תיוג קוולנטי עם דיתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה

ההליכים הניסיוניים לביצוע תיוג קוולנטי מבוסס diethylpyrocarbonate עם זיהוי ספקטרומטרי מסה מתוארים. Diethylpyrocarbonate הוא פשוט מעורבב עם חלבון או חלבון קומפלקס של עניין, המוביל לשינוי של שאריות חומצות אמינו נגיש ממס. ניתן לזהות את השאריות ששונו לאחר עיכול פרוטאוליטי וניתוח כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה.

אפיון מבנה החלבון חיוני להבנת תפקידו. ספקטרומטריית מסה התפתחה ככלי רב עוצמה למטרה זו, במיוחד עבור מערכות חלבון שקשה ללמוד בשיטות מסורתיות. כדי לחקור מבנה חלבון לפי מפרט מסה, תגובות כימיות ספציפיות מבוצעות בתמיסה המקודדת מידע מבני חלבון לתוך המסה שלה.

גישה יעילה במיוחד היא להשתמש ריאגנטים כי covalently לשנות פתרון שרשראות צד חומצות אמינו נגישות. תגובות אלה מובילות לעליות מסה שניתן לבצע בהן לוקליזציה עם רזולוציית רמת שאריות בשילוב עם עיכול פרוטאוליטי וספקטרומטריית מסה דו-מושבית. כאן, תיארנו את הפרוטוקולים הקשורים לשימוש diethyl pyrocarbonate או DEPC כמו מגיב תיוג covalent יחד עם זיהוי מפרט מסה.

DEPC היא מולקולה אלקטרופילית מאוד המסוגלת לתייג עד 30% מהשאריות בחלבון הממוצע, ובכך לספק רזולוציה מבנית מצוינת. DEPC שימש בהצלחה יחד עם מפרט מסה כדי להשיג מידע מבני עבור חלבונים רבים ושונים. התחל על ידי הכנת פתרון אגירה של החלבון שלך עניין בריכוז בטווח של עשרות micromolar.

בדרך כלל אנו משתמשים במאגר 10 מילימולר pH 7.4 MOPS. לחלופין, פתרון חלבון קיים עשוי להיות חילופי מאגר לתוך MOPS או מאגר אחר אם המדגם המקורי מכיל מאגר בעל קבוצות תפקודיות נוקליאופיליות. זה הכרחי כי החיץ אין קבוצות תפקודיות נוקליאופילית כי הם יפריעו תגובת חלבון DEPC.

במיקרו-צינורית שונה, הכינו תמיסת מלאי של 100 מילימולאר DEPC באצטוניטריל יבש. הכנת פתרון המניה אצטוניטריל יבש יש צורך למנוע הידרוליזה של DEPC. במיקרו-צינור חדש, הכינו פתרון של אימידזול טוחן אחד במים ברמה של HPLC.

במיקרו-צינור חדש, מערבבים את מאגר ה-MOPS ותמיסת החלבונים. לחלבון ולחוצץ להוסיף aliquot של פתרון מלאי DEPC לוודא שזה כראוי לערבב אותו לפני הצבת תערובת התגובה לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך דקה אחת. יש לבחור את הנפח של פתרון מלאי DEPC בו נעשה שימוש בהתבסס על יחס ריכוז החלבון הסופי של DEPC הרצוי.

אין קבוצה אחת של ריכוזי DEPC וחלבונים שיעבדו עם כל חלבון, אם כי ניתן להעריך את ריכוז DEPC האופטימלי בהתבסס על מספר שאריות היסטידין וליצין נגישות ממס הנמצאות בחלבון. יש לציין כי נפח האצטוניטריל הוסיף, שהוא למעשה נפח של פתרון DEPC הוסיף לא יעלה על 1% של נפח התגובה הכוללת כמו כדי למנוע הפרעה של מבנה החלבון במהלך התגובה. זמן התגובה הוא בסופו של דבר עד המשתמש, אם כי תגובה של דקה אחת בתנאי הדוגמה ממזערת על תיוג של החלבון וההידרוליזה של DEPC.

לאחר דקה אחת חלפה, להרוות את התגובה על ידי הוספת imidazole כדי לטהר את הנותרים על DEPC הגיב. לוודא את הריכוז הסופי של imidazole הוא 50 פעמים את ריכוז DEPC. כדי לזהות את השאריות ששונו על ידי DEPC, החלבון חייב להיות מתעכל באופן פרוטאוליטי לרסיסי פפטיד.

לעיכול, בחר תנאים נוחים לחלבון מעניין. צעדים נפוצים המתוארים כאן כרוכים בהתפתחות חלבון ולאחר מכן צמצום ו alkylating קשרים disulfide כך יעילות העיכול ניתן לשפר. מניסיוננו, חשיפת החלבון עם denaturant וחום לפני העיכול משפר את היעילות של העיכול.

בעוד חלבון נפרש, להשוות פתרונות של TCEP ו iodoacetamide במאגר עיכול מתאים. יש להשתמש ב- TCEP כסוכן ההפחתה במקום ב- dithiothreitol או ב- DTT מכיוון ש- DTT יכול להגיב עם שאריות ששונו על-ידי DEPC. אלקילציה של הקבצים וכתוצאה מכך לאחר הפחתה היא חיונית כדי למנוע ערבוב תווית שבו קבצים חינם החלבון להגיב עם חומצות אמינו שונה.

לאחר סיום השלב המתפתח, להפחית קשרים disulfide על ידי הוספת TCEP לתערובת התגובה ולתת לו להגיב במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההפחתה, מוסיפים iodoacetamide לתערובת התגובה, לתת לו להגיב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. מושגת כאן על ידי הצבת תערובת התגובה בקופסה.

הריכוז הסופי של iodoacetamide צריך להיות כפול הריכוז המשמש TCEP או 80 פעמים את ריכוז החלבון או קשר דיסולפיד. הכן את האנזים של עניין, בדרך כלל טריפסין או chymotrypsin על פי מפרט היצרן. לאחר הכנת האנזים המועדף, מתחילים בעיכול ומדגרים את תערובת התגובה ב-37 מעלות צלזיוס.

יחס חלבון 10:1 לאנזימים עם עיכול של שלוש שעות באמצעות אנזימים משותקים הוא בדרך כלל בחירה טובה עבור חלבונים שכותרתו DEPC. לאחר העיכול, המדגם צריך להיות מנותח באופן מיידי על ידי LC-MS / MS או פלאש קפוא עם חנקן נוזלי כדי למזער את השפלה של המדגם ואובדן תווית. ניתן להשתמש בפרמטרים סטנדרטיים של LC-MS/MS עבור פרוטאומיקה מלמטה למעלה כדי לזהות אתרים המסומנים בתווית על שברי הפפטיד הפרוטאוליטיים.

השלב ההפוך C18 נייח יש להשתמש כדי להשיג את ההפרדה הטובה ביותר של פפטידים. מניסיוננו, LC נימי מספק מידע כמותי אמין יותר על רמות שינוי מאשר ננו LC בגלל כמויות מדגם גבוהות יותר בשימוש. שלב נייד טיפוסי LC המשמש להפרדת DEPC שכותרתו פפטידים מורכב משני ממיסים.

ממס A הוא מים עם 0.1% חומצה פורמית וממס B הוא אצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית. נעשה שימוש בהקלה הדרגתית וניתן למטב את זמן ההפרדה בהתאם למורכבות הדגימה. ספקטרומטר מסה המסוגל לבצע LC-MS ו- MS/MS מקוונים נדרש כדי לזהות אתרי שינוי DEPC בפפטידים.

בניסויים שלנו, השתמשנו בהצלחה במספר סוגים של ספקטרומטרים של מסה. מצאנו כי היתוך אורביטרפ תרמו מספק תוצאות מצוינות, אם כי כל ספקטרומטר מסה המסוגל לבצע באופן אוטומטי MS / MS של פפטידים רבים במהלך ניתוח LC-MS צריך להיות מתאים. יש להגדיר כראוי תנאי HPLC ופרמטרים ספקטרומטריים של מסה לפני המדידה.

אם הדגימה הוקפאה, יש להפשיר אותה ממש לפני הניתוח. נסה כמיטב יכולתך כדי למזער את הזמן בין הכנת מדגם והזרקת HPLC. לטעון ולהזריק את דגימת החלבון שכותרתו מתעכל לתוך מערכת LC ולהתחיל את רכישת LC-MS / MS או זיהוי אתר תווית DEPC וכימות אזור שיא, שיטות מרובות קיימות.

על מכשירי תרמו פישר, אקסקליבר או מגלה פרוטאום אולי בשימוש. הגדר פרמטרים מתאימים לזיהוי פפטיד בתוכנית. תוספת DEPC ו carbamidomethylation כלולים כשינויים משתנים המסייעים שאריות או מוקצה.

אזורי שיא כרומטוגרפיים של גרסאות שהשתנו ולא שונו של הפפטידים משמשים לקביעת אחוזי שינוי ברמת השאריות. תיוג DEPC עם זיהוי MS הוא גם כלי רב ערך לאפיון שינויים מבניים מסדר גבוה יותר לחלבונים. מהמחקר שלנו, תיוג קוולנטי DEPC יכול לזהות אזורי חלבון ספציפיים שעוברים שינויים מבניים על מתח תרמי וחמצוני.

באיור, שינויים משמעותיים באחוזי השינוי מוצגים בכחול לירידה בתיוג ואדום לעלייה בתיוג, בעוד שאריות ללא שינויי תיוג משמעותיים מוצגות בירוק חיוור. לדוגמה, לאחר בטא-2 מיקרוגלובולין נחשף ללחץ חום, שאריות רבות שעוברות ירידות משמעותיות בהיקפי התיוג, N-terminus, סרין 28, היסטידין 31, סרין 33, סרין 55, סרין 57, וליצין 58 קרובים יותר מצד אחד של החלבון המצביע על כך שאזור זה של החלבון עובר שינוי אישור או אולי מתווך צבירה. לאחר שהחלבון נחשף ללחץ חמצוני, שאריות שונות עם ירידה בתיוג, סרין 11, היסטידין 13, ליצין 19, ליצין 41 וליצין 94 מאשכול בשלב אחר של החלבון המציין כי החמצון המושרה שינוי אישור מתרחש במקום אחר.

למחקר זה יש השלכות חשובות על טיפולי החלבון, שהם כיום פלח השוק התרופות הצומח במהירות הגבוהה ביותר. עבודה אחרת מהקבוצה שלנו גם הראתה כי מפרט מסה תיוג covalent DEPC יכול לזהות ולזהות אתרים של שינויים אישור טיפולים נוגדנים חד שבטיים הדגיש. כפי שניתן לראות, תיוג covalent עם DEPC הוא פשוט ליישם באופן ניסיוני, עדיין יכול לספק מידע מבני בעל ערך עבור חלבונים.

הרזולוציה המבנית המסופקת על ידי מפרט מסה תיוג DEPC היא צנועה בהשוואה לטכניקות כמו קריסטלוגרפיה רנטגן ו- NMR, אבל זה נוח כמעט לכל חלבון ללא קשר לגודלו או היכולת להתגבש. מפרט מסה תיוג covalent DEPC עובד גם עם תערובות חלבון והוא יכול לעבוד עם סוגי מדגם מסובכים מאוד, כגון ליסקאט התא וזה תאי haCat. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו בטוחים כי תמצא DEPC תיוג כלי שימושי לאפיון מבנה החלבון.