Name: אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: למד אפנון מולקולרי בנוירונים קורטיקליים ראשוניים באמצעות shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס. חקור כיצד calcineurin ו-CHOP משפיעים על תגובת הנוירונים לסטרס ברשתית האנדופלסמית ועל אטרופיה של נויריטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר גונזלו קוואסולו על עזרתו שלא תסולא בפז בהדמיה ולד"ר אנדראה פלגריני על התמיכה הטכנית בתרביות תאים.
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ: המכון הלאומי לבריאות, ארה"ב (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 בין UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) ומהסוכנות הלאומית של Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).

ההליכים בבעלי חיים מבוצעים על פי פרוטוקולים מאושרים של המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. אישור לביצוע המחקר ניתן על ידי ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים (CICUAL) של INIMEC-CONICET-UNC (החלטה מספרים 014/2017 B ו- 006/2017 A).
1. תרביות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של חולדות
<ol><li>הרדימו חולדות הרות מסוג E18 Wistar בתאCO2 עם תערובת של 80% CO 2/20% O2 למשך 60 שניות של חשיפה, ולאחר מכן הקריבו אותן על ידי נקע חוליות הצוואר.</li>
	<li>בצע את השלבים הבאים במכסה מנוע זרימה למינרית. לחלץ אנצפלון מן העוברים עם מלקחיים בסגנון # 3 ומספריים קפיציים קטנים ישרים וחדים (טבלה של חומרים) לתמיסת הנקס בצלחות תרבית תאים.</li>
	<li>נתחו את הרקמה תחת זכוכית מגדלת 20x, באמצעות שני מלקחיים עדינים בסגנון #5, המפרידים את קליפת המוח הקדמית מקרומי המוח. מעבירים את קליפת המוח הקדמית לצינור חרוטי של 15 מ"ל ודגרו על הרקמה עם 3-4 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%) למשך 15 דקות, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול כימי.</li>
	<li>לאחר העיכול, לדלל אותו עם 3-4mL של מדיום עיט שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS). לאחר מכן שטפו אותו 3 פעמים עם תמיסת מלח מאוזן של Hanks 2+/Mg 2+ ללא Ca 2+/Mg ו-0.1% גלוקוז בצנטריפוגה (3000 גרם למשך 5 דקות).</li>
	<li>נתק באופן מכני את הרקמה 10 פעמים על ידי צנרת למעלה ולמטה באמצעות קצה 1000 μL, ב- DMEM בתוספת 10% FCS (טבלה של חומרים). לאחר מכן צנטריפוגו את ההומוגנאט ב 100 x גרם במשך דקה אחת, לאסוף את supernatant ולהשלים את הנפח הנותר ל 1000 μL.</li>
	<li>לוחית את תרחיף התא על צלחות תרבית תאים בצפיפות של 520 תאים/מ"מ 2 עם2 מ"ל DMEM המכיל 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% תוסף חומצות אמינו חיוניות (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה עם 5% CO2 למשך שעתיים.<ol><li>הסרת חומר אורגני וציפוי פולי-ל-ליזין של צלחות תרבית תאים<ol><li>הסר את החומר האורגני על ידי הנחת חומר הזכוכית בתא תגובה והוסף 96% אלכוהול אתילי כמעט כדי לכסות את החומר. לאחר מכן הוסיפו 68% (w/v) חומצה חנקתית טיפה אחר טיפה עד שבועות חומות-ירקרקות מתחילות להופיע. ברגע שזה קורה, לכסות חלקית את המיכל ולאפשר את התגובה להמשיך עד פיצוץ מפסיק. הערה: יש להסיר את החומר האורגני מתחת לתא מיצוי גזים כדי למנוע חשיפה לגזים רעילים.</li>
			<li>לפני ציפוי פולי-ל-ליזין, יש לשטוף את הכוסות במים סטריליים מסוג Mili-Q כעשר פעמים. לאחר מכן יש לדגור על כוסות התרבית והצלחות עם פולי-L-ליזין 0.1 מיקרוגרם/μL למשך 4 שעות לפני השימוש בהם. לאחר הדגירה שוטפים את הכוסות במים סטריליים מסוג Mili-Q כעשר פעמים.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>כדי לאפשר התמיינות של תאים עצביים, החליפו את המדיום למדיום נוירו-בסיסי נטול סרום, עם תוסף ללא סרום (רשימת חומרים). שמור על תרביות ב 37 ° C עם 5% CO2 עד הטיפול.</li>
</ol>2. ייצור Lentivirus
הערה: האוליגונוקלאוטידים המכילים את הרצפים המכוונים ל-3'UTR של איזופורם CN-Aα או CHOP ועם רצפים שאינם ממוקדים (ערבול) מפורטים בטבלה 1.
<ol><li>לחישול, ערבבו שני אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים עם רצפים משלימים בכמויות מולריות שוות, באמצעות חיץ חיץ (10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).</li>
	<li>חממו בחום של 95°C למשך 2 דקות ולאחר מכן קררו לאט על ידי העברת דגימות מבלוק החום או אמבט המים לספסל בטמפרטורת החדר. לדלל את המוצר המתקבל [RNA סיכת שיער קצרה, (shRNA) עם קצוות מלוכדים] לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר, aliquot אותם ולאחסן ב -20 ° C.</li>
	<li>שכפל את החדרת ה-shRNA לווקטור lentiviral pLKO.3G, עם GFP כסמן פלואורסצנטי ירוק. לשם כך, לעכל 1 מיקרוגרם של וקטור עם אנזימי הגבלה EcoRI ו- PacI על ידי ערבוב הדברים הבאים בצינור סטרילי: 2 μL של חיץ אנזים הגבלה 10x (100 mM bis-Tris פרופאן-HCl, pH 6.5, 100 mM MgCl2, 1 מ"ג / מ"ל אלבומין בסרום בקר), 1 μL של 1 מיקרוגרם / μL pLKO.3G, 0.5 μL של 10 U/μL ECoRI, 0.5 μL של PacI (10 U/μL), ו-16 μL של מים מיוננים סטריליים.<ol><li>מערבבים בעדינות על ידי פיפט. לדגור את התגובה במשך 3-4 שעות ב 37 ° C. הערה: עיכול במהלך הלילה הוא בדרך כלל מיותר ועלול לגרום לפירוק DNA.</li>
	</ol></li>
	<li>עבור קשירה, מערבבים את הווקטור המעוכל ומכניסים ביחס מולארי של 3:1 ודגרים אותו עם T4 ligase ו ligase buffer (מסופק על ידי היצרן) במשך הלילה ב 16 ° C. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן תגובת קשירה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.</li>
	<li>התמירו תאים מוכשרים מסוג DH5α (טבלת חומרים) או זן E. coli מתאים אחר עם תגובת הקשירה כדלקמן.<ol><li>מערבבים E. coli מוכשר עם הנפח הכולל של תגובת קשירה ומצננים אותו על קרח במשך 15 דקות, מניחים אותו באמבטיה של 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואז מצננים אותו שוב על קרח למשך 15 דקות.</li>
		<li>העבר את הנפח הכולל הנתון להלם חום לצינור של 15 מ"ל והשלם את הנפח ל 1000 μL עם תווך נוזלי Luria-Bertani (LB) שנשמר בעבר ב 37 ° C. נערו את החיידקים במשך 90 דקות ב-37°C בשייקר מסלולי, בערך 330 סל"ד.</li>
		<li>צנטריפוגו אותם במהירות של 5,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C והשליכו 900 מיקרוליטר של סופר-נטנט. השתמש supernatant שנותר כדי להשעות מחדש את הכדור. יש לפזר את תרחיף החיידקים באופן שווה על צלחת LB מוצקה של אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל).</li>
		<li>יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה, ולאחר מכן לבדוק את צמיחת החיידקים. בשלב זה, החיידקים עשויים להיות מאוחסנים ב 4 ° C במשך 4-5 ימים.</li>
		<li>בחר מושבה אחת להעביר לתוך צינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל של LB נוזל בינוני אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל). יש לנער את החיידקים בטמפרטורה של 37°C בסביבות 330 סל"ד.</li>
		<li>צנטריפוגה את התרבית כדי לגלול את החיידקים ב 5,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant ולשמר את גלולת החיידקים. זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>לטהר את הפלסמיד עם ערכת טיהור DNA מכדורי חיידקים בהתאם להוראות היצרן (רשימת חומרים). חשב את ריכוז ה- DNA על ידי מדידת הספיגה ב- 260 ננומטר והכפלה בגורם הדילול, באמצעות הקשר הבא: A260 של 1.0 = 50 מיקרוגרם / מ"ל DNA טהור גדיל כפול (ds).</li>
</ol>3. זיהום Lentivirus
הערה: בצע את הליך יצירת lentivirus במכסה מנוע זרימה למינרית Class II.
<ol><li>24 שעות לפני ההדבקה, זרעו 1-5 × 106 HEK 293 תאים לתוך 100 מ"מ של צלחות תרבית בקוטר 8 מ"ל של מדיום גידול ולדגור אותם ב 37 ° C, 5% CO2 לילה.</li>
	<li>יש לערבב 14 מיקרוגרם של וקטור pKLO.3G עם תוספת ספציפית, 10.5 מיקרוגרם של פלסמיד אריזה psPAX ו-3.5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפה pMD2.G (טבלת חומרים). לדלל 45 μL של מגיב טרנספקציה פלסמיד (טבלה של חומרים) ב 700 μL של מדיה מופחתת בסרום (טבלה של חומרים) ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ערבבו את תערובת הדנ"א עם מגיב הפלסמיד המדולל, ערבבו בעדינות ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בינתיים, לשנות עבור DMEM טרי את המדיום של צלחת התרבית של HEK 293 תרביות תאים (70% confluent בזמן transfection). לאחר מכן הוסף את כל נפח תמיסת ה- DNA טיפה אחר טיפה. רוק את המנה בעדינות. אין צורך להוסיף/לשנות מדיום לאחר טרנספקציה.</li>
	<li>לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 48 שעות - 72 שעות כדי לאפשר shRNA להגיע להתמרה אופטימלית שלהם נבדק על ידי פלואורסצנטיות GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, לאסוף את המדיום עם lentivirus ולאחסן ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>סנן supernatant ויראלי עם קרום ניילון 0.45 מיקרומטר. Aliquot את זרימת דרך ב 1 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 17,000 x גרם במשך 4 שעות. השליכו את הסופרנאטנט ושמרו את הכדור. אפשר גלולה בלתי נראית להתייבש, ולאחר ייבוש, לאחסן ב - 80 ° C.<ol><li>בצע טיטרציה ויראלית על ידי ציטומטריית שטף. זרע 4 x 105 HEK 293 תאים בצלחות 24 באר לדגור ב 37 ° C במשך 24 שעות. לאחר מכן להשעות מחדש את החלקיקים הנגיפיים ב 200 μL של מדיום תרבית DMEM (טבלה של חומרים) ולהוסיף 0.05, 0.02, ו 0.005 μL לכל באר.</li>
		<li>לדגור זיהום ויראלי במשך 72 שעות, להסיר בינוני טריפסיניזציה (0.05% טריפסין, 1 מ"ל) במשך 3 דקות. הוסף 1 מ"ל DMEM בתמיסת FCS 10% וצנטריפוגה ב 500 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה פעמיים עם PBS.</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה עם 100 μL של PBS ותקן את התאים עם 100 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS. לנתח את התאים עם ציטומטר שטף ולקבוע את אחוז התאים הפלואורסצנטיים GFP. אסוף נתונים אלה כדי לחשב טיטרציה ויראלית באמצעות הנוסחה הבאה: טיטרציה ויראלית <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/61974/61974eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>4. תרביות נוירונים ראשוניות בסטרס עם הצטברות גנגליוזיד GM2 ואימונוציטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי-MAP2
<ol><li>הדביקו את תרביות תאי העצב הראשוניים בקליפת המוח (15 ימים במבחנה) באוליגונוקלאוטידים ספציפיים של shRNA המכוונים ל-3' UTR של CN-Aα או CHOP ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך יום אחד. הערה: תרביות נוירונים קליפת המוח ראשוניות של 7-8 ימים במבחנה יכולות לשמש גם אם התאים מראים צמיחה עצבית גבוהה.<ol><li>הכינו תמיסת מלאי של 500 מיקרומטר של גנגליוזיד GM2 באתנול וניקו אותה למשך שעה אחת.</li>
		<li>הוסף תמיסת ציר GM2 לצלחות התרבית בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך 16, 24 ו-48 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בתרביות מסוימות כדי להכין הומוגנט תאי לניתוח כתמים מערביים (למפרט נוגדנים, ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע את שלבים 1.4. ו-1.5. ולאחר מכן לתקן את התאים עם 4% PFA ו 120 mM סוכרוז ב PBS במשך 20 דקות ב 37 ° C, ולאחר מכן לשטוף אותו עם PBS. בצע הליך זה על קרום נגד החלקה בתא רטוב. לאחר מכן, יש להוסיף תמיסת חדירה (0.2% Triton X-100 ב-PBS) למשך 5 דקות ולשטוף עם PBS.<ol><li>יש להשתמש ב-5% BSA מדולל ב-PBS למשך 45 דקות כדי לאפשר חסימה, ולאחר מכן לדגור עם נוגדן אנטי-MAP2, מדולל 1:800 בתמיסת חסימה, ב-4°C למשך הלילה.</li>
		<li>בתום זמן הדגירה, יש לשטוף פעמיים עם PBS ולדגור עם נוגדן משני (טבלת חומרים) למשך שעה אחת. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS והרכיבו את המשקפיים על שקופיות באמצעות אמצעי הרכבה מימי (Table of Materials).</li>
	</ol></li>
</ol>5. ניתוח ניוון עצבים
<ol><li>קבל תמונות עם עדשת אוויר 20x (NA 0.8) באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD. נתח תמונות באמצעות תוספי ImageJ. לשם כך, טען את התמונה ל- ImageJ והחסר את הרקע על ידי לחיצה על תהליך | חיסור רקע.</li>
	<li>לחץ על תמונה | התאמה | סף או הקלד את המקשים הבאים: Ctrl (או Cmd) + Shift + T. חלון נפתח כדי להתאים ערכי מינימום, ומאפשר להבחין בין עקבות נתיב וסומה. לחץ על התמונה הבינארית (neurites ו somas הם בצבע לבן). בתמונה זו, השתמש בבחירה חופשית כדי למחוק סומות; אזור הסומא שנבחר הופך שוב לשחור.</li>
	<li>בחר מעקבים ולחץ על ערוך | בחירה | צור בחירה. קבל את החזר ההשקעה על ידי לחיצה על Ctrl (או Cmd) ו- T מקשים של הבחירה ושמור אותה. פתח את התמונה המקורית, ולאחר מכן לחץ על לוח מנהל החזר ההשקעה ובחר את החזר ההשקעה השייך, שהושג בעבר. לאחר מכן לחץ על התמונה המקורית.</li>
	<li>לאחר מעקב אחר החזר ההשקעה על התמונה, הקלד Ctrl (או Cmd) ו - M מקשים (נתח | מידה). חלון נפתח; העתק את הערך הממוצע (יחידות שרירותיות A.U.) כדי לעבד ניתוח סטטיסטי. הערה: כדי לקבל ערכים כמיקרומטר, לחץ על נתח | הגדר קנה מידה. חלון מוקפץ פתוח כדי להגדיר ערכים. הקפד להוסיף את קנה המידה הנכון (ניתוח | הגדר קנה מידה) בהתאם למאפייני המיקרוסקופ המשמש.</li>
</ol>

<ol><li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+PERK+kinase+domain+suggests+the+mechanism+for+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).</li>
<li>Bollo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+interacts+with+PERK+and+dephosphorylates+calnexin+to+relieve+ER+stress+in+mammals+and+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs.</a> PLoS One. 5, 11925(2010).</li>
<li>Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+beta+protects+brain+after+injury+by+activating+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response.</a> Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).</li>
<li>Harding, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+stress+response+regulates+amino+acid+metabolism+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress.</a> Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).</li>
<li>Hetz, C., Saxena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).</li>
<li>Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+effects+of+PERK+and+IRE1+signaling+on+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability.</a> PLoS One. 4, 4170(2009).</li>
<li>Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+atrophy+and+apoptosis+mediated+by+PERK+signaling+after+accumulation+of+GM2-ganglioside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).</li>
<li>Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglioside-enhanced+neurite+growth%3A+evidence+for+a+selective+induction+of+high-molecular-weight+MAP-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2.</a> The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).</li>
<li>Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+%28shRNA%29%3A+design%2C+delivery%2C+and+assessment+of+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown.</a> Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Rusnak, F., Mertz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin%3A+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcineurin: form and function.</a> Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).</li>
<li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+calcium%2C+calcineurin%2C+and+NFAT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT.</a> Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).</li>
<li>Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP+homologous+protein+%28CHOP%29+is+crucial+for+the+induction+of+caspase-11+and+the+pathogenesis+of+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מתארים מערכת ניסויית המאפשרת אפנון מולקולרי של המעבר משלב הישרדות לשלב UPR אפופטוטי במודל תאי עצב.
לצורך ניתוח נכון של ניוון עצבים, חיוני להשיג תרביות נוירונים ראשוניות עם תהליכים רבים, ארוכים ומסועפים מאוד 9,11. זה מקל על בחינת הארכת תהליך הנוירונים, ומאפשר לזהות את ההבדלים הברורים בין הטיפולים. חשוב לציין כי אם תרביות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח לאחר 7-8 ימים במבחנה כבר מראים צמיחה גבוהה של נוירוטים, ניתן להשתמש בהם כד...

לחץ רשתית אנדופלסמית (ER) מוגדר ככל הפרעה הפוגעת ביכולת קיפול החלבון באברון. הצטברות החלבונים המקופלים בתוך לומן המיון מפעילה אות מפל התמרה הנקרא תגובת חלבון מקופלת (UPR). מסלול איתות מורכב זה מתוזמר על ידי שלושה חיישני מאמץ: PERK (חלבון קינאז RNA [PKR]-like ER kinase), IRE1 (אנזים הדורש אינוסיטול 1) ו-ATF6 (גורם שעתוק מופעל 6). כולם יחד מנסים לשחזר את ההומאוסטזיס. אבל אם הלחץ נמשך, UPR בסופו של דבר גורם למוות תאי על ידי אפופטוזיס1.
PERK, חלבון טרנסממברנה של ER, על לחץ ER, מוביל את הזרחן של גורם החניכה האיקריוטי-2 אלפא (eIF2α), ומפחית את סינתזת החלבונים הגלובלית ובכך את עומס החלבונים ב- ER2. הראינו כי calcineurin A/B (CNA/B), הטרודימר Ca2+ phosphatase, קושר ישירות את התחום הציטוסולי של PERK, מגביר את הזרחן העצמי שלו ומשפר באופן משמעותי את עיכוב תרגום החלבונים ואת כדאיות התא 3,4. באופן מעניין, CNA/B נמצא בשפע במוח היונקים, ומבחין בין שני איזופורמים של תת-היחידה A של CN: α ו-β.
תחת לחץ מתמשך בחדר המיון, מסלול האיתות PERK הוא ענף ה-UPR היחיד שנותר פעיל, ובכך מתווך הן את התגובה הפרו-הישרדותית והן את התגובה האפופטוטית. בשלב הכרוני, אירוע מרכזי אחד במורד הזרם הוא השראת גורם השעתוק, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)5. לחץ כרוני בחדר מיון מוכר יותר ויותר כתורם נפוץ למגוון רחב של הפרעות פתולוגיות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות6. חשוב להבין כיצד UPR יכול להקל על איתות cytoprotective במקום מוות תאי 7. עם זאת, כיום מעט ידוע על המנגנון המדויק השולט במעבר בין שני שלבי UPR אלה.
לאחרונה מצאנו כי בתאי עצב בתרבית, גנגליוזיד GM2 מצטבר בקרומי המיון וגורם לדלדול הסידן הלומינלי. זה בתורו מפעיל איתות PERK, אשר מתווך ניוון עצבי אפופטוזיס 8. במחקר זה, הצטברות GM2 בתאי עצב בתרבית משמשת כמודל של מערכת התא של ניוון נוירוטים הנגרם על ידי לחץ ER. באופן ספציפי, שני ביטויי גורם PERK הם מניפולציה, CN-Aα ו CHOP, אשר מחליף את המעבר בין אירועים מוקדמים / מגן לשלב כרוני / אפופטוטי. כדי להשיג זאת, הגנים המתאימים מושתקים; לפיכך, תרביות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח נגועים ב-shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס. ניתוח כתמים מערביים מגלה ירידה משמעותית ברמות הביטוי של CN-Aα ו- CHOP בהשוואה לתאי הביקורת, הנגועים בלנטיוירוס הנושאים shRNA מקושקש. לאחר טיפול זה, נוירונים נתונים לזמני דגירה שונים של GM2 אקסוגני, קבוע, ומוכתמים חיסוניתעם נוגדן 2 הקשור לחלבון 2 (MAP2) 9. התמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. הגידול הכולל של תאי עצב מוערך ביחס למספר התאים הכולל.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Mouse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#R37120</td><td></td></tr><tr><td>anti-CHOP</td><td>Thermo Fisher</td># <td>MA1 - 250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CN-A&alpha;</td><td>Millipore</td> <td># 07-067</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GM2</td><td>Matreya</td> <td>#1961</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M2320</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actin</td><td>Thermo Fisher</td> <td># PA1 - 183</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#3595</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>Life Technologies</td><td>#17504944</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>#11966025</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Promega</td><td>#R6011</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>#16000044</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים &nbsp; סגנון #5</td><td>מלקחיים בסגנון דומונט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#3</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 CW נוגדן משני</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632221</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 נוגדן משני</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632220</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW נוגדן משני</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW נוגדן משני</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632211</td><td></td></tr><tr><td>lentiviral מעטפת פלסמיד pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>lentiviral אריזה פלסמיד psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>lentiviral vector pLKO.3G</td><td>Addgene</td><td>#14748</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין המיסולפט</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>#295358</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין LTX & Plus Reagent (מגיב טרנספקציה פלסמיד)</td><td>Life Technologies</td><td>#A12621</td><td></td></tr><tr><td>MISSION shRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM2</td><td>Matreya</td><td>#1502</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>#21103049</td><td></td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה 0.45 & מיקרו; m</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיית אינפרא אדום Odyssey</td><td>LI-COR Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneShot Top 10</td><td>Life Technology</td><td>#C404010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (מדיה בסרום מופחת)</td><td>Life Technologies</td><td>#105802</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>BioLabs</td><td>#R0547S</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>פפסטין A</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>#45036</td><td></td></tr><tr><td>פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>#329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P#2636</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים קטנים ישרים וחדים</td> כלי <td></td><td></td><td>מדע עדינים</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>#M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25 %</td> <td>Life Technologies</td><td>#25200056</td><td></td></tr><tr><td>מעבד נוזלי אולטראסוני Vibra-Cell (VCX 130)</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard plus SV Minipreps מערכת טיהור DNA</td><td>Promega</td><td>#A1330</td><td></td></tr></tbody></table>

אפנון מולקולרי על ידי shrna ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית

Molecular Modulation by Lentivirus-Delivered Specific shRNAs in Endoplasmic Reticulum Stressed Neurons

הצטברות של חלבונים מקופלים בתוך הרשתית האנדופלסמית (ER), הנגרמת על ידי כל מצב לחץ, מפעילה את תגובת החלבון המקופלת (UPR) באמצעות הפעלת חיישנים מיוחדים. UPR מנסה תחילה לשחזר הומאוסטזיס; אבל אם הנזק נמשך, האיתות גורם לאפופטוזיס.
ישנן ראיות הולכות וגדלות לכך שלחץ מתמשך ובלתי פתור בחדר המיון תורם למצבים פתולוגיים רבים, כולל מחלות נוירודגנרטיביות. מכיוון שה-UPR שולט בגורל התא על ידי מעבר בין תהליכים ציטופרוטגונטיים ואפופטוטיים, חיוני להבין את האירועים המגדירים את המעבר הזה, כמו גם את האלמנטים המעורבים במודולציה שלו.
לאחרונה הדגמנו כי הצטברות חריגה של גנגליוזיד GM2 גורמת לדלדול תכולת ER Ca2+ , שבתורה מפעילה את PERK (PKR-like-ER kinase), אחד מחיישני ה-UPR. יתר על כן, איתות PERK משתתף בניוון הנויריטים ובאפופטוזיס המושרה על ידי הצטברות GM2. מבחינה זו, הקמנו מערכת ניסיונית המאפשרת לנו לווסת מולקולרית את הביטוי של רכיבי PERK במורד הזרם ובכך לשנות את הפגיעות של נוירונים לעבור ניוון עצבי.
ביצענו הפלה של ביטוי calcineurin (cytoprotective) ו-CHOP (פרו-אפופטוטי) בתרביות נוירונים בקליפת המוח של חולדות. התאים נדבקו ב-shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס ולאחר מכן טופלו ב-GM2 בזמנים שונים, תוקנו והוכתמו במערכת החיסון באמצעות נוגדן אנטי-MAP2 (חלבון 2 הקשור למיקרו-צינוריות). מאוחר יותר, תמונות תאים הוקלטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וצמיחת נוירוט כוללת הוערכה באמצעות תוכנת עיבוד התמונה ImageJ הנחלת הכלל. עיכוב הביטוי של אותם רכיבי איתות PERK איפשר בבירור להאיץ או לעכב את הניוון העצבי הנגרם על ידי לחץ במיון.
גישה זו עשויה לשמש במודלים של מערכת התא של עקה בחדר מיון כדי להעריך את פגיעותם של נוירונים לניוון עצבים.

כאן, אנו מתייחסים לשאלה האם השתקת שני רכיבי PERK במורד הזרם משפיעה על שלב המעבר של UPR במודל תאי לחץ ER. כדי להשיג זאת, אנו משתיקים את הגן CN-Aα כמו גם את הגן CHOP על ידי שני רצפי shRNA ספציפיים עבור כל אחד (טבלה 1) בתרבית תאי עצב ראשונית למשך יוםאחד 10. הביטוי מנותח על-ידי כתמים מערביים (איור 1 ואיור 2). עיכוב ברור נצפה של עלייה CN-Aα ו- CHOP בתיווך לחץ ב- ER בתאי דפיקה, אך לא בתאי ביקורת (shRNA scrambl...

במחקר הנוכחי, הביטוי מופל משני מרכיבי איתות במורד הזרם של מסלול PERK, הקלצינוירין הציטופרוטקטיבי וה- CHOP הפרו-אפופטוטי, באמצעות shRNA ספציפי. בדרכים הפוכות, אלה מווסתים את הרגישות של נוירונים קליפת המוח הראשוניים לניוון עצבי לאחר השראת מתח רשתית אנדופלסמית.

אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית

The accumulation of unfolded proteins within the endoplasmic reticulum (ER), caused by any stress condition, triggers the unfolded protein response (UPR) ...

גישה זו עשויה לשמש במודלים של מערכת התא של לחץ רשתית אנדופלסמי על ידי מניפולציה של הביטוי המולקולרי של רכיבי זוג במורד הזרם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא להסיר את ההשפעה של איתות זוגי על ידי הדמיה ומדידה של מסלולים עצביים. שיטה זו יכולה לתרום להבנת הבסיס המולקולרי של המעבר בין שלבים חריפים וכרוניים של לחץ בחדר מיון במודלים שונים של מחלות נוירודגנרטיביות מלבד גנגליוזידוזיס GM2 כדי להתחיל, לנתח את הרקמה תחת זכוכית מגדלת 20X עם שני מלקחיים דקים מספר חמש, המפרידים את קליפת המוח הקדמית מן קרומי המוח.העבירו את קליפת המוח הקדמית לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ודגרו על הרקמה עם שלושה עד ארבעה מיליליטר של טריפסין EDTA למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול כימי. לאחר מכן, שטפו אותו שלוש פעמים עם תמיסת מלח מאוזנת של Hank ללא סידן מגנזיום וללא יונים ו-0.1% גלוקוז. נתק מכנית את הרקמה 10 פעמים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה באמצעות קצה 1, 000 מיקרוליטר ב- DMEM בתוספת 10% FCS.צנטריפוגה הומוגנט ב 100 גרם במשך דקה אחת, לאסוף את supernatant, ולהשלים את הנפח הנותר ב 1, 000 מיקרוליטר. צלחת את תרחיף התא על צלחות תרבית תאים בצפיפות של 520 תאים למילימטר מרובע עם שני מיליליטר של DMEM המכיל 10% FCS, 1% פניצילין סטרפטומיצין, ו 1% של תוסף חומצת אמינו חיונית. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים.כדי לאפשר התמיינות של תאים עצביים, החליפו את המדיום למדיום נוירו-בסיסי ללא סרום בתוסף ללא סרום. שמרו על תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד לטיפול. לחישול, ערבבו שני אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים עם רצפים משלימים בכמויות טוחנות שוות.מחממים בחום של 95 מעלות למשך שתי דקות. מעבירים את הדגימות מבלוק החום ומדללים את המוצר המתקבל לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולרית. כדי לשכפל את shRNA להכניס לתוך pLKO וקטור lentiviral.3G, לעכל מיקרוגרם אחד של הווקטור עם אנזימי הגבלה EcoR1 ו-PAC1. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג ודגרים על התגובה במשך שלוש עד ארבע שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לקשירה, מערבבים את הווקטור המעוכל ומכניסים אותו ביחס מולארי של 3:1.לדגור אותו עם T4 ליגאז ו ligase buffer במשך הלילה ב 16 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערבבו את רכיב E.coli עם הנפח הכולל של תגובת הקשירה וצננו אותו על קרח במשך 15 דקות. הכניסו אותו לאמבטיה של 42 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות ואז צננו אותו שוב על קרח למשך 15 דקות.העבר את הנפח הכולל הנתון להלם חום לצינור של 15 מיליליטר והשלם את הנפח ל -1, 000 מיקרוליטר עם Luria-Bertani, או L-B מדיום נוזלי. נערו את החיידקים במשך 90 דקות של 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי, בערך 330 סל"ד. צנטריפוגה שפגשה 5, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.השליכו 900 מיקרוליטר של הסופרנאטנט והשתמשו בסופרנאטנט שנותר כדי להשהות מחדש את הכדור. מפזרים את תרחיף החיידקים באופן שווה על צלחת אמפיצילין L-B מוצקה ודגרים במשך 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בחר מושבה אחת להעביר לתוך צינור 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר של L-B נוזל בינוני אמפיצילין.נערו את החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס בערך 330 סל"ד וצנטריפוגה את התרבית כדי לגלול את החיידקים ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, משמרים את כדורית החיידקים במינוס 20 מעלות צלזיוס. 24 שעות לפני ההעברה, זרעו 1 עד 5 מיליון תאי HEK-293 לתוך צלחות תרבית של 100 מילימטר.מערבבים 14 מיקרוגרם של pKLO. וקטור דור 3 עם תוספת ספציפית, 10.5 מיקרוגרם של פלסמיד אריזה psPAX, ו 3.5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפה pMD2. G.לדלל 45 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה פלסמיד ב 700 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן ערבבו את תערובת הדנ"א עם מגיב הטרנספקציה של פלסמיד מדולל, ערבבו בעדינות ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שנה את המדיום של צלחת התרבית של תאי HEK-293 עם מדיום טרי לאחר transfection ולהוסיף את כל נפח תמיסת ה- DNA טיפה אחר טיפה. נענעו את התבשיל בעדינות ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 48 עד 72 שעות כדי לאפשר ל-shRNA להגיע להתמרה האופטימלית שלהם.לאסוף את המדיום עם lentivirus ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס. מסננים את הסופרנאטנט הנגיפי עם קרום ניילון באורך 0.45 מיקרומטר ויוצרים מילימטר אחד מהזרימה. צנטריפוגה ב 17, 000 G במשך ארבע שעות.השליכו את הסופרנאטנט ושמרו את הכדור. הניחו לגלולה הבלתי נראית להתייבש, ולאחר הייבוש, אחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הדביקו את תרביות תאי העצב הראשוניים בקליפת המוח באוליגונוקלאוטידים ספציפיים של shRNA, תוך התמקדות בשלושת ה-UTR הראשוניים של קלצינוירין A-אלפא או CHOP ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך יום אחד.לאחר מכן, הוסף תמיסת מלאי GM2 למדיום של צלחת התרבית בריכוז סופי של שני מיקרומולרים ודגר ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 16, 24, ו 48 שעות. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde ו 120-millimolar סוכרוז ב PBS במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS. מוסיפים תמיסת חלחול למשך חמש דקות ושוטפים עם PBS.השתמש 5% BSA מדולל PBS במשך 45 דקות כדי לאפשר חסימה. לאחר מכן, לדגור עם נוגדן אנטי MAP2 בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS בסוף זמן הדגירה, לדגור עם נוגדן משני במשך שעה אחת.הרכיבו את הכוסות לאחר שטיפת התאים עם PBS. לאחר קבלת התמונות במיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי, טען את התמונה כדי לקבל ImageJ והחסר את הרקע על ידי לחיצה על תהליך ואחריו החסר רקע. לחץ על תמונה, התאמה, סף כדי להתאים ערכי מינימום, ומאפשר להבחין בין נתיב וכמה עקיבה.מחק סומות באמצעות הבחירה ביד חופשית. בחר עקבות ולחץ על ערוך, בחירה, צור בחירה. קבל את החזר ההשקעה על ידי לחיצה על מקשי הבקרה וה- T של הבחירה ושמור עליה.פתח את התמונה המקורית. לחץ על לוח ROI Manager ובחר את החזר ההשקעה המתחיל. לאחר מכן לחץ על התמונה המקורית.לאחר מעקב אחר החזר ההשקעה על התמונה, לחץ על המקשים control ו- M כדי לעבד את הניתוח הסטטיסטי. נעשה כאן ניסיון לבדוק האם השתקת רכיבים 2pERK במורד הזרם משפיעה על שלב המעבר של תגובת החלבון שנפרש במודל תאי הלחץ של ER. הגן calcineurin A-alpha וגן CHOP הושתקו על ידי שני רצפי shRNA ספציפיים בתרבית תא נוירון ראשונית ליום אחד.הביטוי מנותח על ידי כתם מערבי. עיכוב ברור נצפה של עלייה ברמת הקלצינוירין A-alpha ו- CHOP בתיווך מתח בתאי הדחקה. הקשר האפשרי של לחץ ER הנגרם על ידי הצטברות GM2 עם ניוון עצבי נבדק על ידי ביצוע MAP2 immunostaining של תרביות עצביות ראשוניות.ניוון עצבים עולה באופן משמעותי לאחר גרימת לחץ בחדר מיון על ידי דגירה של GM2 לאחר 16 עד 48 שעות. השתקה של ביטוי קלצינוירין A-אלפא מגבירה באופן משמעותי את ניוון הנוירוטים, במיוחד לאחר 16 שעות של הצטברות GM2 ביחס לקבוצות GM2 שלא טופלו. לפיכך, calcineurin A-alpha knockdown האיץ את תהליך הניוון בנוירונים, ואישש את ההשפעה הפרו-הישרדותית של calcineurin במהלך השלב המוקדם של תגובת חלבון פתוח.לעומת זאת, הפלה של CHOP הביאה לירידה משמעותית בניוון הנוריט ביחס לבקרות בדיוק לאחר 16 עד 24 שעות. פרוטוקול התא עם תרבית התאים הראשונית המתאימה וקבלת 90 או אחוז גבוה יותר של תאים נגועים בלנטיוירוס המתאים. מכיוון שאובדן האקסון הטרמינלי העצבי הוא הצעד הראשון שאנו מציגים בתהליך שלנו, ניתן גם להעריך זאת על ידי ביצוע בדיקה.טכניקה זו מאפשרת לקבוצה שלנו ולאחרים להעריך מולקולות מסוימות ככלים טיפוליים פוטנציאליים.

molecular-modulation-lentivirus-delivered-specific-shrnas-endoplasmic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף...

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת...

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

מקור: Tagliafierro, L., et al. פלטפורמת וקטור לנטי-ויראלית לאספקה יעילה של כלים לעריכת אפיגנום למודלים של מחלות שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההתמרה הלנטיוויראלית של תאי אב עצביים (NPCs) לשינוי אפיגנטי ממוקד של אלפא-סינוקלאין, חלבון מפתח במחלת פרקינסון. הפרוטוקול מאפשר מתילציה של DNA בתיווך מתילטרנספראז, ומפחית את ביטוי SNCA לחקר ויסות גנים והתערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

התמרה לנטי-ויראלית של תאי אב עצביים לוויסות אפיגנטי של ביטוי אלפא-סינוקלאין

מקור: Bender, H. R., et.al. אספקת siRNA טיפולי למערכת העצבים המרכזית באמצעות ליפוזומים קטיוניים ואניונים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את האספקה הממוקדת של siRNA של חלבון פריון (PrP) לנוירונים באמצעות קומפלקסים ליפוזומליים של siRNA-פפטיד (LSPCs). ליפוזומים קטיוניים קושרים אלקטרוסטטית siRNA מכוון PrP, אשר מיוצב עוד יותר על ידי פפטיד RVG-9r להובלה מתווכת קולטנים על פני מחסום הדם-מוח. ברגע שהם נכנסים למוח, LSPCs עוברים אנדוציטוזיס בנוירונים, משחררים siRNA כדי ליזום הפרעות RNA, מפחיתים את...

אספקת siRNA ממוקדת לתאי עצב להשתקת חלבון פריון באמצעות קומפלקסים ליפוזומליים

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך...

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

הזרקת stereotactic של lentiviruses להביע cDNAs או shRNAs יכול לווסת ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח של עכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשלב זריקות stereotactic עם משימות התנהגותיות, כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST).

יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה על כיצד לשלב מלאכותי בתיווך microRNA RNA הפרעה optogenetics לעורר במיוחד presynaptic עם העיתון ons עם ביטוי מופחתת של gene (s) סלקטיבי בתוך מעגלים עצביים ללא פגע.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.

מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1

אטקסיות של פוליגלוטמין ספינוצרבלריות נגרמות על ידי התפשטות CAG המייצרת חלבונים המועדים להצטברות. פרוטוקול זה מתאר ייצור וקטורים, מסירה סטריאוטקסית וניתוח הכללות ואובדן סמנים נוירונים, ומספק פלטפורמה מבוקרת לחקר מנגנונים ולהערכת טיפולים ממוקדים למחלות ניווניות עצביות.

פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין

למד אפנון מולקולרי בנוירונים קורטיקליים ראשוניים באמצעות shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס. חקור כיצד calcineurin ו-CHOP משפיעים על תגובת הנוירונים לסטרס ברשתית האנדופלסמית ועל אטרופיה של נויריטים.

אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית

גלה סרטונים נוספים