Name: הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: למד כיצד לכמת נוקלאוזידים ונוקלאוטידים בצמחים בדיוק ובמהירות באמצעות HPLC-MS/MS. השיטה מאפשרת עיבוד של 10–20 דגימות ביומיים ומתאימה למגוון רחב של אורגניזמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה כספית על ידי קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (KJQN202060), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900907), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20190528), המרכז הבינלאומי להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה (CRP /CHN20-04_EC) ל- M.C., וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (LGZD202004) עד X.L.

1 גידול צמחים ואיסוף חומרים
<ol><li>ודא כי זרעי Arabidopsis מעוקרים ב 70% אתנול במשך 10 דקות וזרעו על צלחות אגר, אשר הוכנו עם חצי כוח Murashige וחומרים מזינים Skoog.</li>
	<li>דגירה הצלחות המכילות זרעי Arabidopsis תחת כהה ב 4 °C (60 °F) עבור 48 שעות, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך תא צמיחה מבוקר תחת 16 שעות אור של 55 μmol m-2 s-1 ב 22 °C (60 °F) ו 8 שעות כהה ב 20 °C (60 °F).</li>
	<li>קציר 100 מ"ג של שתילים 2 שבועות (משקל טרי) להקפיא חנקן נוזלי עבור מיצוי מטבוליטים. התראה: החוקרים צריכים ללבוש כראוי כפפות, משקפי מגן, וחלוק מעבדה כדי למנוע זיהום רקמת אדם במהלך איסוף החומרים.</li>
</ol>2 נוקלאוזידים/מיצוי נוקלאוטידים
<ol><li>קרקע 100 מ"ג של רקמות צמחיות קפואות עם 7-8 חרוזי פלדה בטחנת מיקסר טרום קר במשך 5 דקות בתדר של 60 הרץ.</li>
	<li>הכן את פתרון החילוץ, המכיל מתנול, אצטוניטריל ומים ביחס של 2:2:1.</li>
	<li>Resuspend החומרים הומוגניים (כולל רוב מטבוליטים אבל לא חלבונים) עם 1 מ"ל של פתרון מיצוי.</li>
	<li>צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להעביר 0.5 מ"ל של ההשעיה לצינור חדש 1.5 מ"ל להקפיא את החנקן הנוזלי.</li>
	<li>לאדות את המדגם הקפוא במייבש להקפיא resuspend ב 0.1 מ"ל של 5% אצטוניטריל ו 95% מים.</li>
	<li>צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך (0.1 מ"ל) ב 40,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. טען את ה- supernatant בבקבוקון למדידת LC-MS/MS.</li>
</ol>מדידת LC-MS/MS
<ol><li>הכן חיץ אמוניום אצטט 10 מ"מ על ידי המסת 1.1 גרם של אמוניום אצטט ב 2 L של מים כפולים deionized (שלב נייד A). כוונן את ה- pH ל- 9.5 על-ידי 10% אמוניום וחומצת אצטט.</li>
	<li>הכן 2 L של מתנול 100% אולטרה-דק (שלב נייד B1) למדידת נוקלאוזידים. כמו כן, הכן 2 L של אצטוניטריל אולטרה-סגול 100% (שלב נייד B2) למדידת נוקלאוטידים.</li>
	<li>הזרק 0.02 מ"ל של מיצוי מטבוליטים שטופלו מראש של כל דגימה משלב 2.7 למערכת HPLC עם משאבות בינאריות (LC) בשילוב עם ספקטרומטר מסה מרובע משולש (MS). התראה: מערכת HPLC משתמשת בעמודת C18 (50 x 4.6 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרומטר; עבודה ב-25 °C (25 °C) אגירה עם שלב נייד A ו- B1 (איור 1A) להפרדת נוקלאוזידים ולהשתמש בעמודת פחמן גרפיטי נקבובי (PGC) (50 x 4.6 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרומטר; עבודה ב 25 °C (70 °F) עם שלב נייד A ו- B2 (איור 1B) עבור הפרדה גרעינית. כל דגימה הוזרקה שלוש פעמים עבור השכפול הטכני.</li>
	<li>תכנן את השיטה כפי שמוצג בטבלה 1 עבור העמודה C18 ואת השיטה כפי שמוצג בטבלה 2 עבור העמודה PGC. הגדר קצב זרימה של 0.65 מ"ל מינימום-1. הערה: המעברים ההמוניים (טבלה 3) היו במעקב על ידי ספקטרומטר מסה. תנאי ניתוח ספקטרום המסה של שמונה נוקלאוזידים וחמישה נוקלאוטידים המכילים נוקלאוטידים קנוניים ונודים רשומים בטבלה 3.</li>
	<li>רשום את אזורי השיא של כל מתחם יעד (איור 1).</li>
</ol>4 דורות של עקומות הכיול הסטנדרטיות
<ol><li>בריכה שש עקירות מדגם יחד, אשר יוצרו בעקבות התיאור בסעיף 2, ומערבולת אותו. לאחר מכן, aliquot אותו לשש עקירות (אותו נפח) שוב כדי לקבל כל רקע.</li>
	<li>הוסף שישה ריכוזים שונים של כל תקן אלה שש עקירות, בהתאמה, ולהזריק להם אחד אחד הבא שלב 3.3.</li>
	<li>רשום את אזורי השיא של כל תקן בריכוזים שונים באמצעות המעברים ההמוניים כמתואר בשלבים 3.4 ו- 3.5.</li>
	<li>התווה את אזור השיא כנגד הריכוז הנומינלי של כל תקן כדי ליצור עקומה של שש נקודות. הערה: אזורי השיא של נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שנרשמו בשלב 3.5 צריכים ליפול בטווח של עקומות כיול סטנדרטיות.</li>
	<li>חישוב המשוואה של קו ישר עבור כל תרכובת סטנדרטית: Y = aX + b</li>
</ol>5 כימות מטבוליטים
<ol><li>חשב את תכולת המטבוליטים באמצעות אזור השיא שנרשם בשלב 3.5 והמשוואה משלב 4.5.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

אורגניזמים מכילים נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים, כולל נוקלאוטידים קנוניים וחורגים. עם זאת, נקודות הקצה של המקור והמטבוליות שלהם, במיוחד נוקלאוזידים ששונו, עדיין מעורפלים. יתר על כן, ההבנה הנוכחית של הפונקציה ואת הומאוסטזיס של חילוף החומרים נוקלאוזידים / נוקלאוטידים להישאר לחקור ולהרחיב. כדי לחקור אותם, יש צורך בשיטה מדויקת וזהבה לזיהוי וכימות מטבוליטים אלה. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש בספקטרום המסה לגילוי נוקלאוזידים/נוקלאוטידים. אם ניקח N1-מתילדנוזין כדוגמה, שיטה זו יכולה לזהות נמוך כמו 0.02 ng רגיל, ואת הדיוק...

נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם מרכיבים מטבוליים מרכזיים בכל האורגניזמים החיים, שהם סימנים מקדימים לחומצות גרעין וקואנזימים רבים, כגון ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD), וחשובים בסינתזה של מקרומולקולטים כגון פוספוליפידים, גליקוליפידים ופוליסכרידים. מבחינה מבנית, נוקליאוסיד מכיל גרעין, אשר יכול להיות אדנין, גואנין, uracil, ציטוצין, או תימינה, ו moiety סוכר, אשר יכול להיות ריבוז או deoxyribose1,2. נוקלאוטידים יש עד שלוש קבוצות פוספט מחייב את המיקום 5 פחמן של moiety הסוכר של נוקלאוזידים3. חילוף החומרים של נוקלאוטידים בצמחים חיוני לנביטת זרעים וצמיחת עלים4,5,6. כדי להבין טוב יותר את תפקידם הפיזיולוגי בהתפתחות הצמח, יש לקבוע את השיטות לכימות מוחלט של נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים ב- vivo.
אחת הגישות הנפוצות ביותר למדידת נוקלאוזידים /נוקלאוטידים מעסיקה כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב עם גלאי אולטרה סגול גלוי (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. בשנת 2013, באמצעות HPLC, Dahncke ו- Witte כימתו מספר סוגים של גרעינים ב- Arabidopsis thaliana7. הם זיהו תכולת גואנוסין משופרת במוטנט החדרת T-DNA מיקוד בגן deaminase guanosine בהשוואה לצמח מסוג בר. נוקלאוזיד פירמידין נוסף, ציטידין, זוהה גם הוא כמותית בצמחים המשתמשים בשיטה זו, מה שהביא לזיהוי של גן דימינאז ציטידין בתום לב 4. בהתבסס על גלאי UV, שיטה זו, עם זאת, לא יכול להבחין בקלות את הגרעינים אשר יש ספקטרום דומה וזמני שמירה, למשל, גואנוסין או קסנטוסין. מגבלת הגילוי של שיטת HPLC היא גבוהה יחסית, ולכן, הוא משמש לעתים קרובות למדידת תוכן גבוה של נוקלאוזידים ב vivo, כגון ציטידין, uridine, ו guanosine.
בנוסף, כרומטוגרפיה גז בשילוב ספקטרומטריית מסה (GC-MS) יכול לשמש גם במדידת נוקליאוסיד. מרוויח מזה, האק et. AL. זוהה בהצלחה uridine וחומצת שתן, שהוא מטבוליט במורד הזרם של מסלול קטבולי נוקליאוסיד, בזרעים של A. thaliana12. עם זאת, GC משמש בדרך כלל כדי להפריד תרכובות נדיפות אבל לא מתאים לחומרים labile תרמית. לכן, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) היא כנראה טכניקה אנליטית מתאימה ומדויקת יותר לזיהוי, הפרדה וכימות של הנוקלאוזידים / נוקלאוטידים13,14. מספר מחקרים קודמים דיווחו כי עמודת HILIC יכולה לשמש עבור נוקלאוזידים ונוקלאוטידיםהפרדת 15,16 ו איסוטופי שכותרתו סטנדרטים פנימיים הועסקו עבור כימות מורכב17. עם זאת, שני הרכיבים יקרים יחסית, במיוחד הסטנדרטים המסחריים עם תווית איזוטופ. כאן, אנו מדווחים על גישה רלוונטית מבחינה כלכלית LC-MS / MS למדידת נוקלאוזידים / נוקלאוטידים. שיטה זו כבר שימשה בהצלחה לכימות של נוקלאוזידים / נוקלאוטידים מגוונים, כולל ATP, N6- מתיל-AMP, AMP, GMP, uridine, ציטידין, פסאודורידין1,5,6,18, בצמחים ו Drosophila. יתר על כן, השיטה שאנו מדווחים כאן ניתן להשתמש אורגניזמים אחרים גם כן.

<table><tbody><tr><td>אצטוניטריל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>ציטידינים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>עמודת Hypercarb</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>אינוזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-מתיל-אדנוזין</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-מתילגואנוזין</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>מדיום Murashige ו-Skoog</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>עמודת Polaris 5 C18A</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>פסאודואורידין</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>אורידין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם hplc-ms/ms

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם אבני בניין של חומצות גרעין, חלקים של cosubstrates וקואנזימים, מולקולות איתות תאים, נשאי אנרגיה, אשר מעורבים בפעילויות תאים רבות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה ואמינה להסמכה מוחלטת של תכולת נוקליאוסיד/נוקלאוטידים בצמחים. בקצרה, 100 מ"ג של חומר צמחי הומוגני הוצא עם 1 מ"ל של חיץ מיצוי (מתנול, אצטוניטריל, ומים ביחס של 2:2:1). מאוחר יותר, המדגם התרכז חמש פעמים במייבש הקפאה ולאחר מכן הוזרק לתוך HPLC-MS / MS. נוקלאוטידים הופרדו על עמוד פחמן גרפי נקבובי (PGC) ונוקליאוסידים הופרדו בעמודה C18. המעברים ההמוניים של כל גרעין ונוקלאוטידים היו במעקב על ידי ספקטרומטריית מסה. התוכן של הנוקלאוזידים והנוקלאוטידים התכמת כנגד הסטנדרטים החיצוניים שלהם (ESTDs). לפיכך, בשיטה זו יכולים החוקרים לכמת בקלות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים שונים.

כאן, אנו מראים את הזיהוי וכימות של N1- מתילאדנוזין, נוקליאוסיד שונה ידוע, בסוג פראי Arabidopsis בן שבועיים (Col-0) שתילים כדוגמה. פרופיל ספקטרומטריית מסה מציין כי יוני המוצר הנוצרים מתקן N1-methyladenosine הם 150 m/z ו- 133 m/z (איור 2A),ואותו פרופיל נצפה גם בחילוץ Col-0 (איור 2B). בשל שפע גבוה של יון המוצר של 150 m/z, המעבר ההמוני של 282.1 עד 150 (m/z) נבחר לכימות N1-methyladenosine. בנו...

שיטה מדויקת הניתנת לשחזור לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים מתוארת כאן. שיטה זו משתמשת ב- HPLC-MS/MS.

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

נוקלאוזידים ונוקלאוטידים הם מרכיבים מטבוליים מרכזיים בכל האורגניזמים החיים. חילוף החומרים שלהם נדרש להתפתחות תאים. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה לכימות של מטבוליטים אלה.שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של נוקלאוזידים ונוקלאוטידים בצמחים. טיפולים מקדימים מדגם מלא וניתוחים LC-MS/MS לקחת בערך יומיים עבור קבוצה של 10 עד 20 דגימות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל הצמחים ואפילו אורגניזמים אחרים.מי שידגים את ההליך יהיה צ'אנגואה ז'ו, פרופסור חבר ממעבדת חן. כדי לגדל את הצמחים, להבטיח כי זרעי Arabidopsis מעוקרים ב 70% אתנול במשך 10 דקות וזרע על צלחות אגר עם 1/2 כוח Murashige וחומרים מזינים Skoog. דגירה הצלחות בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ואז להעביר אותם לתא צמיחה מבוקר תחת 16 שעות של אור ב 22 מעלות צלזיוס ושמונה שעות של כהה ב 20 מעלות צלזיוס.לקצור 100 מיליגרם של שתילים שבועיים להקפיא אותם חנקן נוזלי עבור מיצוי מטבוליט. טוחנים 100 מיליגרם של רקמות צמחיות קפואות עם שבעה עד שמונה חרוזי פלדה בטחנת מיקסר מקוררת מראש במשך חמש דקות בתדר של 60 הרץ. הכינו את פתרון החילוץ, המכיל מתנול, אצטוניטריל ומים ביחס של שניים לשניים לאחד.Resuspend את החומרים הומוגנית עם מיליליטר אחד של פתרון החילוץ. צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך ב 12, 000 XG במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר 0.5 מיליליטר של ההשעיה לצינור חדש 1.5 מיליליטר להקפיא אותו חנקן נוזלי. מאדים את הדגימה הקפואה במייבש הקפאה ומנצלים אותה מחדש ב-0.5 מיליליטר של 5% אצטוניטריל ו-95% מים.צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך ב 4, 000 XG במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. טען את הבקבוקון לבקבוקון למדידת LC-MS/MS. הכן חיץ אצטט אמוניום 10 מילימולאר על ידי המסת 1.5 גרם של אמוניום אצטט בשני ליטרים של מים כפולים deionized.כוונן את ה- pH ל- 9.5 עם 10% אמוניום וחומצת אצטט. הכן שני ליטרים של אולטרה-סגול 100% מתנול למדידת נוקלאוזידים, ולאחר מכן הכן שני ליטרים של אצטוניטריל אולטרה-סגול למדידת נוקלאוטידים. להזריק 0.02 מיליליטר של מיצוי מטבוליט pretreated של כל מדגם שהוכן בעבר לתוך מערכת HPLC עם משאבות בינאריות בשילוב עם ספקטרומטר מסה מרובע משולש.כדי ליצור את עקומות הכיול הסטנדרטיות, מאגר שש עקירות מדגם יחד מערבולת התערובת, ואז aliquot אותו לשש עקירות שוב כדי להשיג כל רקע. הוסף שישה ריכוזים שונים של כל תקן אלה שש עקירות בהתאמה להזריק אותם אחד אחד לתוך מערכת HPLC. רשום את אזורי השיא של כל תקן בריכוזים שונים באמצעות המעברים ההמוניים.פרוטוקול זה שימש כדי לזהות ולכמת N1-מתילאדנוזין, נוקליאוסיד שונה ידוע, בשתילים מסוג בר Arabidopsis בן שבועיים. פרופיל ספקטרומטריית המסה הצביע על כך שיוני המוצרים הנוצרים מתקן N1-מתילאדנוזין הם ביחסי 150 ו- 133 MZ. ואותו פרופיל נצפה בחילוץ אפס קולומביה.בשל השפע הגבוה של יון המוצר של 150 MZ, המעבר ההמוני של 282.1 ל 150 נבחר לזיהוי N1-methyladenosine. זמן השמירה של שיא היעד היה 7.05 דקות. זהה לזמן השמירה של תקן N1-methyladenosine.סדרת ריכוז של תקני N1-methyladenosine נוספה לתוך שש עקירות מדגם. הדגימות הסטנדרטיות הוזרקו לתוך LC-MS / MS ואזורי השיא המוגברים של N1-methyladenosine זוממים נגד הריכוזים הנומינליים של הסטנדרטים. שש עקירות הרקע השוות חשובות ליצירת עקומת כיול מדויקת וחוזרת לכימות.השיטה שלנו ניתן ליישם לחקור מסלולים מטבוליים בצמחים. על ידי השוואת פרופילי חילוף החומרים בין מוטנטים מסוג פראי ואובדן תפקוד, השטף המטבולי יכול להימשך.

plant-sample-preparation-for-nucleosidenucleotide-content-measurement

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כימית biomimetic הרדיקלי מבוססת הוחלה ספריות בניין עד נחוצות לפיתוח סמן ביולוגי.

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

ביומסה במפעל מציע משאב מתחדש למספר רב של מוצרים, כוללים דלק, מזון, מזון ומגוון רחב של חומרים. במאמר זה אנו לחקור את המאפיינים של עץ טבק (Nicotiana glauca) ומקורות מתאימים כמו צפצפה לצינור biorefinery.

תמליל והמטבוליט Profiling להערכת של טבק ועץ צפצפה כחומר גלם לתעשייה המבוססת על ביו

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה קלה וניתנת לשחזור המשתמשת בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך (RP-HPLC) כדי למדוד את חילוף החומרים של פורין על תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) שגודלו בתנאים שונים.

HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

כאן, אנו מציגים עבור טיהור יעיל צעד בודד של האדם לא מתויגות הפעיל פרוטוקול 10-11 טרנסלוקציה-2 (TET2) dioxygenase 5-methylcytosine באמצעות יונים כרומטוגרפיה ואת וזמינותו שלה באמצעות מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS/MS)-המבוסס על הגישה.

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת ריצוף מבוססת LC-MS שיכולה לשמש כשיטה ישירה לרצף RNA קצר (&lt;35 nt לריצה) ללא ביניים cDNA, וכשיטה כללית לרצף שינויים שונים בנוקלאוטידים במחקר יחיד בדיוק של בסיס יחיד.

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

בפרוטוקול זה אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת, המשלבת הכנת דגימות יעילה ומהירה של דגימות רבות. בנוסף, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להפחתת וריאציות אנליטיות להערכת תפוקה גבוהה של מחקרי GWAS מטבוליים.

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

שינויים לאחר שעתוק של רנ"א מייצגים שכבה לא מבוקרת של ויסות תרגום שנקשרה לאחרונה לפלסטיות של מערכת העצבים המרכזית. כאן, הכנת דגימות וגישת ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית-טנדם נוזלית מתוארת לאפיון סימולטני של שינויי RNA רבים בתאי עצב בודדים.

אפיון שינויי RNA בתאי עצב בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה

למד כיצד לכמת נוקלאוזידים ונוקלאוטידים בצמחים בדיוק ובמהירות באמצעות HPLC-MS/MS. השיטה מאפשרת עיבוד של 10–20 דגימות ביומיים ומתאימה למגוון רחב של אורגניזמים.

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

גלה סרטונים נוספים