הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין פרוסות חריפות בריאות מאזור ביניים הגבי של ההיפוקמפוס להקלטות ארוכות טווח ושחזור של נוירונים בעכברים בוגרים. מעבדות רבות כמו שלנו, לומדות היפוקמפוס הגבי על תפקידו בלמידה וניווט מיוחדים. טכניקות נפוצות המשמשות למטרה זו הן ניסויים התנהגותיים, מעקב אנטומי ומניפולציות ספציפיות אזוריות.

פיתחנו שיטה לחתיכות מוח לשילוב אלקטרופיזיולוגיה עם טכניקות אלה כדי לאפשר מתאם ישיר של invivodata בתוך הקלטות וידאו. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא משלב הליך פשוט כדי להשיג פרוסות רוחביות עם השימוש בהגנה על הפתרון כדי לשפר את הכדאיות של רקמת המוח. גישה זו מתאימה במיוחד כאשר בעלי חיים בוגרים משמשים כמו בניסויים התנהגותיים.

כדי להתחיל בהליך זה, הכן ליד הכיור את הציוד הדרוש עבור סעיף זה. מכינים על הקרח 150 מיליליטר ושתי צלחות פטרי זכוכית בקוטר 10 סמ כל אחת. מציירים שלושה חלקים מהקווים עד לתחתית צלחת פטרי מפלסטיק וממקם את המנה קרוב למגש הקרח.

תצטרך גם דבק ומחזיק הדגימה עבור הוויברטום. לאחר מכן ציידו את ספסל הניתוח במספריים גדולים, מספריים קטנים, פינצטה מעוגלת, פינצטה עדינה, מרית מתכת דקה, מרית מתכת גדולה ופיפטות העברה. מקלפים את מנות הפטרי בתמיסת חיתוך.

מנה אחת לבצע את הניתוח של הראש והשני לניתוח של המוח. באחרון, גם למקם פיסת נייר מסנן. גם למלא את הכוויה עם פתרון חיתוך 30 מיליליטר.

זה יהיה נחוץ עבור זלוף טרנסקרדיאלי. מלאו את מגש הרטט בתמיסת חיתוך קר כקרח ושמרו על כל התמיסה מחומצן עם מכשיר מבעבע פחמימן. מוסיפים את הקרח הכתוש העשוי מהאצווה הקפואה של פתרון החיתוך לתמיסת החתך הטרי הקר כדי לשמור על הטמפרטורה כלפי מטה.

שים לב, כדי לשמור על הקרח מהלהב תוך כדי החתכה. כמעט כל השלבים לאחר הקפיטציה מבוצעים בתוך הפתרונות. זה עוזר לשמור על חוסר חמצן חילוף החומרים למינימום.

הכינו תא דגירה מלא בתמיסת חיתוך תחת חמצון מתמיד. מניחים את התא באמבט מים מחומם מראש ב 35 מעלות צלזיוס. הכינו תא אחסון לפרוסות עם מספר בארות עצמאיות ומלאו אותו בפתרון אחסון.

שמור את זה תחת חמצון מתמיד בטמפרטורת החדר. במקרה הרקמה מבטאת חלבון פלואורסצנטי או אופונין מופעל אור. מומלץ להשאיר את התא בחושך.

לדוגמה, בתוך הקופסה. לאחר ביצוע זלוף Transcardial, מניחים את ראש העכבר לתוך צלחת פטרי עם פתרון חיתוך קר כקרח. פתח את העור עם מספריים עדינים כדי לחשוף את הגולגולת.

החל מגנום הקדמי, לחתוך לאורך תפר sagittal עד להגיע לתפר האף. היזהר מעט למשוך את המספריים כדי למנוע נזק של המוח. לעשות שני חתכים לרוחב לבסיס הגולגולת.

השתמש בפינצטה קצה מעוגל למשוך את העצמות הקודקודיות. היזהר גם להסיר את קרום הקומנדו. אם נשאר הם יכולים לגרום נזק למוח במהלך החילוץ.

השתמש מרית קטנה בעדינות לשחרר את המוח מבסיס הגולגולת. בעזרת מרית קטנה, נתק את המוח מעצבי הגולגולת והעבר את המוח לפיסת נייר סינון קטנה בצלחת הפטרי השנייה. חותכים את המוח בחצאים לאורך סדק האורך באמצעות להב מצונן מראש.

הפרד בין שתי ההמיספרות באמצעות המרית הקטנה ביותר. השתמש במרית הגדולה ביותר כדי להעביר חצי כדור אחד לצלחת פטרי פלסטיק עם פני השטח המדיאלי שלה פונה כלפי מטה. יישר את קליפת המוח הקודקודית עם אחד הקווים המקבילים כדי לקבל הפניה לחיתוך השני.

השתמש בפיסת נייר סינון כדי לייבש פתרון עודף. מקם את הלהב במקביל לקווים וחתך את החלק הגחוני של חצי הכדור. משטח שטוח זה יודבק מאוחר יותר על מחזיק הדגימה.

להחזיר את חצי הכדור לתוך פתרון כותנה מחומצן של צלחת פטרי זכוכית ולבצע את אותו הליך בחצי הכדור השני. מניחים טיפה של דבק ציאנואקרילאט על מחזיק הדגימה vibratome ולהפיץ אותו עם מרית כדי ליצור שכבה דקה. מעבירים את ההמיספרה למחזיק הוויברטום כשצד הגחון כלפי מטה באמצעות הצד העגול של המרית.

התחלת ההחתכה הזו מקליפת המוח הקודקודית תפחית את הזמן הנדרש לאיסוף אזור הגב של ההיפוקמפוס. הוסף כמה טיפות של פתרון חיתוך קר כדי לחזק את הדבק. מעבירים את מחזיק הדגימה למגש הוויברטום ועם ההגדרות המתאימות, פורסים את המוח עד שהאזור של ההיפוקמפוס הגבי נראה לעין.

לאחר מכן, לאסוף את הפרוסות עם השימוש פיפטה העברת פלסטיק. מעבירים כל פרוסה לתא הדגירה ומניחים לה לנוח במשך 12 דקות. בינתיים, להמשיך עם חיתוך הפרוסות הבאות.

לאחר 12 דקות הדגירה, מעבירים את הפרוסות לתא האחסון. ותן לו לנוח עד תחילת הניסוי. כדי להדגים את טוהר ההכנה שלנו, אנו משווים אותו להכנת קורנל אשר משמש בדרך כלל כדי להקליט מן ההיפוקמפוס הגבי.

המוצגים כאן הם, מיקרוגרף ניגוד הפרעה דיפרנציאלי שנרכש מהלהב העליון של gyrus שקע בפרוסות חריפות מעכברים בני חודשיים. בפרוסה רוחבית הנוירונים הראו בעיקר משטחים חלקים ורק גבולות מנוגדים סבירים, המצוין על ידי חצים שחורים. נוירונים בפרוסות Coronal עם זאת הופיעו לעתים קרובות כמובן והציג קווי מתאר מנוגדים מאוד, מסומן על ידי חצים לבנים.

זה מרמז על כדאיות טובה יותר של נוירונים בפרוסה רוחבית. בהתאם להתרשמות זו, הזמן הממוצע לאטום היווצרות במהלך תיקון בפרוסות החודרות שלנו היה מהיר משמעותית מאשר בפרוסות הקורונל. כמו פרוקסי כללי עבור שלמות התא, אנו מתעדים כי פוטנציאל קרום מנוחה של תאי גרנול ו parvalbumin חיובי בין נוירונים אשר שבו באופן משמעותי יותר depolarize בשני סוגי התאים בקורונל לעומת פרוסות רוחביות.

מה שבסופו של דבר הביא באופן משמעותי יותר תאים שהיו צריכים להיות מודרים בהכנה לקורונה. כמו אקסונים תא גרנול לרוץ במישור רוחבי, שחזור של תאים מוקלטים הביא אחזור של ארבור אקסון מלא בהכנה שלנו. זה לא היה המקרה בפרוסות קורנל שבהן האקסונים אולי נותק בקלות.

בנוסף, השחזור המורפולוגי של נוירונים בין-תאיים חיוביים parvalbumin בפרוסות רוחביות אפשר תיאור של ארבור אקסונלי ודנדריטי נרחב, כולל הדמיה של פרטים קטנים, כגון קוצים דנדריטיים. מעל הכל, הצגנו שיטות חתך כדי להשיג פרוסות היפוקמפוס רוחבי עם כדאיות עצבית גבוהה עבור עכברים בוגרים. שיטה זו יכולה לשמש למדידת חקירה אלקטרופיזיולוגית במבחנה עם מחקרים אנטומיים והתנהגותיים המתמקדים בחלק הגבי הבינוני של ההיפוקמפוס.