תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

שלום לכולם. שמי ניקולס ויין. אני חוקר ראשי בבית החולים הארצי לילדים בקולומבוס, אוהיו.

והיום אנחנו הולכים להראות לך וידאו על איך לקחת ביופסיה לעור ולהמיר אותו myoblasts ו myotube. זהו כלי שימושי מאוד ללמוד הפרעה עצבית שרירית. בנוסף, זוהי טכנולוגיה מהירה יותר בהשוואה ל- IPSC מכיוון שאנו משתמשים בשני סוגים שונים של וירוסים כדי להילחם ישירות בסוג זה של תא.

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לביסוס תרבויות פיברובלסט הנגזרות מעור אנושי, את ההמרה למיובלסטים, ולאחר מכן תבליטים מובחנים. ביופסיה של העור מועברת לתרבות התאים כדי להפיק פיברובלסטים עוריים. Lentiviruses נושאת hTERT ו MYOD גנים משמשים כדי לתמר פיברובלסטים אלה.

עם תוספת של מדיום צמיחה myoblast בתוספת דוקסיציקלין, הגן MYOD מתבטא, גרימת ההמרה של fibroblasts לתוך myoblasts. לאחר מכן, המדיום עובר למדיום בידול, גם בתוספת דוקסיציקלין. ואז המיאובלסטים מתמזגים אחד עם השני, יוצרים מיוטובים רב-גרעיניים.

לשאוף את התקשורת מהצינור ולשטוף את הביופסיה עם 10 מיליליטר, אחד x PBS בטמפרטורת החדר, שלוש פעמים. לאחר הכביסה השלישית, להשאיר את PBS בצינור. יוצקים את ה-PBS ואת ביופסיית העור על צלחת בריבוע של 10 ס"מ.

באמצעות אזמלים סטריליים, לחתוך את הביופסיה לחתיכות קטנות ככל האפשר. בעזרת פיפטה, מעבירים חתיכת עור בודדת לתבשיל בריבוע סטרילי של 10 ס"מ. לשאוף את עודף של PBS מסביב לכל חתיכה.

היזהר לא לשאוף את היצירה עצמה. מכסים את הכלים במכסה באופן חלקי ומאפשרים לחתיכות הביופסיה של העור להתייבש במשך חמש עד 20 דקות. אין לאפשר לחתיכות להתייבש זמן רב מדי.

לאחר שהחתיכות יבשות, הטה את המנה בזווית של 45 מעלות והוסף לאט 12 מיליליטר של מדיום פיברובלסט לפינת המנה. מנמיכים את המנה, מפיצים בזהירות את המדיה כך שהיצירות אינן מורמות על ידי התקשורת. מניחים את הכלים באינקובטור.

החלף את התקשורת בחמישה עד שבעה ימים, ופעם בשבוע לאחר מכן. זרע פיברובלסטים ראשוניים ב 30% של מפגש ושתי בארות של צלחת 12 באר, כ 20, 000 תאים לבאר, על מנת לקבל כ 50% של confluency למחרת. עבור התמרה lentiviral, להוסיף שניים עד 5 מיליארד גנומים ויראליים של hTERP Puromycin Lentivirus ו 400 מיקרוליטרים של מדיום פיברובלסט.

מוסיפים את תערובת lentivirus לבאר אחת. לבאר השנייה, הוסיפו רק 400 מיקרוליטרים של מדיום פיברובלסט. למחרת, הוסף מיליליטר אחד של מדיה.

יום או יומיים לאחר מכן, מעבירים את התאים לצלחת שש באר ומגדלים אותם עד שמגיעים ל-60 עד 70%. להשלים את המדיום fibroblast עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של Puromycin ולהוסיף שני מיליליטר לכל באר. שמור את התאים תחת בחירה עד שכל התאים בפקד ימותו לפחות 12 יום, וישנה את המדיה כל יומיים עד שלושה ימים.

תרשים Seed H המבטא פיברובלסטים ב-30% מפגש בשלוש בארות מתוך 12 לוחות הבארות, עם כ-50% מפגש למחרת. עבור התמרה lentiviral, לערבב שניים עד חמישה מיליארד גנומים ויראליים של MYOD Hygromycin B lentivirus ו 400 microliters של מדיום fibroblast ולהוסיף לשתי בארות. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום למחרת.

יום או יומיים לאחר מכן להעביר את התאים לתוך צלחת שש באר לגדול עד 60 עד 70% confluent. תוספת מדיה צמיחה עם 400 מיקרוגרם למיליליטר של Hygromycin B.Add שני מיליליטר לכל באר. שמור את התאים תחת בחירה עד שכל התאים בבארות הבקרה ימותו, בדרך כלל לוקח לפחות 12 ימים, שינוי המדיה כל יומיים עד שלושה ימים.

לגיוס של מיובלסטים, לגדל פיברובלסטים עד שהם 70% confluent. הוסף שמונה מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין למדיום הצמיחה myoblast. השתמש תמיד aliquots טריים של דוקסיציקלין ובינוני.

יש להכין את המדיה ממש לפני שינויים כלשהם במדיה. בנוסף, אין לחדד את הקו הדוקסיציקלין. לשאוף את המדיום fibroblast ולשטוף את התאים עם PBS.

הוסף 10 מיליליטר של מדיה myoblast בתוספת. יומיים עד שלושה ימים לאחר מכן, התאים הם 90 עד 95% משולבים והמורפולוגיה שלהם תשתנה. לשאוף את התקשורת צמיחה myoblast ולשטוף את פני השטח של התא עם PBS.

הוסף 10 מיליליטר של מדיה בידול כי כבר בתוספת שמונה מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין טרי. המשך לשנות את התקשורת כל יומיים עד שלושה ימים עד myotubes נוצרים. שבעה עד עשרה ימים לאחר תחילת הבידול myotube, תאים צריכים להיות מובחנים לחלוטין, אבל זה משתנה מקו תא אחד למשנהו.

הפיברובלסטים הראשונים עשויים לצוץ חמישה ימים לאחר שחלקי העור היו בתרבות. בתמונה B, פיברובלסטים הם confluent ומוכנים להיות מועברים 75 ס"מ בקבוקים מרובעים לשגשוג נוסף. חשוב להקפיא כמה בקבוקונים של פיברובלסטים במספרי מעבר נמוכים כאשר תאים ראשיים נכנסים לתחושה המשוכפלת.

לאחר קווי התא FM הוקמו עבור ההמרה של fibroblasts לתוך myotubes, fibroblasts חייב להתרבות עד 70%confluent כפי שמוצג בתמונה A.It חשוב לא יעלה על 80% confluency, כמו צפיפות גבוהה עלולה לפגוע הבידול. לאחר הוספת דוקסיציקלין למדיום, בתוך יומיים עד ארבעה ימים התאים הופכים myoblasts, מאופיין מורפולוגיה מוארכת אוריינטציה מקבילה כפי שניתן לראות בתמונה B.Differentiated myotubes מוצגים בתמונה C.The הזמן היתוך ובידול של myotubes עשוי להשתנות משבעה עד 21 ימים בהתאם לגנוטיפ התא. יש לאסוף או לתקן את התאים לפני שהם ניתוק.

את תחילת הניתוק ניתן לראות על ידי צבע ובהירות של הקצוות של myotube, כפי שצוין על ידי החצים בתמונה זו. על ידי immunofluorescence, הביטוי של חלבונים ספציפיים שריר בוגר מאשר את ההמרה המוצלחת של fibroblasts לתוך myotubes. בתמונות אלה מוצגים שלושה תאים שונים.

מידת הבידול תשתנה מתא לתא, ועשויה או לא יכולה להיות מושפעת מהמוטציה העיקרית מכיוון שזה המקרה של תאים באיורים B ו- C.עוד אימות של המודל אושר על ידי RNAseq. כפי שמוצג בעלילה זו ישנם יותר מ 12, 000 גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי זוהה myotubes FM לעומת זה של שריר השלד. המתאם המשמעותי בין שני התמלולים תומך בכך שלתאי FM יש פרופיל ביטוי ספציפי לשריר המוכיח שהם פונדקאית שימושית ואמינה לקווי תאים שמקורם בשרירים.

כדי להמחיש את התועלת של מודל זה במבחנה, השתמשנו באחד הכפילים האקסוניים הנפוצים ביותר בגן DMD. שכפול של Exon 2 מוביל לשיבוש מסגרת הקריאה DMD, ודילוג שלה יכול להוביל לשחזור של מסגרת קריאה זו או ניצול של אתר הכניסה הריבוזום הפנימי. טיפול זה כבר אומת עם מחקרים vivo איור A, הדגמנו הוכחת רעיון על ידי ניתוח RTPCR של קו התא מוטציה מסוים זה, עם וללא טיפול על ידי דילוג exon.

הכתם המערבי באיור B מדגים כי חלבון דיסטרופין תפקודי מתבטא בתאים מטופלים. כאשר משווים את היעילות של טיפול זה למודלים in vivo, התוצאות תומכות באמינות טכניקת בידול התא ותומכות בשימוש בו לבדיקת טיפולים גנטיים ספציפיים למוטציה שונים. לפני מחקרים קליניים נדרש כדי לבדוק את היעילות של תמיכה טיפולית רשמית על הפרעות neuromuscular, בהתאם ליכולת של מודלים בעלי חיים ותאים.

התפתחות מודלים של בעלי חיים, אם כי להיות קל יותר בימינו, שלה לא אופציה ריאלית עבור כל מוטציה ספציפית. הדור של myoblasts דרך תאי IPS נגזר פיברובלסטים עורי היא חלופה, אבל זה טכניקה זמן רב. לפיכך, הליך זה הוא חלופה פשוטה לדור שב"ס המאפשרת המרה ישירה של פיברובלסטים למיובלסטים.

זה מקל על הגישה מודלים תאים אנושיים על ידי הימנעות יישום פולשני יותר של ביופסיות שרירים לסיכום, המרה ישירה זו של fibroblasts לתוך myoblasts הוא כלי רב עוצמה לבדיקת טיפולים עבור הפרעות שרירים עצביים בהקשר ספציפי הגבלה.