הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

נוקלאוזידים ונוקלאוטידים הם מרכיבים מטבוליים מרכזיים בכל האורגניזמים החיים. חילוף החומרים שלהם נדרש להתפתחות תאים. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה לכימות של מטבוליטים אלה.

שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של נוקלאוזידים ונוקלאוטידים בצמחים. טיפולים מקדימים מדגם מלא וניתוחים LC-MS/MS לקחת בערך יומיים עבור קבוצה של 10 עד 20 דגימות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל הצמחים ואפילו אורגניזמים אחרים.

מי שידגים את ההליך יהיה צ'אנגואה ז'ו, פרופסור חבר ממעבדת חן. כדי לגדל את הצמחים, להבטיח כי זרעי Arabidopsis מעוקרים ב 70% אתנול במשך 10 דקות וזרע על צלחות אגר עם 1/2 כוח Murashige וחומרים מזינים Skoog. דגירה הצלחות בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ואז להעביר אותם לתא צמיחה מבוקר תחת 16 שעות של אור ב 22 מעלות צלזיוס ושמונה שעות של כהה ב 20 מעלות צלזיוס.

לקצור 100 מיליגרם של שתילים שבועיים להקפיא אותם חנקן נוזלי עבור מיצוי מטבוליט. טוחנים 100 מיליגרם של רקמות צמחיות קפואות עם שבעה עד שמונה חרוזי פלדה בטחנת מיקסר מקוררת מראש במשך חמש דקות בתדר של 60 הרץ. הכינו את פתרון החילוץ, המכיל מתנול, אצטוניטריל ומים ביחס של שניים לשניים לאחד.

Resuspend את החומרים הומוגנית עם מיליליטר אחד של פתרון החילוץ. צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך ב 12, 000 XG במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר 0.5 מיליליטר של ההשעיה לצינור חדש 1.5 מיליליטר להקפיא אותו חנקן נוזלי. מאדים את הדגימה הקפואה במייבש הקפאה ומנצלים אותה מחדש ב-0.5 מיליליטר של 5% אצטוניטריל ו-95% מים.

צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך ב 4, 000 XG במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. טען את הבקבוקון לבקבוקון למדידת LC-MS/MS. הכן חיץ אצטט אמוניום 10 מילימולאר על ידי המסת 1.5 גרם של אמוניום אצטט בשני ליטרים של מים כפולים deionized.

כוונן את ה- pH ל- 9.5 עם 10% אמוניום וחומצת אצטט. הכן שני ליטרים של אולטרה-סגול 100% מתנול למדידת נוקלאוזידים, ולאחר מכן הכן שני ליטרים של אצטוניטריל אולטרה-סגול למדידת נוקלאוטידים. להזריק 0.02 מיליליטר של מיצוי מטבוליט pretreated של כל מדגם שהוכן בעבר לתוך מערכת HPLC עם משאבות בינאריות בשילוב עם ספקטרומטר מסה מרובע משולש.

כדי ליצור את עקומות הכיול הסטנדרטיות, מאגר שש עקירות מדגם יחד מערבולת התערובת, ואז aliquot אותו לשש עקירות שוב כדי להשיג כל רקע. הוסף שישה ריכוזים שונים של כל תקן אלה שש עקירות בהתאמה להזריק אותם אחד אחד לתוך מערכת HPLC. רשום את אזורי השיא של כל תקן בריכוזים שונים באמצעות המעברים ההמוניים.

פרוטוקול זה שימש כדי לזהות ולכמת N1-מתילאדנוזין, נוקליאוסיד שונה ידוע, בשתילים מסוג בר Arabidopsis בן שבועיים. פרופיל ספקטרומטריית המסה הצביע על כך שיוני המוצרים הנוצרים מתקן N1-מתילאדנוזין הם ביחסי 150 ו- 133 MZ. ואותו פרופיל נצפה בחילוץ אפס קולומביה.

בשל השפע הגבוה של יון המוצר של 150 MZ, המעבר ההמוני של 282.1 ל 150 נבחר לזיהוי N1-methyladenosine. זמן השמירה של שיא היעד היה 7.05 דקות. זהה לזמן השמירה של תקן N1-methyladenosine.

סדרת ריכוז של תקני N1-methyladenosine נוספה לתוך שש עקירות מדגם. הדגימות הסטנדרטיות הוזרקו לתוך LC-MS / MS ואזורי השיא המוגברים של N1-methyladenosine זוממים נגד הריכוזים הנומינליים של הסטנדרטים. שש עקירות הרקע השוות חשובות ליצירת עקומת כיול מדויקת וחוזרת לכימות.

השיטה שלנו ניתן ליישם לחקור מסלולים מטבוליים בצמחים. על ידי השוואת פרופילי חילוף החומרים בין מוטנטים מסוג פראי ואובדן תפקוד, השטף המטבולי יכול להימשך.