התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

שלום, וברוכים הבאים לארכיטקטורת המעבדה והתגובה של RNA במכון לביולוגיה מולקולרית ותאית בשטרסבורג. גידול גבישים מגובש היטב הוא צעד קריטי בכל מחקר קריסטלוגרפי. בסרטון זה, נדגים את השימוש בכלי מיקרופלואידי חדש לגידול גבישים של ביומולקולה ולקביעת המבנה בתלת-ממד שלו על-ידי עקיפת קרני רנטגן.

המכשיר המיקרופלואידי שנקרא ChipX מציג מספר יתרונות. הוא נועד למזער ולהקל על נכסי התגבשות בשיטת דיפוזיה נגדית. ההגדרה שלו קלה ומבוצעות עם חומר מעבדה סטנדרטי.

הוא גם מותאם לאפיון ישיר של גבישים הגדלים בשבב על ידי גבישת רנטגן סדרתית. ChipX מבטלת את שלבי הטיפול בגבישים וקירור ההקפאה ושומרת על האיכות המהותית של הגבישים המנותחים במקום ובטמפרטורת החדר. לצ'יפ-אקס יש פורמט של שקופית מיקרוסקופ, 7.5 על 2.5 ס"מ.

הוא מכיל שמונה ערוצים מיקרופלואידיים המשמשים כתאי התגבשות עם קטע של 80 על 18 מיקרומטר ואורך של ארבעה סנטימטרים. כניסת בצד שמאל מאפשרת הזרקה ידנית של פתרון biomolecule אשר ימלא את שמונת הערוצים עד המאגרים. פתרונות התגבשות מופקדים במאגרים אלה בצד ימין.

ההתגבשות מופעלת על ידי תופעה הנקראת דיפוזיה נגדית. כאשר הסוכן המתגבש מתפזר לתמיסת הביומולקולה ויוצר ריכוז ושיפוע רוויה סופר. תוויות ו bost לאורך הערוצים לעזור לאתר את הגבישים בקלות רבה יותר.

הגדרת שבב דורשת חמישה עד שישה מיקרוליטרים של פתרון ביומולקולה בריכוז אופייני של חמישה עד 10 מיליגרם למיליליטר. שמן פרפין מיקרוליטר אחד, חמישה מיקרוליטרים של תמיסת התגבשות לכל מאגר וסרט הדבקה. הטעינה של ChipX מתבצעת באופן ידני עם מיקרופיפט וטיפים סטנדרטיים.

פתרון מדגם כחול משמש בדוגמה זו להדמיה טובה יותר של תהליך ההזרקה. כדי למנוע דליפה, הקצה מוכנס למפרצון המדגם בניצב לשבב. מיקרוליטר אחד של שמן פרפין נטען לאחר המדגם כדי להפריד את הערוצים אחד מהשני.

לאחר מכן, כניסת הדגימה אטומה בקלטת. שמונת המאגרים נטענים בנפרד עם חמישה מיקרוליטרים של פתרון חומר מתגבש. כדי לעשות זאת, קצה פיפטה ממוקם קרוב לקצה הערוץ בזווית של כ 45 מעלות.

זה מונע היווצרות של בועת אוויר בין המדגם לבין הסוכן מתגבש. ניתן למלא מאגרים בקוקטיילים המכילים מאגרים שונים, פולימרים או מלחים וכו', לצורך הקרנה או אופטימיזציה. המאגרים אטומים בקלטת.

כפי שמודגם כאן, הגדרת שבב היא קלה ולוקח רק כמה דקות. ב-ChipX, התגבשות מתרחשת על ידי דיפוזיה נגדית. סוכנים מתגבשים שהופקדו במאגרים מפוזרים לתעלות המכילות את הביומולקולה.

זה יוצר מעברי צבע של ריכוז של רוויה סופר אשר יפעיל התגבשות. אלה הן דוגמאות של גבישים של אנזים המתקבל בתוך הערוצים. הם עשויים לגדול כדי למלא את הערוצים אשר יש חתך רוחב של 80 על ידי 80 מיקרומטר.

קריסטלים ניתנים לגילוי בקלות ב- ChipX באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית באמצעות הפלואורסצנטיות הטבעית של שאריות טריפטופן תחת אור UV, או כפי שמוצג כאן באמצעות חלבון בעל תווית פלואורסצנטית. סעיף זה מציג ניתוח טלגרפי כריס שבוצע במקור אור שוויצרי פילגרין שוויץ. השבבים יכולים להינשא לסנכרון ללא כל ציוד נוסף או טיפול מיוחד.

בואו ניכנס לאולם של מקור אור שוויצרי. אלקטרונים מסתובבים בטבעת המרכזית ויוצרים קשת רחבה של גלים אלקטרומגנטיים, כולל קרני רנטגן המנוצלות בקווי קרן שונים. וידאו זה הוקלט ב X06, שהוא קו קרן המוקדש קריסטלוגרפיה מאקרו מולקולרית.

הפרוטוקול עשוי להשתנות ממתקן synchrotron אחד לשני, אך העיקרון הכולל נשאר זהה. ChipX מותקן על מחזיק מודפס בתלת-ממד. מחזיק זה מחובר לאחר מכן למגנט של גונומטר סטנדרטי.

הניתוח הסדרתי עקבי איסוף נתונים מסדרה של גבישים גדל בשבב. רשימות של עמדות גביש הוקמו באמצעות תוויות bost לאורך ערוצי השבב. החוקרים מזיזים את השבב למרכז הגבישים בקרן הרנטגן שמסמלת את החלון הצהוב.

הליך מרכוז מהיר באמצעות קרן הרנטגן משוגר. עצירת הקרן עולה למקומו והגלאי נע לכיוון הדגימה. הקרנת הרשת מתבצעת כדי להבטיח שהקריסטל מיושר עם הקרן.

אותו הליך חוזר על עצמו לאחר סיבוב השבב ב -30 מעלות. השלב השני חשוב מכיוון שחומר השבב יוצר אפקט פרלקסה שמוביל לשינוי של מקסימום עקיפה ביחס למיקום הגביש הנצפה. ברגע שהקריסטל מרוכז בקרן, איסוף הנתונים מתחיל.

רצף זה מציג איסוף נתונים בזמן אמת. השבב מסתובב ב-30 מעלות. בינתיים, תמונות עקיפה מקבילות נאספות על ידי הגלאי.

האפיון של גביש זה הושלם. השבב מתורגם לקריסטל הבא בתעלה וכל ההליך חוזר על עצמו. יש לציין כי ניתוח זה מופעל במקום ללא טיפול ישיר בגביש ובטמפרטורת החדר.

נתונים שנאספו על סדרה של גבישים ממוזגים לאחר מכן כדי להשיג ערכת נתונים עקיפה מלאה המשמשת לחישוב מפת צפיפות אלקטרונים, המוצגת בכחול, ולבנות את המודל האטומי. ההליך המתואר בסרטון זה הוחל במסגרת האפיון המבני של האנזים שינוי tRNA. האנזים המוסיף CCA מהחיידק המותאם לקור, פלנוקוקוקוס הלוקריופילוס.

ChipX שימש כדי לגבש את האנזים על ידי דיפוזיה נגדית בנוכחות אמוניום סולפיד כסוכן מתגבש. גבישים לפירמידליים הופיעו לאורך הערוצים, לאחר כמה ימים של דגירה ב 20 מעלות צלזיוס. התיוג הפלואורסצנטי של החלבון איפשר זיהוי של גבישי חלבון ואפלייתם מגבישי מלח.

סדרה של גבישים נותחה במקום ובטמפרטורת החדר. נתוני עקיפתם מוזגו והובילו למבנה הגביש של האנזים APOE ברזולוציה של 2.5 חרדה. בנוסף, פיזור הסביבה בערוצי השבבים נוצל כדי לספק מצע לאנזים שבונה את הגבישים.

במקרה הנוכחי, אנלוגי CTP נוסף לפתרונות המאגר יומיים לפני ניתוח synchrotron. זה איפשר למתחם להתפזר ולהגיע לאתר הקטליטי של האנזים. כפי שניתן לראות במבנה הגביש של המתחם שנקבע ברזולוציה של 2.3 חרדה.

הפרוטוקול המודגם בסרטון זה ישים בדרך כלל ונבדק במגוון ביומולקולות. לסיכום ChipX הוא כלי שבב מעבדה המשלב את כל השלבים של מחקר קריסטלוגרפי ומאפשר לך לעבור מהפתרון הביו-רפואי למבנה הגביש במכשיר מיקרופלואידי ייחודי. תודה שצפיתם בסרטון הזה.

ואנו מקווים ששכנענו אותך היתרונות של שימוש ChipX כדי לגבש ולקבוע את מבנה הגביש של המועדפים שלך על ידי Biomolecule.