Name: תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: למד תרבית רקמה תלת-ממדית של זנב זברהפיש לחקר פילוח בעלי חוליות. שיטה זו מאפשרת הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה ומניפולציה של מקורות מורפוגנים בפיתוח עוברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למתקן הליבה של AECOM Zebrafish ולשירותים הווטרינריים לילדים בסינסינטי על תחזוקת הדגים, ליבת ההדמיה לילדים בסינסינטי על הסיוע הטכני, דידר ספירוב על הסיוע בהפקת וידאו וחנה סיוול על עריכת כתב היד. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R35GM140805 כדי E.M.Ö. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

פרוטוקול זה כרוך בשימוש בעוברים חיים של בעלי חוליות מתחת ליום אחד לאחר ההפריה. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת ההנחיות האתיות של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי; פרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול מס' 2017-0048).
1. אוסף עוברים
<ol><li>הקים זוגות של דגי זברה במכלים חוצים בלילה שלפני יום איסוף העוברים. לשליטה מדויקת בהתפתחות העובר, השתמשו במחסומים בין זוגות הזדווגות.</li>
	<li>להעלות מחסומים לפני זמן ההשרצה המועדף ולאסוף ביצים בתוך 15 דקות בצלחת פטרי 100 מ"מ.<ol>
<li>פסולת נקייה מצלחת פטרי. אם נאספים יותר מ-50 עוברים ממצמד אחד, פצלו את המצמד למספר מנות פטרי בהתאם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה עוברים במים מערכת דגים ב 28 °C (69 °F) עד שהם מגיעים 50% שלב epiboly (5 שעות לאחר ההפריה). מדיום צמיחת עובר סטנדרטי כגון E3 יכול לשמש גם במקום מים מערכת האקווריום עד שלב 3.2.<ol>
<li>מוציאים ביצים לא מופרות תחת סטריאוסקופ ומעבירים את העוברים לאינקובטור של 23°C למשך הלילה (O/N). העוברים צריכים להיות בשלב 8-10 סומיטי בבוקר שלאחר יום האיסוף.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת כלי
<ol><li>לעקר את להב סכין מיקרוכירורגיה, טיפים מחט (המשמש לניתוח של הרקמה), וזכוכית פסטר פיפטה על ידי השרייה 100% אתנול (EtOH) זיגוג אש.</li>
	<li>השתמש בשתי שכבות של סרט שקופה (~ 100-120 מיקרומטר עובי) על שקופיות מיקרוסקופ 25 מ"מ x 75 מ"מ. חותכים ~ 18 מ"מ x 18 מ"מ בארות מרובעות במרכז הסרט של כל שקופית מכסה עם אזמל.<ol>
<li>נגב את תאי השקופיות המוכנים עם 70% EtOH. בארות אלה יחזיקו ~ 40 μL של בינוני.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנה לדוגמה
<ol><li>עוברי Dechorionate באמצעות קצה של שני מזרקים מחט תחת סטריאוסקופ. מעבירים עוברים לצלחת פטרי נפרדת עם מי מערכת דגים לשטוף.</li>
	<li>באמצעות פיפטה פסטר זכוכית סטרילית מזוגגת באש, להעביר עוברים בצלחת פטרי 6 ס"מ המכיל מדיום ניתוח (ליוביץ-15 תא תרבות בינונית עם L-גלוטמין ללא פנול אדום, 0.8 mM CaCl2 ו 1× פתרון אנטיביוטי אנטי מיקוטי). הערה: המשך להשתמש פיפטה זכוכית מעוקרת עבור כל ההעברות בעקבות שלב זה.<ol>
<li>השתמש צלחת פטרי עבור הליך הסברה כדי למנוע שבבי פוליסטירן במהלך ניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>שים 50 μL של רקמות צמיחה בינונית (מדיום ניתוח, ו 10% FBS) בתא השקופית.</li>
	<li>לייצב עובר לניתוח מתחת לסטריאוסקופ עם קצה מחט בצומת רקמת החלמון ליד hindbrain.</li>
	<li>שמירה על יציבות הרקמה העוברית באמצעות מחט, השתמש בסכין המיקרו-כירורגית עם הלהב המוחזק ב- 45° כדי לחתוך את הרקמה לפני השטח האחורי ולקלף את החלמון מהרקמה העוברית החל מהחדר הראשי ונע לעבר ניצן הזנב(איור 1A). הערה: היזהר לא לאבד את רקמת העור בעת ניקוי החלמון. העור היה בקלות להתקלף כמו רקמה אלסטית שכבה אחת אגף סביב העובר במהלך הניתוח, ולכן קל לזהות.</li>
	<li>לאחר החלמון מוסר לחלוטין מהגוף העוברי, לחתוך את רקמת העור האגף מן tailbud. שמירה על האחרון נוצר 3-4 somites שלם, לחתוך את הרקמה יותר חזיתית החוצה (explant ציר מלא).<ol>
<li>החלמון צריך לרדת בעיקר שלם מהליך זה. במקרה של חלמון קרוע, גרגירים משמעותיים של חלמון יכולים להישאר מחוברים לפני השטח הגחוני של הרקמה. אם כן, השתמשו בכלי ריסים לניקוי גרגירי החלמון הנותרים בעדינות. הערה: חוסר איזון של רקמות העור בצדדים הצדדיים של explant לא יאפשר לרקמה לשמור על כיוון צמיחה ישר. במקום זאת, ההסבר יתכופף לכיוון הצד של עור מתוח יותר. חוסר איזון זה ניתן לתקן תחת סטריאוסקופ על ידי קרע שכבת העור בעזרת סכין מיקרוכירורגית.</li>
		<li>לקבלת קללות ללא עור, לחץ על קצה של שכבת העור עם מחט לקלף את הרקמה explant עם הסכין microsurgical. תרביצים אלה לא יזרזו את ציר גופם בתרבות.</li>
		<li>בנוסף לציר המלא explants, explants חלופי יכול להתבצע בשלב זה. לדוגמה, לנתח סומיטיות כבר מקוטע באמצעות סכין מיקרוכירורגית (explants PSM מלא) או לנתח את PSM לתוך חצי anteroposterior שלה (explants חצי PSM). אנא עיין בסעיף 5.1 ליישום של תרשימים חלופיים כאלה.</li>
	</ol></li>
	<li>העבר מיד את ההסבר המנותח לכיסוי של 22 מ"מ x 22 מ"מ שעליו תבוצע ההדמיה.<ol>
<li>מסדרים את האקספלנט שטוח על ציר הגבורה, צד הגחוני נוגע בכיסוי(איור 1B). הסר בעדינות את המדיה העודפת סביב הרקמה באמצעות פיפטה עם קצה מסונן של 20 μL. הערה: העברה מאוחרת של זרזים מנותחים לכיסוי גורמת לעיוותים של הרקמה, שכן היא משוחררת מהמגבלות הגיאומטריות של החלמון.</li>
	</ol></li>
	<li>במהירות ובזהירות להפוך את הכיסוי עם explant מעל תא שקופיות בינוני הצמיחה מלא.<ol>
<li>כדי למנוע היווצרות בועה, מניחים צד של כיסוי מרובע על תא הקלטת ומשחררים את הצד השני בעדינות. היזהר לא לזוז / לעוות את explant בשלב זה.</li>
		<li>הסר בעדינות דימום מדיה עודף מחוץ לתא על-ידי לחיצה על תא השקופית על רקמת מעבדה. הכיסוי יישב ביציבות על תא השקופית להדמיה חיה, בשל מתח פני השטח של המדיום הנוזלי ללא כל איטום.</li>
		<li>במשך תקופה ארוכה culturing (>6 שעות), להשתמש בתא גדול יותר. ניתן להשתמש בכיסויים מלבניים 22 מ"מ x 50 מ"מ יחד עם שני נתיבים מקבילים של שכבות סרט הדבקה בשקופיות במקרים כאלה. ניתן להשאיר מרווח ברוחב ~ 1 מ"מ בין שני נתיבי קלטת כדי להקל על הגישה לאוויר למדיום הגדילה.</li>
	</ol></li>
	<li>חזור על שלבים 3.3-3.8 כדי להכין תדרים נוספים. תערוכות מוכנות יארכו את ציר הגוף A-P שלהם עם מהירות ממוצעת של ~ 30 מיקרומטר / שעה וקטע somites שלהם עם ~ 40 דקות מרווחים ב 25 °C(איור 2A, וידאו 1).<ol>
<li>עבור explants לא מאריך, להחיל לחץ עדין על הצדדים של שקופית מחזיק את המדגם בשלב 3.8.2 תוך מציצת התקשורת העודפת על רקמת מעבדה. לחלופין, ניתן לתרבת תרבית explants בתאי שקופיות שכבת קלטת אחת. כמו כן, הפעלה כימית של משטח תא השקופיות באמצעות קולגן מסוג I תגרום לתדרים לא מאריכים(איור 2B, וידאו 2).<ol>
<li>בצע ציפוי של התא עם קולגן מסוג I מראש על ידי כיסוי מלא של תאי השקופית עם 15-20 מ"ל של פתרון קולגן טרום בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. השתמש מכסה המנוע זרימה למינארי לפרוטוקול זה כדי לשמור על סטריליות. יש לשטוף בזהירות את התאים עם מדיום הניתוח בסוף.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לעוברים מעל גיל 15, עלו על רקמת האקספלנט של הזנב לרוחב במקום הר שטוח (דורסובנטרלי)(וידאו 3). כדי למנוע עוויתות שרירים, כלול פתרון 0.004% טריקאין במדיה התרבותית כסוכן הרדמה3.</li>
	</ol></li>
</ol>4. רכישת תמונה חיה
<ol><li>דגימות תמונה או על טווח ניתוח עבור הדמיית אור משודר שדה רחב של גודלים ותקופות פילוח סומיטי, או עם מיקרוסקופיה מובנית תאורה / confocal / גיליון אור באמצעות קווי דגים כתב מהונדס.</li>
	<li>השווה את הטמפרטורה של רקמות explants עם טמפרטורת חדר הדמיה לפחות 15 דקות.<ol>
<li>לבקרת טמפרטורה מדויקת יותר, השתמשו במערכת בקרת טמפרטורה מסחרית המותקנת על מיקרוסקופ הפוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את מרווחי המסגרות של רכישת התמונה ל- 2 - 10 דקות בהתאם לתהליך הביולוגי של עניין. הערה: פילוח סומייט זברה הוא תהליך מהיר, הנע בין 20 - 55 דקות לטמפרטורות קיימא של 30 °C (70 °F) עד 21 °C (70 °F) בעוברים שלמים. Explants יהיה להאריך פלח ~ 30% איטי יותר מאשר העוברים כולו.<ol>
<li>שים לב להשאיר מספיק עיכוב בין סטים של רכישות ערוץ כדי למנוע פוטוטוקסיות אפשרית לרקמות חיות. אין לחשוף את הרקמה לקרן העירור במשך יותר ממחצית משך ההדמיה ולהוריד את עוצמת הקרן ככל האפשר. הערה: הצטברות של מיני חמצן תגובתי (ROS) היא בדרך כלל הגורם העיקרי של phototoxicity בדגימותחיות 4. חומצה אסקורבית כמו נבלות ROS ניתן להשלים בינוני צמיחה ב 4 mM ריכוז כדי לאגור פעילות ROS ולהקל phototoxicity. תופעות לוואי של phototoxicity עשוי להיות קשה להבחין במהלך הדמיה חיה. מקלעי זנב הם יתרון בהיבט זה מאז כמה סמנים חזותיים של phototoxicity כגון מעצר מיטוטי, התפתחות רקמות מעוכבים (כלומר, היווצרות של somites, התארכות הזנב), ורקמות מתפוררות קל יותר להבחין. נא עיין בהפניה4 שסופקה לדיון מפורט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש בעוברים מוזרקים RNA בשלב תא יחיד כדי לרכוש תמונות 4-D שנועדו להיות מקוטעים ומנותחים ברמת הרזולוציה התאית.<ol>
<li>השתמש 300 pg של RNA מן הממברנות תעתיק במבחנה פלסמידים סמן כתב פלואורסצנטי גרעיני כגון pCS-ממברנה-ceruleanFP (פלסמיד Addgene #53749) או pCS-memb-mCherry (הוסף פלסמיד #53750) בשילוב עם pCS2+ H2B-mTagBFP2 (#99267 פלסמיד Addgene) או pCS2 + H2B-TagRFP-T (#99271 פלסמיד Addgene) בזריקות. לסרט לדוגמה עם סמני קרום תאים וגרעינים ראו וידאו 4. הערה: גודל התא הממוצע של רקמת PSM הוא כ ~ 5 מיקרומטר קוטר, מתוכם גרעינים מורכב ~ 3 - 4 מיקרומטר. גודל פיקסל של ~ 0.5 מיקרומטר ו z-sectioning של ~ 1 מיקרומטר צריך להיות רשום עבור פילוח התא הנכון.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. חיסון של מפרצי זנב
הערה: רקמות הגדלות לאחר תרחישי ניתוח שונים (התארכות, אי-התארכות, ניצן זנב מנותח, חצי PSM וכו ') כמו זנב שטוח רכוב explants5 ניתן לשחזר מתאי שקופיות לכימותים immunostaining נוספים של חלבונים מעניינים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול המשמש עבור אות חוץ תאי di-phosphorylated מוסדר קינאז (ppERK) כתמים של explants כמו FGF איתות קריאה הדרגתית.
<ol><li>לאחר היווצרות של somites עד השלב הרצוי, בזהירות להעביר את coverslip באמצע הדרך לפינה של תא השקופית מבלי להרים.</li>
	<li>בעזרת ~ 100 μL של מדיום ניתוח משלים בזכוכית פסטר פיפטה, לשחזר את explants מן השקופית ולהעביר לתוך צלחת תרבות התא 64-גם. הערה: החל משלב זה, ניתן לבצע את כל החלפת הפתרונות תחת טווח ניתוח עם פיפטה זכוכית נפרדת לדגימות קבועות. זה יבטיח לא לאבד רקמות explant בבארות או להעביר אותם בין לבין.</li>
	<li>לאחר העברת כל explants, למצוץ את המדיום המוגזם מתוך בארות אחד אחד ולשים 100 μL של 4% paraformaldehyde ב PBS (PFA) לתוך כל באר. אזהרה: PFA הוא פתרון רעיל עם השפעות מסרטנים. יש להשתמש ב- PPE מתאים בעת הטיפול.</li>
	<li>לתקן explants בצלחת 64-באר בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה על שייקר.<ol>
<li>רקמות רגישות יותר לעיוותים מאשר לעוברים שלמים. כוונן את מהירות השייקר בהתאם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את התיקון עם 150 μL של PBS-Tw (0.1% Tween20 ב PBS) שלוש פעמים. לאסוף את הכביסה הראשונה במיכל ספציפי "פסולת PFA".</li>
	<li>לייבש explants ב 4×5 דקות צעדים על ידי החלפת ~ 40 μL של פתרון בכל פעם עם 100% מתנול (MeOH). אזהרה: MeOH הוא כימיקל רעיל שהוא נדיף ודליק. עבוד בחלל מאוורר היטב והשתמש ב- PPE מתאים לטיפול.</li>
	<li>כמו השלב האחרון של התייבשות, להסיר את כל הפתרון מבארות ולהחליף עם 100 μL של MeOH. דגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הערה: השתמש במיכל ספציפי של "MeOH Waste" כדי לאסוף את הפתרונות עד שלב 5.11.</li>
	<li>מוסיפים 50 μL של MeOH ומנערים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>Rehydrate explants ב 4×5 דקות צעדים על ידי החלפת ~ 40 μL של פתרון בכל פעם עם PBS-T (0.1% טריטון-X 100 ב PBS). השתמש במיכל ספציפי "MeOH Waste" כדי לאסוף את הפתרונות.</li>
	<li>כצעד האחרון של התייבשות, להסיר את כל הפתרון מבארות ולהחליף עם 100 μL של PBS-T.</li>
	<li>עבור רקמות חדירות לטפל explants עם 1.5% טריטון-X 100 ב PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.</li>
	<li>לשטוף דגימות עם MAB-D-T (0.1% טריטון-X 100 דטרגנט ו 1% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ב 150 mM NaCl 100 mM חומצה מאלית חיץ pH 7.5) 3×5 דקות. אזהרה: DMSO הוא דליק ומוטוגן רעיל. יש להשתמש ב- PPE מתאים בעת הטיפול.</li>
	<li>דגירה explants ב 100 μL / גם פתרון חסימת סרום (2% סרום שור עוברי ב MAB-D-T) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>החלף את כל פתרון החסימה בתמיסת נוגדן ראשונית 50-100 μL /well (דילול של 1:1000 של נוגדן עכבר חד שבטי נגד ppERK בבלוק סרום). דגימות דגירה O / N (>16 שעות) ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.</li>
	<li>לשטוף את פתרון הנוגדנים העיקרי עם MAB-D-T 5×5 דקות.</li>
	<li>דגימות דגירה בתמיסת נוגדנים משנית (Alexa Fluor 597 עז נגד עכבר IgG2b (1:200) ו Hoechst 33342 (1:5000) ב MAB-D-T) O /N ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר או במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. הערה: החל משלב זה, לכסות את צלחת 64-well עם רדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור של נוגדנים משניים שטופלו דגימות. אזהרה: הוצ'סט 33342 הוא חומר מסרטן פוטנציאלי. יש להשתמש ב- PPE מתאים בעת הטיפול.</li>
	<li>לשטוף את פתרון הנוגדנים המשני עם PBS-Tw 3×5 דקות.</li>
	<li>לתקן דגימות עם PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את התיקון עם PBS-Tw ו דגימות שיווי משקל בתוך 60% גליצרול. הר explants על שקופיות מיקרוסקופ עם לק ציפורניים ו 60% גליצרול להדמיה. לתוצאות חיסוניות מייצגות ראו איור 3.</li>
</ol>

<ol><li>Assheton, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAssheton%2C+R+%22Growth+in+length%3A+Embryological+Essays%22">Growth in length: Embryological Essays</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).</li>
<li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%2C+3rd+edition%22">The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition</a>. , University of Oregon Press. Oregon. (1995).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (1700003), (2017).</li>
<li>Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+fold+change+of+Fgf+signaling+encodes+positional+information+for+segmental+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish.</a> Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).</li>
<li>Dubrulle, J., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fgf8+mRNA+decay+establishes+a+gradient+that+couples+axial+elongation+to+patterning+in+the+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo.</a> Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).</li>
<li>Diez del Corral, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+FGF+and+Retinoid+Pathways+Control+Ventral+Neural+Pattern%2C+Neuronal+Differentiation%2C+and+Segmentation+during+Body+Axis+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension.</a> Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).</li>
<li>Stern, H. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+and+notochord+promote+in+vitro+myogenesis+in+single+somite+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants.</a> Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).</li>
<li>Manning, A. J., Kimelman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx16+and+Msgn1+are+required+to+establish+directional+cell+migration+of+zebrafish+mesodermal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors.</a> Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף ולא להצהיר על ניגודי עניינים.

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של טכניקת explant תרבות רקמה שפיתחנו והשתמשנו לאחרונה5 עבור עוברי זברה. הטכניקה שלנו מתבססת על שיטות ההסבר הקודמות בחומוס8 ובזברפיש9,10,11 אורגניזמים מודל. גישושים זנב מוכן עם פרוטוקול זה יכול לשרוד כל עוד >12 שעות בתא שקופיות פשוט, ממשיך להאריך את ציר הגוף העיקרי שלה ופילוח somites, עד סוף somitogenesis. 
יש לתת טיפול כדי לשמ...

פילוח מטמרי של אורגניזמים נמצא בשימוש נרחב בטבע. מבנים חוזרים ונשנים חיוניים לפונקציונליות של איברים לרוחב כגון חוליות, שרירים, עצבים, כלי דם, גפיים או עלים בתוכנית גוף1. כתוצאה מאילוצים פיזיולוגיים וגיאומטריים כאלה של הסימטריה הצירית, רוב הפילה של בילטריה - כגון אנלדים, פרוקי רגליים ואקורדטים - מציגים פילוח של הרקמות העובריות שלהם (למשל, אקטודרם, מזודרם) באופן אנטרו-אחורי.
עוברי חוליות מחלקים ברצף את מזודרם הפרקסיאלי שלהם לאורך ציר הגוף הראשי לסומיטים עם מרווחים, ספירות והתפלגויות גודל ספציפיים למינים. למרות החוסן הזה בקרב עוברים בודדים בתוך מין מסוים, פילוח סומיטי הוא רב-תכליתי בין מינים של בעלי חוליות. פילוח קורה במשטר עצום של מרווחי זמן (מ 25 דקות ב zebrafish כדי 5 שעות בבני אדם), גדלים (מ ~ 20 מיקרומטר בסומיטות זנב של זברה כדי ~ 200 מיקרומטר בסומיטים גזע של עכברים) וסופר (מ 32 ב zebrafish כדי ~ 300 ב נחשי תירס)2. באופן מעניין יותר, עוברי דגים יכולים להתפתח במגוון רחב של טמפרטורות (מ ~ 20 °C (עד 34 °C (70 °F) עבור דגי זברה) תוך שמירה על somites שלהם ללא פגע עם התפלגות גודל נאותה על ידי פיצוי הן מרווחי פילוח ומהירויות התארכות צירית. מעבר לתכונות מעניינות כאלה, זברה-פיש נשאר כאורגניזם מודל שימושי לחקר פילוח בחולייתנים בשל ההתפתחות החיצונית, הסינכרונית והשקופה של בשפע של עוברים אחים כמו גם הכלים הגנטיים הנגישים שלהם. מנקודת מבט מיקרוסקופית, עוברים טלוסטים מתפתחים על חלמון כדורי מגושם, מותחים ומעגלים את רקמת הגז סביבו (איור 1A). במאמר זה, אנו מציגים תרבות שטוחה 3-D רקמה explant עבור זנבות זברה. מערכת הסבר זו עוקפת את האילוצים הכדוריים של מסת החלמון, ומאפשרת גישה להדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של עוברי דגים לדוגמת דומיטי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61981/61981fig01.jpg"> איור 1: מערכת Explant קאמרית שקופית לעוברים של דגי זברה. (A) לעוברים של דגי זברה יש יתרונות להדמיה חיה, כגון שקיפות של רקמה עוברית מתכלה (כחולה), אך הרקמה נוצרת סביב מסת חלמון כדורית (צהובה) מגושמת המונעת הדמיה כמעט אובייקטיבית ברזולוציה גבוהה בעוברים שלמים. ניתן לנתח את פתיתי הזנב החל מסכין מיקרוכירורגית (חומה) שנחתכה מהרקמה של סומיטס (אדום) וממשיכה בגבול עם החלמון האחורי. (B)פירורי זנב מנותח ניתן להניח על כיסוי (כחול בהיר) dorsoventrally; שמירה על רקמה עצבית (אפור בהיר) מלמעלה ונונוצ'ורד (אפור כהה) בתחתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61981/61981fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>מזרק Sub-Q בנפח 1 מ"ל עם מחט PrecisionGlide</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>REF 309597</td><td>להסרת עוברים ומניפולציות</td></tr><tr><td>200 אתנול הוכחה,</td><td>מעבדות דקון</td> נטולות מים <td>2701</td> לתמיסת אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית <td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>(100 ופעמים;)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5955</td><td>למדיית חיתוך רקמות</td></tr><tr><td>סידן כלוריד נטול מים, אבקת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>499609</td><td>למדיית דיסקציית רקמות</td></tr><tr><td>דימתיל-סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5879</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי, #10 נירוסטה</td><td>אינטגרה-מילטקס</td><td>MIL4-411</td><td>להכנת בארות שקופיות סרט</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (טריקאין)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>886-86-2</td> <td>(אופציונלי) לרקמות הרדמה בנות יותר מ-20 סומיטים</td></tr><tr><td>שלב סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A3160601</td><td>נוסף לאמצעי תרבית רקמות</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG2b, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#A-21145; RRID: נוגדן</td><td>משני AB_2535781 לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>L-15 בינוני עם L-גלוטמין ללא פנול אדום</td><td>GIBCO</td><td>21083-027</td><td>למדיה לדיסקציה של רקמות</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>179337</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>סכין קרנית מיקרו-כירורגית 2.85 מ"מ קצה זוויתי להב שפוע כפול</td><td>התמחויות כירורגיות</td><td>72-2863</td><td>לדיסקציה של רקמות</td></tr><tr><td>עכבר חד שבטי אנטי-ppERK</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>חתול#M8159; RRID:AB_477245</td><td>לצביעה חיסונית ppERK</td></tr><tr><td>NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>R37106</td> <td>(אופציונלי) לצביעה חיה של גרעיני תאים</td></tr><tr><td>אבקת פרפורמלדהיד, 95%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127</td><td>לקיבוע דגימות לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>תמיסת ציפוי קולגן זנב עכברוש</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122-20</td> <td>(אופציונלי) להפעלה כימית של תאי שקופיות</td></tr><tr><td>Stage Top Incubator</td><td>Tokai Hit</td><td>tokai-hit-stxg</td> <td>(אופציונלי) לבקרת טמפרטורה במהלך הדמיה חיה</td></tr><tr><td>סרט שקוף 3/4</td>''<td>Scotch</td><td>S-9782</td><td>להכנת בארות שקופיות</td></tr><tr><td>סרט Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>דג זברה: Tg( actb2:2xMCP-NLS-EGFP)</td><td>קמפבל et&nbsp;al., 2015</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4</td><td>דגים טרנסגניים עם דג זברה EGFP מקומי גרעיני</td></tr><tr><td>: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)</td><td>Cooper et&nbsp;al., 2005</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75</td><td>דגים טרנסגניים עם קרום תא מקומי EGFP</td></tr></tbody></table>

תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

עוברי חוליות מעצבים את ציר הגוף העיקרי שלהם כסומיטים שחוזרים על עצמם, מבשרי החוליות, השרירים והעור. Somites בהדרגה קטע מן mesoderm presomitic (PSM) כמו קצה הזנב של העובר מתארך אחורית. סומיטים יוצרים עם מחזוריות רגילה וגודל קנה מידה. זברהפיש הוא אורגניזם מודל פופולרי כפי שהוא ניתן להנדס גנטית ויש לו עוברים שקופים המאפשרים הדמיה חיה. עם זאת, במהלך somitogenesis, עוברי דגים כרוכים סביב חלמון גדול, עיגול. גיאומטריה זו מגבילה הדמיה חיה של רקמת PSM בעוברים של דגי זברה, במיוחד ברזולוציות גבוהות יותר הדורשות מרחק עבודה אובייקטיבי קרוב. כאן, אנו מציגים שיטת תרבית רקמה תלת-ממדית שטוחה להדמיה חיה של תוכחות זברה- זנב. תרשימי זנב מחקים עוברים שלמים על ידי הצגת האטה פרופורציונלית של התארכות הציר וקיצור אורכי הסומיטה rostrocaudal. אנו מסוגלים עוד יותר לעכב את מהירות התארכות הציר באמצעות תרבות explant. זה, בפעם הראשונה, מאפשר לנו להתיר את הקלט הכימי של מעברי צבע איתות מן הקלט המכניסטי של התארכות צירית. במחקרים עתידיים, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם התקנה מיקרופלואידית כדי לאפשר הפרעות תרופות מבוקרות זמן או הקרנה של פילוח בעלי חוליות ללא כל חששות חדירה לתרופות.

פרוטוקול זה מאפשר culturing גיאומטרי שטוח של זנב זברה חי explants. תרבית הרקמות מציגה שלושה יתרונות עיקריים על פני עוברים שלמים: 1) שליטה במהירות התארכות הציר, 2) שליטה על מקורות איתות (מורפוגן) שונים על ידי ניתוח פשוט, ו -3) כמעט אובייקטיבי, הגדלה גבוהה והדמיה חיה גבוהה של NA.
תאי שקופית שאינם מטופלים כימית מאפשרים לזנב להאריך את הציר הראשי שלו (איור 2A)על ידי אקטודרם העור העוטף את הרקמה שמתחתיו. כאשר תרביתנו את האקספלנטים בתאי השקופיות המופעלים כימית (עם קולגן מ...

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לתרבות רקמות תלת-ממדית של ציר הגוף האחורי של דג הזברה, המאפשר מחקר חי של פילוח בעלי חוליות. מודל הסבר זה מספק שליטה על התארכות הציר, שינוי מקורות מורפוגן והדמיה חיה ברמת הרקמה בתת-תאיות.

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

3-D זברה דג זנב explants בואו ננצל את השקיפות של עוברי זברה עד למידתו המלאה במהלך התפתחות somite ופילוח בעלי חוליות. מלאו מיכל הזדווגות ריק במים של מערכת הדגים. נקה את המסננת עם מי מערכת.הרימו את המחסומים בין זוגות ההזדווגות. מעבירים באופן סלקטיבי את זוג הדגים למיכל המים המתוקים. לאסוף עוברים במסננת באמצעות העברות מים עם מיכל ריק.לשטוף את העוברים שנאספו עם מים מערכת דגים ולהפוך על צלחת פטרי. כלי ניתוח בזיגוג אתנול. הפוך שתי שכבות של קלטות בשקופיות.חותכים את הצדדים האופקיים של תאים עמוקים. תא שלם חותך עם צדדים אנכיים. מקלפים את הקלטת מפני השטח של התא.יוצקים את המדיה של תרבות התאים בצינור. מערבבים סידן כלורי 2.8 מילימולאר ריכוז סופי. הוסף פתרון אנטיביוטי.התקשורת הנפרדת של אלקוט בצינור נפרד. מחמאה סרום שור עוברי כדי להפוך את תרבית הרקמות בינונית. לבטל את הקורלציה של עוברים עם מחטים.לשטוף את העוברים בצלחת מים מתוקים ולאסוף אותם להסבר. לייצב את העובר עם מחט ולהתחיל de-yoking. חותכים את שאריות הרקמות.מעבירים את האקספלנטים לכיסוי. לשטח את הרקמה ולמצוץ מדיה עודפת עם פיפטה. שים את העטיפה על מדיום צמיחה המכיל תא שקופית.שים את רקמת האקספלנט על מגבון רקמה. החל שמן טבילה על המטרה. תרכיב את תא השקופיות במיקרוסקופ.כוונן ערוצי לייזר לרכישת תמונה. בדוק את מגבלות שכבת z של הדגימה. הגדר דימות זמן ושכבות z.מערכת הסבר זנב תלת מימדי שומרת על שילוב תאים לניצן הזנב והתארכות עודפת ללא פגע כמו עוברים שלמים. ניתן גם לעצור התארכות עודפת על ידי הפעלה כימית של פני השטח עם קולגן מסוג אחד. מערכת explants זברה-דג זברה תלת-ממדי מאפשרת לנו לנצל את השקיפות של עוברי זברה על ידי מתן אפשרות לנו לצלם תמונות מיקרוסקופיות ברזולוציה גבוהה וכמעט אובייקטיבית.חוץ מזה, זה מאפשר לנו לנתק את עודף התארכות מן איתות מורפוגן וגם לשלוט על מקורות איתות מורפוגן עם שיטות ניתוח פשוטות.

a-3-d-tail-explant-culture-to-study-vertebrate-segmentation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Somitogenesis הוא תהליך התפתחותי קצבי שמרחבית דפוסי ציר הגוף של עוברי החולייתנים. בעבר, פיתחנו קווי דג הזברה מהונדסים המשתמשים בכתבי ניאון להתבונן גנים מחזוריים המניע את התהליך הזה. כאן, אנו תרבות מפוזרת תאים משורות אלה ותמונת התנודות שלהם לאורך זמן במבחנה.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

כאן, אנו מתארים כלים ושיטות חישוביות המאפשרים הדמיה וניתוח של נתוני תמונה תלת-ממדיים וארבעה מימדיים של עוברי עכבר בהקשר של התארכות צירית וסגמנטציה, המתקבלים על ידי טומוגרפיה של הקרנה אופטית טוטו, ועל ידי הדמיה חיה וכתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית.

גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות

explants blastoderm דגי זברה נוצרים על ידי בידוד תאים עובריים ממרכזי איתות אנדוגני בתוך העובר המוקדם, ומייצרים אשכולות תאים נאיביים יחסית מניפולציה בקלות ו ex vivoתרבית . מאמר זה מספק הוראות להכנת explants כאלה ומדגים את התועלת שלהם על ידי חקירת תפקידים עבור נודל איתות במהלך gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים של שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים).

שיטת תרבית תלת ממדית של ספרואידים של קווי תאים עובריים ודגי זברה בכבד

למד תרבית רקמה תלת-ממדית של זנב זברהפיש לחקר פילוח בעלי חוליות. שיטה זו מאפשרת הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה ומניפולציה של מקורות מורפוגנים בפיתוח עוברי.

תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש

גלה סרטונים נוספים