח. כאשר הרקמה פגומה, MSCs משתחררים באופן טבעי לתוך מערכת הדם ונדדים לאתר הפציעה שבו הם מפרישים מולקולות שונות כדי ליצור microenvironment המקדםהתחדשות 2. לפיכך, חשוב לפתח שיטה לטיפול ברקמות פגומות באמצעות הגירה של MSCs מושתל חיצונית כדי למקד איברים ואת הפרשתם הבאים של מולקולות הגורמות ויסות חיסוני חזק, אנגיוגנזה, ואנטי אפופטוזיס כדי לשפר את השיקום של תפקוד התא הפגוע3,4,5.
תהליך הביות שבו MSCs נודדים לרקמות פגומות עשוי להיות המכשול החשוב ביותר להתגבר עליו. MSCs יש מנגנון ביות מערכתי עם שלבים רציפים של קשירה / גלגול, הפעלה, מעצר, גלגול /diapedesis, והגירה6,7,8. נכון לעכשיו, נעשים מאמצים לזהות דרכים לשיפור צעדים אלה. אסטרטגיות שונות, כולל שינוי גנטי, הנדסת משטח התא, הפריה חוץ גופית, והדרכה מגנטית, נבדקו6,7. בנוסף, נעשו מספר ניסיונות לקדם את ההגנה וההתחדשות של תאי שיער שמיעתיים על ידי ביות MSCs לאתר של שבלול פגום. עם זאת, מעקב אחר MSCs ב vivo הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית ודורש מיומנויות מיוחדות מאוד9.
כדי לפתור בעיה זו, פותחה שיטה לבחינת הביות של MSCs בשבלול באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן לשגות המצלם את נדידת התאים במשך מספר שעות (איור 1). הוא פותח בתחילת המאה ה-20 והפך לאחרונה לכלי רב עוצמה לחקר הגירה של תאים ספציפיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> איור 1: תקציר גרפי. (A) לאחר שהאיבר המנותח של קורטי דבק בכיסוי פלסטיק באמצעות מלקחיים, הכיסוי ממוקם על צלחת מיקרוסקופית עם תחתית זכוכית 35 מ"מ, ו- (B) גליל הזכוכית ממוקם. (C) לאחר מילוי החלק הפנימי של גליל הזכוכית עם בינוני, (D) GFP שכותרתו MSCs עם בינוני מתווספים בזהירות מחוץ הצילינדר. (E)לאחר הדגירה בן לילה,(F)הצילינדר זכוכית מוסר, ותמונות נלקחות עם מיקרוסקופ confocal. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; MSCs = תאי גזע mesenchymal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Buffer</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% פורמלין</td><td>T& </td><td>אני BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>A5354-10 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא BSA</td><td>&nbsp;</td>צלחת קונפוקלית <td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>coverslip</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר</td><td>16140071</td><td></td>מדעי</tr><tr><td>Fluorsheild עם DAPI</td><td>sigma&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>תרמו פישר</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>מדעי תוסף N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 Reagent</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>חממה עליונה</td><td>שלב TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>זן C57BL/6 תאי גזע מסנכימליים של עכבר עם GFP</td><td>cyagen</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

כדי לחקור את ההשפעות של תאי גזע mesenchymal (MSCs) על התחדשות התא וטיפול, שיטה זו עוקבת אחר נדידת MSC ושינויים מורפולוגיים לאחר תרבות משותפת עם אפיתל שבלול. האיבר של קורטי היה משותק על כיסוי פלסטיק על ידי לחיצה על חלק מהקרום של רייסנר שנוצר במהלך הניתוח. MSCs מוגבל על ידי גליל זכוכית היגר לכיוון אפיתל cochlear כאשר הצילינדר הוסר. לוקליזציה השלטת שלהם נצפתה modiolus של האיבר של קורטי, מיושר בכיוון דומה לזה של סיבי העצב. עם זאת, כמה MSCs היו לוקליזציה באזור הלימבוס והראה צורה מוארכת אופקית. בנוסף, ההגירה לאזור תאי השיער הוגדלה, והמורפולוגיה של ה- MSCs השתנתה לצורות שונות לאחר הטיפול בקנאמיצין. לסיכום, תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שהשיתוף של MSCs עם אפיתל שבלול יהיה שימושי להתפתחות טיפולית באמצעות השתלת תאים ולחיקרי התחדשות תאים שיכולים לבחון תנאים וגורמים שונים.

אין ויטרו הגירה של MSCs במצב תלת מימדי הוערך על ידי מערכת Transwell או על ידי שיטת ריפוי הפצע המסורתית כדי לצפות הגירה במצב דו מימדי (2D)11. האיבר של קורטי הוא מבנה מורכב המורכב מתאים שונים כגון תאי בוצ'ר, תאי קלאודיוס, תאי דיטר, תאי עמוד, תאי הנסן, תאי שיער החיצוניים, תאי שיער פנימיים, סיבי עצב, קרום בזילארי ולמינה12. כאשר MSCs מושתלים לתוך רקמה המורכבת מתאים מורכבים כאלה, השימוש בטכנולוגיה כדי לברר היכן תאים מגויסים ומיוצבת הוא חיוני כדי ל...

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

השיטה הקיימת במבחנה לחקירת נדידת MSCs כוללת פרוטוקולי Transwell או ריפוי פצעים. ניתן להשתמש בשיטה המתוארת כאן כדי לעקוב אחר נדידת MSCs לשתילה בזמן אמת. מבחינת תרבות אקספלנט, היתרון של שיטה זו בהשוואה לאחרות הוא בכך שהיא משיגה הפחתה בזמן ובעלות, כמו גם פישוט של שלבי הניסוי.ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לצפות בביות תאי גזע למטרה בזמן אמת, מה שמוביל לפיתוח מודלים עם יעילות ביות אופטימלית. הסרת קרום טקטוריאלי קשה לחוקרים חסרי ניסיון. בהתאם לשלב הפיתוח, הבנת הזמן הנכון להסרת הממברנה הטקטוריאלית חשובה להצלחת פרוטוקול זה.מי שידגים את ההליך יהיו ד"ר ג'ונג-און פארק Dr.Su הון לי, פרופסורים חוקרים מהמעבדה שלי. התחל בעיקור מכסה המנוע של תרבית רקמת הזרימה הלמינרית על ידי הדלקת האור האולטרה סגול למשך כ-30 דקות. רססו את כל המשטחים באתנול 70% לפני השימוש והניחו להם להתייבש.הניחו מכשירי חיתוך באתנול 70% למשך 10 דקות, ולאחר מכן יבשו אותם לפני השימוש. לאחר עריפת ראשו של עכבר בן שלושה עד ארבעה ימים, יש להשרות את החזית באתנול 70% ולהניח אותו מתחת למיקרוסקופ סדרתי במכסה הזרימה הלמינרית. יש להשרות במהירות את הרקמה בתמיסת חיתוך רקמות כדי להסיר את האתנול.חותכים את קו המרכז של הגולגולת עם הלהב הכירורגי, ואז חושפים את הגולגולת על ידי משיכת העור כלפי מטה וחיתוך תעלת השמע החיצונית של האוזן. חותכים מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הגולגולת על פני קו העין, ואז פותחים את הגולגולת ומסירים את המוח הקדמי, המוח הקטן וגזע המוח בעזרת מלקחיים קהים. בעזרת מיקרו-מלקחיים, הפרד את השבלול מהעצם הטמפורלית והעביר אותו לצלחת פטרי המכילה תמיסת חיתוך רקמות.נתחו בזהירות את כל קפסולת השבלול והשאירו רק את הרקמה הרכה הפנימית של השבלול. החזק את המודיולוס של השבלול עם מלקחיים ואת צינור השבלול עם זוג מלקחיים נוסף, ואז הפרד לאט את שתי הרקמות. הסר את כלי הדם והקרום הטקטוריאלי על ידי קילוף עדין שלהם.הנח כיסוי פלסטיק מעוקר בתמיסת חיתוך רקמות חדשה, ולאחר מכן הנח את איבר קורטי על הכיסוי וודא שהקרום הבסיסי פונה כלפי מטה. קבעו את הרקמה על ידי לחיצה על קרום רייסנר ורקמת המודיולוס הנותרת על הכיסויהחלקה בעזרת מלקחיים. העבירו את הכיסוי עם הרקמה המוטמעת למרכז צלחת קונפוקלית בגודל 35 מילימטר.מניחים את גליל שיבוט הזכוכית על הכלי כשצמח השבלול ממוקם במרכז הכלי ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית אקספלנט לתוך הגליל. הניחו 5,000 תאי גזע מזנכימליים או MSCs שמקורם במח עצם בשני מיליליטר של מדיום תרבית מחוץ לגליל הזכוכית והכניסו את הצלחת לחממה. לאחר תרבית התאים כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, שאפו את כל המדיום בתוך הגליל ומחוצה לו והוציאו את גליל הזכוכית מהצלחת הקונפוקלית.הוסף למנה שני מיליליטר של מדיום תרבות טרי. מניחים אותו בחממה לחה עד שהוא מוכן לניתוח. השתמש במערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם חממה עליונה לבמה.הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי, אור הפלורסנט והמחשב. הגדר את תנאי החממה העליונה של הבמה ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% אטמוספירה של פחמן דו חמצני. הנח את צלחת הדגימה על כלי קיבוע הכלים, כסה אותה במכסה קיבוע הכלים וסגור את החדר עם מכסה החימום העליון.התאם את הזום והמיקוד כדי למקם את האיבר של Corti ו-MSC בשדה הראייה. פתח את תוכנת עיבוד התמונה. תחת אפשרות המיקום, בחר אובייקט אפוכרומטי של 20X או צמצם מספרי 0.8 ואזור חיתוך של 0.5X.תחת רכישה, לחץ על הגדרה חכמה ובחר EGFP. פתח את לשונית הערוץ ברכישה והגדר את עוצמת הלייזר ל-0.2%את חור הסיכה ל-44 מיקרומטר, את הרווח הראשי ל-750 וולט ואת הרווח הדיגיטלי ל-1.0. לחץ על ESID תחת הגדרת הדמיה והגדר את רווח ה-ESID לארבע ואת הרווח הדיגיטלי ל-7.5.לחץ על אריחים והימור כדי לייצר 210 אריחים. פתח את אסטרטגיית המיקוד ובחר את מצב המיקוד. תחת סדרות זמן, הגדר את משך הזמן ל-24 שעות ואת המרווח ל-10 דקות.ברכישה, הגדר את גודל המסגרת ל-512 על 512 פיקסלים, מהירות הסריקה לשמונה, הכיוון לדו-כיווני, הממוצע ל-4X והסיביות לפיקסל ל-16. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל את הניסוי. הנתיב הדו-ממדי של תאי גזע מזנכימליים או MSCs נבדק בשיטת ריפוי פצעים על ידי שימוש בגליל זכוכית כמחסום בין MSCs לאיבר קורטי.כאשר האיבר של קורטי תורבת, פיברובלסטים צמחו מהר מאוד החוצה מתאי השיער החיצוניים בשכבה החיצונית ביותר. רוב MSCs המסומנים ב-GFP נדחקו החוצה על ידי פיברובלסטים שגדלים במהירות. עם זאת, חלקם חדרו לשכבת הפיברובלסטים ונדדו בהצלחה לאיבר קורטי.התוצאות מ-72 שעות דגירה הראו כי MSCs נדדו לאיבר של קורטי והיו ממוקמים בעיקר במודיולוס ובאזור עם סיבי עצב השבלול המופרדים מהמודיולוס. המורפולוגיה של MSCs שונתה לצורה רדיאלית הדומה לזו של סיבי עצב. התאים הפכו לצורה ליניארית לאורך קו הלימבוס, ולא לאזור תאי השערה.ה-MSCs הצליחו לנדוד ולגדול באזור איסוף סיבי העצב על ידי חדירה לשכבות התאים השונות ולמחסומים הפיזיים. כאשר נזק לתאי השיער נגרם על ידי טיפול של 16 שעות בקנמיצין והתאים תורבבו במשך 72 שעות נוספות לאחר הסרת הקנמיצין, MSCs היו ממוקמים לא רק במודיולוס, אלא גם בתאי השיער החיצוניים. קיבוע הרקמה הוא שלב חשוב בפרוטוקול זה בו מחובר האיבר של קורטי.זה לא נופל בקלות. זהו טיפ טריוויאלי, אך מועיל לתרבית אקספלנט מוצלחת. שיטה זו עשויה להיות מותאמת לחקר היעילות של אקסוזומים המופרשים מ-MSCs.

in-vitro-time-lapse-live-cell-imaging-to-explore-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  הדמיה קונפוקלית של נוירונים נודדים בתרבית פרוסה אורגנוטיפית של מוח עכבר עוברי באמצעות In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse כדי לצפות בנדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח מהאזור התת-חדרי לצלחת קליפת המוח באמצעות פיגומי גליה רדיאליים בפרוסות מוח עובריות של עכבר.

הדמיית זמן-lapse של נדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח בפרוסות מוח עובריות של עכבר

הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

אנו מתארים את פעולות השירות עבור תיוג פלורסנט tangentially גידול תאים על-ידי אלקטרופורציה ולאחר עבור הדמיה בצילום מואץ של התנועה תאים עם תוויות בתרבות שטוח-הר כדי להמחיש נודדות תא התנהגות tectum אופטיים לפתח הבחורה .

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

חקור היגרציה של תאי גזע מזנכימליים בזמן אמת אל איבר קורטי פגוע באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר אחר תהליכי הומינג של תאי גזע לרקמות מטרה ומפשטת את הפרוטוקול הניסיוני.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

גלה סרטונים נוספים