ספרואידים לב כמו במבחנה ביו מהונדסת רקמות לב לחקור פתופיזיולוגיה לב אנושי
23 בינואר 2021
פרוטוקול זה נועד להמציא כדורי לב תלת-מיוד (CSs) על-ידי שיתוף תאים בטיפות תלויות. CSs משובץ קולגן מטופלים עם דוקסוקובין (DOX, סוכן קרדיוקסי) בריכוזים פיזיולוגיים כדי מודל אי ספיקת לב. במבחנה בדיקות באמצעות CSS שטופלו DOX עשוי לשמש כדי לזהות טיפולים חדשניים עבור חולי אי ספיקת לב.
אחד האתגרים העיקריים בהנדסת רקמת לב אנושית כולל כלי הדם שלה. המעבדה שלנו פיתחה מודל במבחנה של הלב האנושי על ידי שיתוף culturing תאים נמצאו vivo. אלה כוללים מיוציטים לבביים, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל לבביים.
בסך הכל, תאים אלה מאפשרים את סיכום המיקרו-וירוס של הלב האנושי, כולל הרכיבים המולקולריים, התאיים והתאיים הנוספים שלו. אנחנו משתמשים בהם במעבדה שלנו כדי לבדוק תרופות שונות לחיבורים רעילים לסמים. אלה כוללים טוקסורוביצין, תרופה קרדיוטוקסית ידועה המשפיעה על הלבבות האנושיים גם שנים לאחר הטיפול שלה.
אנו מתרבים פיברובלסטים לבביים, תאי אנדותל ומיוציטים בנפרד לפני יצירת כדוריות. על מנת לגדל קרדיומיוציטים, אנו אוספים את הבקבוקון ממינוס 80 מעלות ואנחנו מחממים אותו ב 37 מעלות במשך ארבע דקות באמבט מים. לאחר מכן אנו מרססים את בקבוקון ההקפאה עם 70% אתנול ומעבירים אותו לארון בטיחות ביולוגי.
אנחנו אוספים בעדינות את ההשעיה של התא ומעבירים אותו לצינור פלקון 15 מיליליטר. אנחנו אוספים מיליליטר אחד של ציפוי טרום המלחמה בינוני, לשטוף את בקבוקון ההקפאה פעם אחת ולאחר מכן להוסיף אותו צינור פלקון 50 מיליליטר, טיפה אחת בכל פעם כל ארבע שניות. תוך כדי הוספת מדיום ציפוי, בעדינות לנער את צינור פלקון.
עם פיפטה תא, לאסוף שבעה מיליליטר של ציפוי בינוני בעדינות להוסיף אותו צינור פלקון 15 מיליליטר. לאחר שהוסיף את הנפח הסופי של ציפוי בינוני לצינור פלקון, להעביר את ההשעיה התא לבקבוקי רקמה מקודד fibronectin. לבסוף, להעביר תאים לאנקובטור.
לאחר יומיים, אנו אוספים את צלפי הרקמה מהחממה ואנחנו בודקים את התכנסות התאים מתחת למיקרוסקופ. בשלב זה, אנו מעבירים את הבקבוק לארון ביו בטיחות ואנחנו מסירים את מדיום ציפוי. אנחנו שוטפים בעדינות תאים עם אותו מדיום ציפוי מבקבוק הרקמה ארבע או חמש פעמים.
אנחנו מחליפים אותו במדיום תחזוקה טרי ומעבירים אותם לחממה למשך יום עד יומיים נוספים. ביום שבו אנו יוצרים תליות של תרבויות, אנו אוספים את כל שלושת סוגי התאים מהחרם. אנחנו שבב בתאים על ידי הסרת התקשורת.
אנחנו שוטפים אותם עם שלושה מיליליטר של PBS. ולבסוף אנחנו מוסיפים את השבבים לתאים. לאחר מכן מועברים הבקבוקים לאנקובטור, ומוגדלים עד חמש דקות.
על מנת ליצור כדורי לב, אנחנו במשותף תרבות 20, 000 תאים לכל טיפה תלויה. אלה כוללים 10, 000 קרדיומיוציטים, אלף פיברובלסטים לב ו 5, 000 תאים פנימיים לב. אלה מתורבתים במשותף בירידה תלויה 384 צלחות באר.
הם מצופים באמצעות מערכת הטיפול בנוזלים שלנו. אנחנו גם מוסיפים PBS על קירות הצד של צלחות טיפה תלויות כדי למנוע את התרבויות להתייבש באינקובטור. בזהירות להעביר את צלחת טיפה תלויה המכיל תאים לאנקובטור.
בין שלושה לארבעה ימים, ספרואיד ייוופס. אנחנו אוספים את צלחת הירידה התלויה מהחמה ואנחנו בודקים שספירואידים נוצרים בתוך כל באר. כפי שמוצג בתמונות אלה, יש לנו קבוצה של כדוריות בתוך המרכז של כל באר.
לאחר שנוצר, אנו אוספים כדוריות ומטביעים אותם בג'ל קולגן. קצה פיפטה נחתך מבפנים כדי למנוע נזק כדורי. כדורידים נאספים ומועברים לצינור פלקון 50 מיליליטר שבו הם נמשכים יחד.
אנחנו מסובבים את ההשעיה הספרואידית ב-300 ג'י לחמש דקות כדי להפריד אותם מהמדיום. אנו משתמשים כהה מוקף 96 צלחות גם כדי תמונה spheroids, התקשורת מוסרת או הוחלף עם ג'ל קולגן בצינור פלקון. נתרן הידרוקסידי מתווסף מתלי ג'ל כדורית לפני שהם מצופים בצלחת הקיר הכהה.
100 מיקרוליטר של השעיה כדורית מתווסף לתוך כל באר ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות. סמים, כולל טוקסורוביצין וסוכנים אחרים מתווספים לצלחת הכדוריד ודגירה במשך 24 שעות. למחרת, הכנו פתרון המכיל סידן AM ואתידיום הומודימר, תיוג לחיות מתחת לתאים בהתאמה.
פתרון זה מוכן בהוספת אגורה לצלחת מסנן זו. לאחר מכן, כדורי עופרת דגירה ב-37 מעלות למשך שעה. אנו משתמשים בקורא צלחות כדי למדוד את הפלואורסצנטיות של סידן AM ואת האתידידימר שלהם בצלחת.
מדידות אלה משמשות את התוכנה שלנו לביצוע ניתוח סטטיסטי. אנו מודדים את הפעילות החוזית של כדוריות שטופלו בתרופות השונות באמצעות מערכת יון אופטית. כדורידים מועברים לשלב שבין שתי אלקטרודות.
אלה מאפשרים גם לשלוט וגם למדוד את הפעילות החוזית לפי פוטנציאל שדה. בדרך זו, אנו יכולים לבדוק מתחים שונים וטווחי תדרים כדי לעורר כדוריות. ספרואיד בזמנו הוא בתמונה, והוא משמש למדידות אלה.
כדורידים שלא קיבלו טוקסורוביצין יוכלו לבנות בעקבות הגירוי החשמלי. להיפך, טוקסורוביצין שטופלו כדוריות לא יתכווץ. כדי לדמיין את צורת רשת התאים ה אנדותל בתוך כל ספרואיד, תיקנו אותם עם פתרון 4%paraformaldehyde במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
העברנו את הצלחת לשייקר שמאפשר חלחלה עדינה של הפתרון דרך הג'ל. PFA מוסר ו שטף שלוש פעמים עם פתרון PBS המכיל 0.01% תחמוצת נתרן. הבאנו התגייסות כמובן על ידי הוספת פתרון 0.02% של טריטון X ב PVSA במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
פתרון החסימה מכיל 3%BSA ב- PBC, אשר לאחר מכן מתווסף לצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. פתרון המכיל את הנוגדן העיקרי נגד CD 31. סמן אנדותל מתווסף לצלחת כי הוא דגירה לאחר מכן לילה בארבע מעלות.
למחרת, פתרון הנוגדנים העיקרי מוסר והצלחת שטף שלוש פעמים עם פתרון PBS המכיל 0.01% תחמוצת נתרן. פתרון הנוגדנים המשני המכיל גם את כתם ההקס מתווסף לצלחת שאז דגירה בן לילה בארבע מעלות. לבסוף, פתרון הנוגדנים השני מוסר והצלחת שטף שלוש פעמים עם פתרון PBS המכיל 0.01% תחמוצת נתרן.
לאחר שהייה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, ניתן לדמיין את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ הקונפוקל שלנו. רשת כלי דם נכונה היא קריטית להישרדות ותפקוד תאי הלב. כדורי לב מציגים רשת תאים אנדותל כי טוב יותר recapitulates אחד נוכח בלב האנושי לעומת תרבויות monolayer של תאי לב.
בהתחשב בתכונות הייחודיות, כדורי לב מייצגים כלים מתקדמים לבדיקות במבחנה לחקר הלב וכלי הדם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ספרואידים לבביים (CSs) בתלת-ממד באמצעות תרבית משותפת של מיוציטים לבביים, פיברובלסטים ותאי אנדותל בטיפות תלויות. ה-CSs מטופלים ב-doxorubicin כדי לדמות אי-ספיקת לב ולבחון טיפולים פוטנציאליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת רקמות לב
- בדיקת רעילות של תרופות
- מידול אי-ספיקת לב
רקע
- הנדסת רקמת לב אנושית מציבה אתגרים, ובמיוחד בכל הנוגע להיווצרות כלי דם (ווסקולריזציה).
- מודלים in vitro יכולים לשחזר את המיקרו-סביבה של הלב האנושי.
- Doxorubicin הוא סוכן קרדיוטוקסי ידוע המשפיע על תפקוד הלב.
- תרבית משותפת (Co-culturing) של סוגי תאים שונים חיונית ליצירת ספרואידים לבביים פונקציונליים.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל in vitro מהימן של רקמת לב.
- בדיקת ההשפעות של doxorubicin על ספרואידים של תאי לב.
- זיהוי טיפולים פוטנציאליים עבור חולי אי-ספיקת לב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תישבון (Co-culture) של מיוציטים לבביים, פיברובלסטים ותאים אנדותליאליים בטיפות תלויות (hanging drops).
- הטמעת ספרואידים בג'ל קולגן לצורך טיפול תרופתי.
- מדידת פלואורסצנציה להערכת חיות התאים ופעילות התכווצות.
- צביעה אימונוהיסטוכימית להדמיית רשתות אנדותליאליות בתוך הספרואידים.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של ספרואידים לבביים בעלי הרכבים תאיים מובחנים.
- טיפול בדוקסורוביצין הוביל לפגיעה בפעילות המכווצת של הספרואידים.
- בדיקות פלואורסצנציה הצביעו על רמות משתנות של חיוניות תאים לאחר הטיפול.
- רשתות אנדותליאליות הודגמו ביעילות באמצעות טכניקות של צביעה אימונוהיסטוכימית.
מסקנות
- מודל הספרואידים לבביים שפותח מהווה כלי בעל ערך למחקר של אי-ספיקת לב.
- ניתן לדמה ביעילות in vitro את ההשפעות הקרדיוטוקסיות של Doxorubicin.
- גישה זו עשויה לסייע בגילוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לאי-ספיקת לב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
ספרואידים של תאי לב מספקים מודל in vitro רלוונטי פיזיולוגית להערכת רעילות לבבית מושרית תרופות ומנגנונים פתופיזיולוגיים ברקמת לב אנושית. על ידי שחזור ההרכב הרב-תאי ומאפייני המטריצה החוץ-תאית, הם מאפשרים בניית פרופיל בטיחות ניבוי והפחתת סיכונים מנגנונית בגילוי תרופות למערכת קרדיווסקולרית. הדבר תומך בקבלת החלטות go/no-go בשלבים מוקדמים ומפחית את שיעורי הנשירה בשלבים מאוחרים עקב פגיעות לבבית בלתי צפויות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות מידול של פתופיזיולוגיה של לב אנושי בהקשר רב-תאי.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות הערכה של פעילות כיווצית וחיוניות תאית בתנאים הרלוונטיים למחלה.
- ערך ניבוי: משפר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי הדגמת תגובות תלויות-מינון לרעלים לבביים ידועים כמו doxorubicin.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור לכימות השפעות של תרכובות על כיווץ מסונכרן וחיוניות.
- ערך תפעולי: מקלה על הכנת הבדיקה באמצעות יצירה עקבית של ספרואידים בלוחות טיפות תלויות (hanging drop) ותאימות לקריאות של פלואורסצנציה ואלקטרופיזיולוגיה.
- יכולת הרחבה: תומכת בסריקה בעוצמה בינונית באמצעות פורמטים של 384 בארות בשיטת טיפות תלויות וטיפול אוטומטי בנוזלים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי מידול של השקעת מטריקס חוץ-תאי והיווצרות רשת כלי דם דמויי אנוש.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר חקירה של נתיבי רעילות לבבית, כגון עיכוב של endothelial nitric oxide synthase, כדי להבהיר את מנגנון הפעולה.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר זיהוי מוקדם של תרכובות עם פרופילי בטיחות לבבית חיוביים לפני ביצוע מחקרים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
ספרואידים לבביים משתלבים בתהליך הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, ומספקים מערכת רלוונטית לבני אדם להערכת בטיחות ויעילות קרדיווסקולרית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובתיקוף מטרות על ידי מידול של מיקרו-סביבת הלב האנושי ושינויים תפקודיים מושרי-תרופה.
- סריקה: מאפשר הערכה כמותית הדירה של השפעות תרכובות על כושר התכווצות וחיוניות באמצעות פלואורסצנציה ואלקטרופיזיולוגיה.
- אנליטיקה: מייצר קריאות רב-פרמטריות הכוללות פעילות התכווצותית, חיוניות תאים ורשתות כלי דם צבועות אימונוהיסטוכימית לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: ממדל את המטריצה החוץ-תאית ואת הווסקולריזציה של הלב האנושי, ובכך תומך ברצף אל התיקוף הפרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה, הישומה על פני מספר אינדיקציות קרדיווסקולריות ושיטות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי על ידי מידול פתופיזיולוגיה של לב אנושי עם מורכבות רב-תאית וכיווץ פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות יחסי תאים מוגדרים, יצירת טיפות תלויות והטמעה בג'ל קולגן.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של תרכובות קרדיוטוקסיות, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מועמדים מותאם סיכון על בסיס נתונים של בטיחות לב רלוונטיים לבני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיפרנציאציה של תאי גזע, טכניקות תרבית תלת-ממדיות (3D) ודימיון קונפוקלי לניתוח רשתות כלי דם.
- תלוי בפלטפורמות של טיפות תלויות (hanging drop), קוראי לוחיות פלואורסצנטיים ומערכות אופטיות יוניות למדידת כיווצות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של מקור התאים, פרוטוקולי דיפרנציאציה ותזמון היווצרות הספרואידים.
- שיקולי התאמה כוללים סוגי תאים שונים, יחסים ומרכיבי מטריקס חוץ-תאית לצורך מידול מחלות.
- מגבלות מעשיות כוללות את היעדרם של עומסים מכניים והבשלה מלאה בהשוואה לרקמת לב אנושית בוגרת טבעית.
