Name: תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו להמיר פיברובלסטים עוריים למיובלסטים ומיוטיובים לחקר הפרעות נוירומוסקולריות. שיטה זו מציעה חלופה מהירה לטכנולוגיית iPSC לבדיקת טיפולים מותאמים אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר וינסנט מולי על ששיתף את הידע שלו בעבר בנוגע למודל. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (R01 NS043264 (K.M.F., ו R.B.W.)), המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב המכון הלאומי של דלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., ו N.W.). N.W. קיבל תמיכה מלגות מאוניברסיטת אוהיו סטייט / ארצית בית החולים לילדים שריר הקבוצה ואת קרן פיליפ. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרנות פנימיות לפי שיקול דעת וחלק מעבודת הדילוג exon 2 נתמכה גם על ידי CureDuchenne (K.M.F.) והאיגוד הצרפתי קונטר לס מיופתיות. מספר IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 ו- IBCSC#: IBS00000123.

<ol><li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+down-regulates+the+myogenic+regulatory+factors+in+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts.</a> Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).</li>
<li>Pantic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+versatile+immortal+muscle+cell+models+from+healthy+and+myotonic+dystrophy+type+1+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts.</a> Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).</li>
<li>Thorley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+characteristics+are+preserved+in+hTERT%2Fcdk4+human+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.</a> Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).</li>
<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+Validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+duchen%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen.</a> Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).</li>
<li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-skipping+advances+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy.</a> Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).</li>
<li>Hwang, J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+exon-skipping+therapies+using+antisense+oligonucleotides+and+genome+editing+for+the+treatment+of+various+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies.</a> Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Skipping+of+Single+Exon+Duplications+in+DMD+Patient-Derived+Cell+Lines+Using+an+Antisense+Oligonucleotide+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).</li>
<li>De Angelis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+snRNA+molecules+carrying+antisense+sequences+against+the+splice+junctions+of+exon+51+of+the+dystrophin+pre-mRNA+induce+exon+skipping+and+restoration+of+a+dystrophin+synthesis+in+%CE%9448-50+DMD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).</li>
<li>Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+alteration+of+pre-mRNA+splicing+patterns+by+modified+U7+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
</ol>

בית החולים הארצי לילדים העניק רישיון לתוכנית הדילוג Exon 2 המתוארת בזאת ל-Audentes Therapeutics. K.M.F. ו N.W. קיבלו תשלומי תמלוגים כתוצאה מרישיון זה.

כדי להשיג קווי תא FM באיכות טובה, כמה צעדים הם קריטיים. ככל שביופסיה של העור מעובדת מוקדם יותר, כך גדלים הסיכויים להשיג פיברובלסטים בריאים. מספר המעבר של תרבויות פיברובלסטים חשוב גם הוא. לתאים ראשיים יש יכולת התפשטות מוגבלת ולאחר מעברים רבים, הם נכנסים בהיגיון משכפל. לכן, עדיף שיש מלאי של fibroblasts במספר מעבר נמוך ולהפוך תאים במעבר המוקדם ככל האפשר. 
צעד חשוב נוסף הוא גם הפקה ויראלית בעלת טוהר מרבי וכימות מדויק. לדוגמה, כימות גנום ויראלי באמצעות qPCR מספק מדידות סבירות, אך כימות על ידי ddPCR...

מודלים תאיים המתקבלים ישירות מרקמות אנושיות שימושיים למודל של הפרעות גנטיות אנושיות רבות, עם היתרון של ההקשר הגנומי המקורי, ובמקרים רבים, שחזור אותם סימני היכר מולקולריים ותאית שנצפו בחולים. בתחום הפרעות נוירומוסקולריות, ביופסיות שרירים היו מקור נהדר למיובלסטים אנושיים ועזרו בהבהרה של מנגנונים פתולוגיים. בנוסף, הם כלי חשוב עבור בדיקות vivo של תרופות וטיפולים גנטיים. מצד אחד, הנגזרת של מיובלסטים משברי שרירים היא קלה יחסית. מצד שני, התרבות והתחזוקה של myoblasts העיקרי הם מאתגרים, בגלל שיעור התפשטות מוגבל שלהם ו senescence משכפל במבחנה1. חלופה למגבלות אלה היא להנציח מיובלסטים עם החדרת הטלומראז האנושי(hTERT)ו / או קינאז תלוי ציקלין 4 (CDK4)גנים 2,3, עם שימור של תכונות שריר השלד4. עם זאת, העקשנות של myoblasts העיקרי עדיין תלוי ביופסיה שרירים, הליך כירורגי עם חסרונות לחולים, אשר, במקרים רבים, יש את השרירים שלהם ניוון מתקדם. לכן, השריר של חולים אלה מורכב מחלק משמעותי של רקמת פיברוטית ו / או שומן ומניב פחות תאי שריר, הדורשים טיהור של התאים בעבר להנצחה.
בניגוד לביופסיות שרירים, ביופסיות עור נגישות יותר ופחות מזיקות לחולים. פיברובלסטים ראשוניים יכולים להיגזר משברי עור במבחנה. למרות fibroblasts אינם מושפעים בעיקר על ידי מוטציות הגורמות הפרעות neuromuscular, הם יכולים להיות transdifferentiated לתוך myoblasts. זה יכול להיות מושגת על ידי החדרת הגן Myod, גורם שעתוק רגולטורי מיוגני5. בכתב יד זה, אנו מתארים את הפרוטוקול להשגת מיובלסטים מופרכים, מהקמת תרבויות פיברובלסטים ועד נטיה של מיוטובים מובחנים (סיכום מייצג של השיטה מתואר באיור 1).
בדיקות פרה-קליניות של אסטרטגיות טיפוליות תלויות במודלים תאיים ובעלי חיים הנושאים מוטציות דומות למוטציות שנמצאו בחולים אנושיים. למרות הפיתוח של מודלים בעלי חיים הפך ריאלי יותר עם התקדמות של טכנולוגיות עריכת גנים כגון CRISPR / Cas96, זה עדיין מאתגר ויקר. לכן, קווי תאים שמקורם בחולה הם אופציה נגישה יש מודלים, המכסה את הספקטרום הגדול של מוטציות של מחלות כגון ניוון שרירים דושן (DMD). Obtention ויצירת מודלים של תאים חיוניים לפיתוח טיפולים מותאמים אישית עבור פתולוגיות כאלה.
בין טיפולים מותאמים אישית שנחקרו, exon דילוג אסטרטגיות הוא אחד המבטיחים עבור dystrophies שרירים שונים7,8. אסטרטגיה זו מורכבת מייצור חלבון קצר יותר אך פונקציונלי. זה מבוצע על ידי הסתרת ההגדרה exon לשחבור, ולכן להוציא את האקסון מוטציה מהשליח הסופי. זוהי טכנולוגיה מבטיחה מאוד שאושרה על ידי ה-FDA עבור DMD. לכן, אנו מתארים גם בפרוטוקול זה, שיטות כדי transfect myoblasts עם שתי exon שונים דילוג על טכנולוגיות קשורות: אוליגונוקלאוטידים antisense (AON) ו U7snRNA-אדנו הקשורים וירוס (AAV). AON transfection הוא כלי טוב עבור ההקרנה הראשונית של מספר רצפים שנועדו לקדם אקסון דילוג9. עם זאת, הפעילות של AONs היא חולפת. כדי לקבל ביטוי מתמשך של רצפי antisense, חקרנו גם RNAs גרעיניים קטנים (snRNAs) בשילוב עם AAV, המאפשר לוקליזציה גרעינית והכללה במכונות השחבור10. U7 הוא snRNA מעורב בעיבוד של mRNA histone שניתן להנדס כדי לאגד חלבונים כי יהיה להפנות אותו לשחבור ולספק רצפי antisense11. השימוש ב- U7 snRNAs שונה בשילוב עם וקטורים AAV מתגבר על מגבלות של AONs וכתוצאה מכך ביטוי מתמשך של AONs והעברה טובה יותר של רקמות שלעניין 12. אנו משתמשים בתאים הנגזרים מחולים DMD עבור פרוטוקול זה כדי להמחיש את אסטרטגיית דילוג exon.

<table><tbody><tr><td>100 מ"מ צלחת</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA, פנול אדום</td><td>תרמו פישר</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X מאגר העברה</td><td>תרמו פישר</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-אצטט SDS מאגר רץ</td><td>תרמו פישר</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8% Tris-אצטט ג'ל</td><td>תרמו פישר</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ בקבוק</td><td>קורנינג</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקרוטית 100X</td><td>תרמו פישר</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>שרשרת כבדה אנטי מיוזין, נוגדן סרקומר</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידיום</td><td>MF20 דילול סופרנטנט</td><td>1:50</td></tr><tr><td>נוגד חמצון</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA בדיקת חלבון</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3571</td><td>דילול 1:1000</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובט</td><td>תרמו פישר</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I set (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין הידרוכלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 פריימרים אנושיים</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5</td><td>' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'נוגדן</td><td></td></tr> <tr><td>דיסטרופין</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר, Alexa Fluor 488</td><td>תרמו פישר</td><td>A11001</td><td>דילול 1:1000</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז עצור 100X</td><td>תרמו פישר</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Thermo Fisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD עז נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>דילול 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II CC2 מערכת שקופיות קאמרית</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל GFR מטריצת ממברנה</td><td>קורנינג</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר מדעי</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>מר Frosty הקפאה מיכל</td><td>תרמו פישר</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה 0.45 ומיקרו; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>בקרת סרום עיזים רגילה</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>מאגר חוסם לכתם מערבי</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>Medium Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PCR מאסטר מיקס</td><td>תרמו פישר</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פוספטאז</td><td>תרמו פישר</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>דיוק פלוס חלבון תקני צבע כפול</td><td>ביו ראד</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 סה"כ כתם חלבון לנורמליזציה של כתם מערבי</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid ערכת</td><td>תרמו פישר</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA נקי & רכז-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>אספן כירורגי</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>התמיינות תאי שריר שלד בינוני</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>מדיום צמיחת תאי שריר</td><td>שלד Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>מגיב</td> <td>TRIzolThermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade הרכבה בינונית</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

חקירות הן של הפתופיזיולוגיה והן של המטרות הטיפוליות בדיסטרופיות שרירים נבלמו על ידי היכולת המרובית המוגבלת של מיובלסטים אנושיים. מספר מודלים של עכברים נוצרו אך הם אינם מייצגים באמת את הפיזיופתולוגיה האנושית של המחלה או שאינם מייצגים את הספקטרום הרחב של מוטציות שנמצאו בבני אדם. הנצחת המיובלסטים העיקריים האנושיים היא חלופה למגבלה זו; עם זאת, הוא עדיין תלוי ביופסיות שרירים, אשר פולשניים ולא זמין בקלות. לעומת זאת, ביופסיות עור קלות יותר להשגה ופחות פולשניות לחולים. פיברובלסטים המופקים מביופסיות עור ניתן להנציח ולהשתנות לתוך myoblasts, מתן מקור של תאים עם פוטנציאל מיוגני מעולה. כאן, אנו מתארים שיטת תכנות מחדש מהירה וישירה של פיברובלסט לשושלת מיוגנית. Fibroblasts הם transduced עם שני lentiviruses: hTERT כדי להנציח את התרבות העיקרית ואת MYODפטיש, אשר על תוספת של דוקסיציקלין, גורם ההמרה של fibroblasts לתוך myoblasts ולאחר מכן myotubes בוגרת, אשר מבטאים סמני בידול מאוחר. פרוטוקול transdifferentiation מהיר זה מייצג כלי רב עוצמה לחקור מנגנונים פתולוגיים ולחקור ביותרפיות חדשניות מבוססות גנים או תרופתיות להפרעות נוירומוסקולריות.

פרוטוקול זה מראה כיצד להקים תרבויות פיברובלסט אנושיות שמקורן בעור ולהמיר אותן למיובלסטים ולאחר מכן למיוטובים מובחנים. סוג זה של קו התא הוא מאוד שימושי לחקר הפרעות neuromuscular ובדיקות במבחנה של טיפולים פוטנציאליים.
באיור 1מוצג ייצוג סכמטי של ההמרה הפיברובלסטית . איור 2A מציג שבר עור ואת הפיברובלסטים העולים ממנו. יש להעביר את הפיברובלסטים למנה חדשה כאשר מגיעים להתכנסות (איור 2B). <strong class="x...

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

שלום לכולם. שמי ניקולס ויין. אני חוקר ראשי בבית החולים הארצי לילדים בקולומבוס, אוהיו.והיום אנחנו הולכים להראות לך וידאו על איך לקחת ביופסיה לעור ולהמיר אותו myoblasts ו myotube. זהו כלי שימושי מאוד ללמוד הפרעה עצבית שרירית. בנוסף, זוהי טכנולוגיה מהירה יותר בהשוואה ל- IPSC מכיוון שאנו משתמשים בשני סוגים שונים של וירוסים כדי להילחם ישירות בסוג זה של תא.סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לביסוס תרבויות פיברובלסט הנגזרות מעור אנושי, את ההמרה למיובלסטים, ולאחר מכן תבליטים מובחנים. ביופסיה של העור מועברת לתרבות התאים כדי להפיק פיברובלסטים עוריים. Lentiviruses נושאת hTERT ו MYOD גנים משמשים כדי לתמר פיברובלסטים אלה.עם תוספת של מדיום צמיחה myoblast בתוספת דוקסיציקלין, הגן MYOD מתבטא, גרימת ההמרה של fibroblasts לתוך myoblasts. לאחר מכן, המדיום עובר למדיום בידול, גם בתוספת דוקסיציקלין. ואז המיאובלסטים מתמזגים אחד עם השני, יוצרים מיוטובים רב-גרעיניים.לשאוף את התקשורת מהצינור ולשטוף את הביופסיה עם 10 מיליליטר, אחד x PBS בטמפרטורת החדר, שלוש פעמים. לאחר הכביסה השלישית, להשאיר את PBS בצינור. יוצקים את ה-PBS ואת ביופסיית העור על צלחת בריבוע של 10 ס"מ.באמצעות אזמלים סטריליים, לחתוך את הביופסיה לחתיכות קטנות ככל האפשר. בעזרת פיפטה, מעבירים חתיכת עור בודדת לתבשיל בריבוע סטרילי של 10 ס"מ. לשאוף את עודף של PBS מסביב לכל חתיכה.היזהר לא לשאוף את היצירה עצמה. מכסים את הכלים במכסה באופן חלקי ומאפשרים לחתיכות הביופסיה של העור להתייבש במשך חמש עד 20 דקות. אין לאפשר לחתיכות להתייבש זמן רב מדי.לאחר שהחתיכות יבשות, הטה את המנה בזווית של 45 מעלות והוסף לאט 12 מיליליטר של מדיום פיברובלסט לפינת המנה. מנמיכים את המנה, מפיצים בזהירות את המדיה כך שהיצירות אינן מורמות על ידי התקשורת. מניחים את הכלים באינקובטור.החלף את התקשורת בחמישה עד שבעה ימים, ופעם בשבוע לאחר מכן. זרע פיברובלסטים ראשוניים ב 30% של מפגש ושתי בארות של צלחת 12 באר, כ 20, 000 תאים לבאר, על מנת לקבל כ 50% של confluency למחרת. עבור התמרה lentiviral, להוסיף שניים עד 5 מיליארד גנומים ויראליים של hTERP Puromycin Lentivirus ו 400 מיקרוליטרים של מדיום פיברובלסט.מוסיפים את תערובת lentivirus לבאר אחת. לבאר השנייה, הוסיפו רק 400 מיקרוליטרים של מדיום פיברובלסט. למחרת, הוסף מיליליטר אחד של מדיה.יום או יומיים לאחר מכן, מעבירים את התאים לצלחת שש באר ומגדלים אותם עד שמגיעים ל-60 עד 70%. להשלים את המדיום fibroblast עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של Puromycin ולהוסיף שני מיליליטר לכל באר. שמור את התאים תחת בחירה עד שכל התאים בפקד ימותו לפחות 12 יום, וישנה את המדיה כל יומיים עד שלושה ימים.תרשים Seed H המבטא פיברובלסטים ב-30% מפגש בשלוש בארות מתוך 12 לוחות הבארות, עם כ-50% מפגש למחרת. עבור התמרה lentiviral, לערבב שניים עד חמישה מיליארד גנומים ויראליים של MYOD Hygromycin B lentivirus ו 400 microliters של מדיום fibroblast ולהוסיף לשתי בארות. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום למחרת.יום או יומיים לאחר מכן להעביר את התאים לתוך צלחת שש באר לגדול עד 60 עד 70% confluent. תוספת מדיה צמיחה עם 400 מיקרוגרם למיליליטר של Hygromycin B.Add שני מיליליטר לכל באר. שמור את התאים תחת בחירה עד שכל התאים בבארות הבקרה ימותו, בדרך כלל לוקח לפחות 12 ימים, שינוי המדיה כל יומיים עד שלושה ימים.לגיוס של מיובלסטים, לגדל פיברובלסטים עד שהם 70% confluent. הוסף שמונה מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין למדיום הצמיחה myoblast. השתמש תמיד aliquots טריים של דוקסיציקלין ובינוני.יש להכין את המדיה ממש לפני שינויים כלשהם במדיה. בנוסף, אין לחדד את הקו הדוקסיציקלין. לשאוף את המדיום fibroblast ולשטוף את התאים עם PBS.הוסף 10 מיליליטר של מדיה myoblast בתוספת. יומיים עד שלושה ימים לאחר מכן, התאים הם 90 עד 95% משולבים והמורפולוגיה שלהם תשתנה. לשאוף את התקשורת צמיחה myoblast ולשטוף את פני השטח של התא עם PBS.הוסף 10 מיליליטר של מדיה בידול כי כבר בתוספת שמונה מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין טרי. המשך לשנות את התקשורת כל יומיים עד שלושה ימים עד myotubes נוצרים. שבעה עד עשרה ימים לאחר תחילת הבידול myotube, תאים צריכים להיות מובחנים לחלוטין, אבל זה משתנה מקו תא אחד למשנהו.הפיברובלסטים הראשונים עשויים לצוץ חמישה ימים לאחר שחלקי העור היו בתרבות. בתמונה B, פיברובלסטים הם confluent ומוכנים להיות מועברים 75 ס"מ בקבוקים מרובעים לשגשוג נוסף. חשוב להקפיא כמה בקבוקונים של פיברובלסטים במספרי מעבר נמוכים כאשר תאים ראשיים נכנסים לתחושה המשוכפלת.לאחר קווי התא FM הוקמו עבור ההמרה של fibroblasts לתוך myotubes, fibroblasts חייב להתרבות עד 70%confluent כפי שמוצג בתמונה A.It חשוב לא יעלה על 80% confluency, כמו צפיפות גבוהה עלולה לפגוע הבידול. לאחר הוספת דוקסיציקלין למדיום, בתוך יומיים עד ארבעה ימים התאים הופכים myoblasts, מאופיין מורפולוגיה מוארכת אוריינטציה מקבילה כפי שניתן לראות בתמונה B.Differentiated myotubes מוצגים בתמונה C.The הזמן היתוך ובידול של myotubes עשוי להשתנות משבעה עד 21 ימים בהתאם לגנוטיפ התא. יש לאסוף או לתקן את התאים לפני שהם ניתוק.את תחילת הניתוק ניתן לראות על ידי צבע ובהירות של הקצוות של myotube, כפי שצוין על ידי החצים בתמונה זו. על ידי immunofluorescence, הביטוי של חלבונים ספציפיים שריר בוגר מאשר את ההמרה המוצלחת של fibroblasts לתוך myotubes. בתמונות אלה מוצגים שלושה תאים שונים.מידת הבידול תשתנה מתא לתא, ועשויה או לא יכולה להיות מושפעת מהמוטציה העיקרית מכיוון שזה המקרה של תאים באיורים B ו- C.עוד אימות של המודל אושר על ידי RNAseq. כפי שמוצג בעלילה זו ישנם יותר מ 12, 000 גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי זוהה myotubes FM לעומת זה של שריר השלד. המתאם המשמעותי בין שני התמלולים תומך בכך שלתאי FM יש פרופיל ביטוי ספציפי לשריר המוכיח שהם פונדקאית שימושית ואמינה לקווי תאים שמקורם בשרירים.כדי להמחיש את התועלת של מודל זה במבחנה, השתמשנו באחד הכפילים האקסוניים הנפוצים ביותר בגן DMD. שכפול של Exon 2 מוביל לשיבוש מסגרת הקריאה DMD, ודילוג שלה יכול להוביל לשחזור של מסגרת קריאה זו או ניצול של אתר הכניסה הריבוזום הפנימי. טיפול זה כבר אומת עם מחקרים vivo איור A, הדגמנו הוכחת רעיון על ידי ניתוח RTPCR של קו התא מוטציה מסוים זה, עם וללא טיפול על ידי דילוג exon.הכתם המערבי באיור B מדגים כי חלבון דיסטרופין תפקודי מתבטא בתאים מטופלים. כאשר משווים את היעילות של טיפול זה למודלים in vivo, התוצאות תומכות באמינות טכניקת בידול התא ותומכות בשימוש בו לבדיקת טיפולים גנטיים ספציפיים למוטציה שונים. לפני מחקרים קליניים נדרש כדי לבדוק את היעילות של תמיכה טיפולית רשמית על הפרעות neuromuscular, בהתאם ליכולת של מודלים בעלי חיים ותאים.התפתחות מודלים של בעלי חיים, אם כי להיות קל יותר בימינו, שלה לא אופציה ריאלית עבור כל מוטציה ספציפית. הדור של myoblasts דרך תאי IPS נגזר פיברובלסטים עורי היא חלופה, אבל זה טכניקה זמן רב. לפיכך, הליך זה הוא חלופה פשוטה לדור שב"ס המאפשרת המרה ישירה של פיברובלסטים למיובלסטים.זה מקל על הגישה מודלים תאים אנושיים על ידי הימנעות יישום פולשני יותר של ביופסיות שרירים לסיכום, המרה ישירה זו של fibroblasts לתוך myoblasts הוא כלי רב עוצמה לבדיקת טיפולים עבור הפרעות שרירים עצביים בהקשר ספציפי הגבלה.

direct-reprogramming-human-fibroblasts-into-myoblasts-to-investigate

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש...

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

פרוטוקול זה כולל נהלים מפורטים לבידוד תאים שמקורם בשתן מחולי ניוון שרירים; תכנות מחדש יעיל ומהיר שלהם באמצעות התמרת נגיף סנדאי.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד תאים חיים ותרבית ראשונית של קווי תאים מיוגניים ופיברובלסטים מרקמת שריר או עור.  מתוארת גם טכניקה לאמורטליזציה של קווי תאים אלה.  בסך הכל, פרוטוקולים אלה מספקים כלי אמין ליצירה ושימור של תאים שמקורם בחולה עבור יישומים במורד הזרם.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

התכנות עצביים ישיר יוצרת הנוירונים זה לשמור על הגיל לתא ההתחלה סומטיים. כאן, אנו מתארים שיטה המבוססת על וקטורים יחיד לייצר נוירונים המושרה fibroblasts עורי שהושג מתורמים האנושי למבוגרים.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

כאן נתאר שיטת הרלוונטית קלינית, יעילות גבוהה, ללא מזין לתכנת fibroblasts העיקרי אנושי לתוך תאי גזע pluripotent המושרה משתמש ששונה mRNAs קידוד גורמים התיכנות, בוגרת microRNA-367/302 מחקה. נכללים גם הם שיטות להערכת יעילות התיכנות, להרחיב iPSC המשובטים מושבות, לאשר את הביטוי של סמן pluripotency טרה-1-60.

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.

תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

למדו להמיר פיברובלסטים עוריים למיובלסטים ומיוטיובים לחקר הפרעות נוירומוסקולריות. שיטה זו מציעה חלופה מהירה לטכנולוגיית iPSC לבדיקת טיפולים מותאמים אישית.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

גלה סרטונים נוספים