Name: הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למד הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להרכבת פלסמידים רב-גניים ביעילות באמצעות ערכת Yeast MoClo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת מדינת ניו יורק (פרס #: 71272) ופרס IMPACT של האוניברסיטה בבאפלו (פרס #: 000077).

למחברים אין מה לחשוף.

ערכת השיבוט המבוססת על MoClo שפותחה על ידי Lee et al. מספקת משאב מצוין להרכבה מהירה של אחת עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים או לשכפול או להשתלבות בגנום השמרים. השימוש בערכה זו מבטל את צוואר הבקבוק של שיבוט זמן רב שקיים לעתים קרובות להבעת גנים מרובים בשמרים.
בדקנו חמישה תנאים שונים למחזורי העיכול/קשירה של שיבוט שער הזהב עם קשירת DNA T4. מצאנו כי 30 מחזורים של עיכול ב 37 °C (70 °F) במשך 5 דקות קשירה ב 16 °C (60 °F) במשך 5 דקות ואחריו שלב העיכול הסופי ב 50 °C (50 °F) במשך 10 °C (70 °F) במשך...

ביולוגיה סינתטית שואפת להנדס מערכות ביולוגיות עם פונקציות חדשות שימושיות לתעשיות פרמצבטיות, חקלאיות וכימיות. הרכבת מספר רב של שברי דנ"א באופן בעל תפוקה גבוהה היא טכנולוגיה בסיסית בביולוגיה סינתטית. תהליך מסובך כזה יכול להתפרק לרמות מרובות עם ירידה במורכבות, מושג המושאל ממדעי ההנדסה הבסיסית1,2. בביולוגיה סינתטית, שברי DNA בדרך כלל להרכיב באופן היררכי מבוסס על פונקציונליות: (i) רמת חלק: "חלקים" מתייחס שברי DNA עם פונקציה מסוימת, כגון מקדם, רצף קידוד, שליחות קטלנית, מקור של שכפול; (ii) רמת יחידות שעתוק (TU): TU מורכב ממקדם, רצף קידוד ומחסל המסוגל לתמלל גן יחיד; (iii) רמה מרובת גנים: פלסמיד מרובה גנים מכיל מספר TUs המורכב לעתים קרובות ממסלול מטבולי שלם. הרכבה היררכית זו חלוצה על ידי קהילת BioBrick היא מושג היסוד להרכבה של קבוצות גדולות של DNAs בביולוגיה סינתטית3.
בעשור האחרון4,5,6,7, טכניקת השיבוט שער הזהב אפשרה באופן משמעותי הרכבה DNA היררכית2. שיטות שיבוט מרובות חלקים רבים אחרים, כגון שיבוט גיבסון8, שיבוט עצמאי קשירה (SLIC)9, שיבוט מבוסס כריתת uracil (USER)10, תגובת רכיבה על אופניים ליגאז (LCR)11, ו ב vivo רקומבינציה (DNA Assembler)12,13, פותחו גם עד כה. אבל שיבוט שער הזהב הוא שיטת הרכבת DNA אידיאלית משום שהוא אינו תלוי ברצפים ספציפיים לגנים, ומאפשר הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. שיבוט שער הזהב מנצל אנזימי הגבלה מסוג IIS המזהים רצף לא פלינדרומי ליצירת מעליות מתנדנדות מחוץ לאתר הזיהוי2. לאחר מכן, ליגאז מצטרף לרסיסי הדנ"א ה Annealed כדי להשיג הרכבה מרובת חלקים. החלת אסטרטגיית שיבוט זו על מערכת שיבוט מודולרי (MoClo) אפשרה הרכבה של עד 10 שברי DNA עם מעל 90% transformants מוקרן המכיל את המבנה שהורכב כראוי4.
מערכת MoClo מציעה יתרונות עצומים שהאיצו את מחזור התכנון-מבחן של הביולוגיה הסינתטית. ראשית, החלקים הניתנים להחלפה מאפשרים שיבוט קומבינטורי כדי לבחון מרחב גדול של פרמטרים במהירות. לדוגמה, אופטימיזציה של מסלול מטבולי בדרך כלל דורש רכיבה על אופניים דרך מקדמים רבים עבור כל גן כדי לאזן את שטף המסלול. מערכת MoClo יכולה להתמודד בקלות עם משימות שיבוט תובעניות כאלה. שנית, יש לרצף את החלק פלסמיד אך בדרך כלל לא את ה- TU או את הפלסמידים מרובי הגנים. ברוב המקרים, הקרנה על ידי PCR המושבה או הגבלת העיכול מספיק לאימות ברמת TU ו פלסמיד רב גנים. הסיבה לכך היא שיבוט פלסמיד החלק הוא הצעד היחיד הדורש PCR, אשר לעתים קרובות מציג מוטציות. שלישית, מערכת MoClo אידיאלית לבניית מסלולים מטבוליים מורכבים מרובי גנים. לבסוף, בגלל ההסתבכויות האוניברסליות, ניתן לעשות שימוש חוזר בחלקים ולשתף אותם עם הקהילה הביו-הנדסהית כולה. נכון לעכשיו, ערכות MoClo זמינות עבורצמחים 14,15,5,16,17, פטריות6,18,19,20 ,21,22,חיידקים7,23,24,25,26,27, ובעליחיים 28,29. פלטפורמת MoClo רב ממלכות הוצגה גם לאחרונה30.
עבור Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 פיתחו ערכת כלים רב-תכליתית MoClo, משאב מצוין לקהילת הביולוגיה הסינתטית שמרים. ערכה זו מגיעה במתכונת נוחה של 96 בארות ומגדירה שמונה סוגים של חלקי דנ"א הניתנים להחלפה עם אוסף מגוון של מקדמים מאופיינים היטב, חלבונים פלואורסצנטיים, מחסלים, תגי פפטיד, סמני בחירה, מקור השכפול וכלי עריכת הגנום. ערכת כלים זו מאפשרת הרכבה של עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים. תכונות אלה הן בעלות ערך עבור הנדסה מטבולית שמרים, שבו מסלולים חלקיים או שלמים מבוטאים יתר על המידה כדי לייצר כימיקלים ממוקדים. באמצעות ערכה זו, החוקרים יש אופטימיזציה הייצור של geraniol, linalool31, פניצילין32, חומצה מוקונית33, אינדיגו34, ו betalain35 בשמרים.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד כדי להנחות את השימוש בערכת הכלים MoClo כדי ליצור מסלולים מרובי גנים עבור ביטוי אפיזומלי או גנומי. באמצעות שימוש נרחב בערכה זו, מצאנו כי המדידה המדויקת של ריכוזי DNA היא המפתח להבטחת התפלגות שווה השוויון של כל חלק בתגובת שער הזהב. אנו ממליצים גם על ליגאז DNA T4 על ליגאז DNA T7 כי לשעבר עובד טוב יותר עם מספר גדול יותר של overhangs36. לבסוף, יש להסיר או לביית אתרי זיהוי פנימיים של BsmBI ו- BsaI לפני ההרכבה. לחלופין, ניתן לשקול סינתזה של חלקים כדי להסיר אתרים פנימיים מרובים ולהשיג אופטימיזציה של קודון בו זמנית. אנו מדגימים כיצד להשתמש בערכת כלים זו על ידי הבעת מסלול של חמישה גנים לייצור β קרוטן וליקופן ב- S. cerevisiae. אנו מראים עוד כיצד לדפוק את לוקוס ADE2 באמצעות כלי עריכת הגנום מערכה זו. ניסויים מבוססי צבע אלה נבחרו להדמיה קלה. אנו גם מדגימים כיצד ליצור חלבוני היתוך וליצור מוטציות חומצות אמינו באמצעות שיבוט שער הזהב.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ"מ חרוזי זכוכית</td><td>מוצרי מחקר RPI</td><td>9831</td><td>לליזינג תאי שמרים</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD & חברה</td><td>214010</td><td>רכיב של המדיום הסינתטי השלם של השמרים (CSM)</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD& החברה</td><td>211677</td><td>רכיב של תמצית השמרים פפטון דקסטרוז מדיום (YPD)</td></tr><tr><td>BsaI-HFv2</td><td>New England Biolabs</td><td>R3733S</td><td>גרסה יעילה ביותר של אנזים הגבלת BsaI</td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>4800-94-6</td><td>אנטיביוטיקה להקרנה ברמת יחידת השעתוק</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>56-75-7</td><td>אנטיביוטיקה להקרנה ב רמת וקטור כניסה</td></tr><tr><td>CSM-His</td><td>Sunrise Sciences</td><td>1006-010</td><td>תוסף חומצות אמינו של המדיום הסינתטי השלם של השמרים (CSM)</td></tr> <tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר כימיקל</td><td>D16-500</td><td>מקור פחמן של המדיום הסינתטי השלם של השמרים (CSM)</td></tr> <tr><td>בסיס חנקן שמרים Difco ללא חומצות אמינו</td><td>BD & חברה</td><td>291940</td><td>מקור חנקן של המדיום הסינתטי השלם של השמרים (CSM)</td></tr> <tr><td>תערובת dNTP</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>dNTPs עבור PCR</td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0734S</td><td>איזוסכיזומר יעיל ביותר של BsmBI</td></tr><tr><td>Frozen-EZ שמרים Trasformation II Kit</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td>לטרנספורמציה של שמרים</td></tr><tr><td>הקסנס</td><td>פישר כימיקל</td><td>H302-1</td><td>למיצוי קרוטנואידים מתאי שמרים</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>25389-94-0</td><td>אנטיביוטיקה להקרנה ברמת הפלסמיד הרב-גני</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1425-2</td><td>מדיום אגר ליזוגני עבור E. coli תרבית</td></tr><tr><td>מרק LB, מילר</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP1426-2</td><td>מדיום נוזלי ליזוגני עבור E. coli תרבית</td></tr><tr>כימיקלים<td>של ליקופן</td><td>קיימן</td><td>NC1142173</td><td>לכימות ליקופן</td></tr><tr><td>MoClo YTK</td><td>Addgene</td><td>1000000061</td><td>מעבדת הפקדה: John</td></tr><tr><td>Deuber Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T1010L</td><td>לטיהור פלסמיד מ-E.coli</td></tr><tr><td>Nanodrop Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000c</td><td>למדידת ריכוזי DNA מדויקים</td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>אנזים הגבלה לליניאריזציה אינטגרטיבית של פלסמיד רב-גני</td></tr><tr><td>Nourseothricin Sulphate</td><td>Goldbio</td><td>N-500-100</td><td>סמן בחירת אנטיביוטיקה עבור פלסמיד pCAS המשמש במחקר זה</td></tr><tr><td>מאגר תגובת Phusion HF (5X)</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td>Buffer עבור PCR באמצעות פולימראז Phusion</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>פולימראז בנאמנות גבוהה לכל תגובות ה-PCR</td></tr><tr><td>pLM494</td><td>Addgene</td><td>100539</td><td>פלסמיד המשמש להגברת crtI, crtYB ו-crtE המשמש במחקר זה</td></tr><tr><td>קוורץ קובט</td><td>תרמו אלקטרונים</td><td>10050801</td><td>לכימות קרוטנואידים</td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ליגאז לזהב שיבוט שער</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BIO-RAD</td><td>1851148</td><td>לביצוע כל תגובות ה-PCR והשיבוט</td></tr><tr><td>בלנדר</td><td>כדורים הומוגנייזר רקמות</td><td>דגם: BBX24</td><td>להומוגניזציה של תאי שמרים</td></tr><tr><td>UV-Vis ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td>Genesys 150</td><td>לכימות קרוטנואידים</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP1422-500</td><td>מרכיב של תמצית השמרים פפטון דקסטרוז מדיום (YPD)</td></tr> <tr><td>ובטא;-קרוטן</td><td>אלפא Aesar</td><td>AAH6010603</td><td>לכימות &בטא;-קרוטן</td></tr></tbody></table>

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

שיטת השיבוט שער הזהב מאפשרת הרכבה מהירה של גנים מרובים בכל סידור המוגדר על ידי המשתמש. היא משתמשת באנזימי הגבלת IIS מסוג שחותכים מחוץ לאתרי הזיהוי שלהם ויוצרים עקיפה קצרה. מערכת שיבוט מודולרית (MoClo) זו משתמשת בזרימת עבודה הירארכית שבה חלקי דנ"א שונים, כגון מקדמים, רצפי קידוד (CDS) ומחסלים, משוכפלים תחילה לווקטור כניסה. לאחר מכן, וקטורים מרובים של הזנה מתאספים ליחידות שעתוק. מספר יחידות שעתוק מתחברות לפלסמיד מרובה גנים. אסטרטגיית השיבוט של שער הזהב היא בעלת יתרון עצום משום שהיא מאפשרת הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. זרימת העבודה ההיררכית מאפשרת בדרך כלל שיבוט קל של מגוון רחב של מבנים מרובי גנים ללא צורך ברצף מעבר לווקטורים של כניסה. השימוש בנשירה של חלבונים פלואורסצנטיים מאפשר סינון חזותי קל. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להרכבת פלסמידים מרובי גנים באמצעות ערכת שיבוט מודולרי שמרים (MoClo). אנו מראים תוצאות אופטימליות ותת-אופטימליות של הרכבה מרובת גנים ומספקים מדריך להקרנה למושבות. אסטרטגיית שיבוט זו ישימה מאוד עבור הנדסה מטבולית שמרים ומצבים אחרים שבהם שיבוט פלסמיד רב גנים נדרש.

כאן התוצאות של ארבעה פלסמידים מרובי גנים משוכפלים לייצור β קרוטן (צהוב) וליקופן (אדום). פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי אחד לשיבוש מוקד ADE2 נבנה, שהמושבות שלו אדומות.
שכפול תקליטורים לווקטור הערך (pYTK001) ERG20 הוגבר מגנום השמרים ושלושת הגנים הקרוטנואידים crtE, crtYB, crtI מהפלסמיד pLM49448 לתוך הכניסה וקטור pYTK001 כמתואר. מקדמי שמרים pENO2...

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

זהו פרוטוקול מפורט להרכבת פלסמידים מרובי גנים באמצעות ערכת שמרים MoClo. שיטה זו מאפשרת שיבוט נוח של מגוון חברים לכיתה מרובי גנים. הוא אידיאלי ליצירת ספרייה גדולה של חלקים קשורים.התחל על ידי הגדרת תערובת התגובה של שער הזהב. הוסף 20 femtomoles של כל מוצר PCR ואת וקטור הכניסה, microliter אחד של מאגר ליגאז 10X T4, 0.5 microliters של Esp3I, ו 0.5 microliters של ליגאז T4. הוסיפו מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 מיקרוליטרים.לאחר מכן, הפעל את תגובת השיבוט. להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן אלפא DH5 או שווה ערך Escherichia coli תאים כימיים מוסמכים על ידי הלם חום. מורחים את התאים על צלחת ליברות עם 35 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול.ואז להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה ומשאירים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך כחמש שעות כדי לאפשר לחלבון הפלואורסצנטי הירוק או ל- sfGFP להתפתח לצבע ירוק אינטנסיבי יותר. כדי לסנן את הצלחת, הנח אותה על טרנסילומינטור אולטרה סגול או כחול.SfGFP המכיל מושבות יהיה פלואורסצנטי תחת אור UV. המושבות הירוקות שליליות משום שהן מכילות את החלק הלא מלוטש פלסמיד. המושבות הלבנות הן כנראה חיוביות.השיבוט יצליח אם יש 30 עד 100% מושבות לבנות. להרכיב וקטור ביניים עם המחבר השמאלי, נשירה sfGFP, המחבר הימני, סמן בחירת שמרים, מקור שמרים של שכפול, ואת החלק plasmid עם mRFP1, מקור E.coli, ואת הגן עמיד אמפילין. בצע את תגובת השיבוט כמתואר בכתב היד של הטקסט.להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן אלפא DH5 ואז להפיץ את התאים על צלחת lb עם 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר קרבניצילין או אמפיצילין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה.הצלחת תכיל מושבות אדומות חיוורות וירוקות חיוורות. שמור את זה על ארבע מעלות צלזיוס במשך כחמש שעות כדי לאפשר mRFP1 ו sfGFP להתבגר. השתמש טרנסילומינטור UV או אור כחול כדי לזהות את המושבות הירוקות המכילות וקטור ביניים פוטנציאל נכון.פסים את המושבות הירוקות על צלחת קרבניצילין lb והדגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, פס אותם שוב על צלחת כלוראמפניקול ודגר ב 37 מעלות צלזיוס לילה. המושבות הגדלות על לוחות כלוראמפניקול מכילות פלסמידים שהורמסו שלא כהלכה.לאחר שווקטור הביניים הורכב בהצלחה, המשך בהרכבת יחידות התמלול. הרכבה זו בת ארבעת החלקים מכילה את וקטור הביניים, מקדם, תקליטור ודטרקטור. לטהר את הפלסמידים, לתעד את הריכוזים שלהם, ולדלל כל פלסמיד ל 20 femtomoles של DNA לכל מיקרוליטר.לאחר ביצוע תגובת השיבוט, להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך אלפא DH5 או שווה ערך E.coli תאים מוסמכים צלחת אותם על קרבניצילין LBN. ואז להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה ושומרים אותה על ארבע מעלות צלזיוס למשך כחמש שעות כדי לאפשר ל- sfGFP להתבגר.השתמש UV או transilluminator אור כחול כדי לזהות את המושבות הלבנות שאינן פלואורסצנטיות המכילות את יחידות שעתוק פוטנציאל נכון. להרכיב וקטור ביניים עבור פלסמידים מרובי גנים כמתואר בכתב היד טקסט. לאחר מכן להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך תאי אלפא DH5 צלחת אותם על lb עם 50 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin.דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בצע הקרנה מבוססת צבע אדום וירוק, ולאחר מכן פס ולהגדיל את המושבות הירוקות על צלחת kanamycin lb כדי למסך עבור הרכבות שגויות כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, להרכיב את פלסמיד רב גנים על ידי הגדרת תגובת שיבוט כמתואר בכתב היד טקסט.להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך תאי אלפא DH5 צלחת אותם על lb kanamycin. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר מכן בצע את ההקרנה בירוק ולבן כפי שתואר קודם לכן.פרוטוקול זה שימש לבניית פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי אחד לשיבוש מוקד ADE2. ארבעה פלסמידים משוכפלים ואחד רב-גנים אינטגרטיבי הורכבו. היחס בין מושבות שעשויות להיות נכונות לשיבוט וקטור הביניים היה 1.83% לאחר שפלסמיד הביניים שוכפל, שיעור ההצלחה של הרכבת פלסמידים מרובי גנים מהבינוניים היה 93.77% המספרים הזניחים של מושבות לבנות חיוביות מדגימים הרכבה תת-אופטימלית של פלסמידים מרובי גנים.לאחר שהפכו לשמרים, מושבות המייצרות בטא קרוטן וליקופן גדלו ביום השלישי. ארבע מושבות מכל צלחת היו מפוספסות על צלחות טריות וגדלו במשך יומיים נוספים. הקרוטנואידים חולצו וכומתו על ידי ספקטרופוטומיית UV-Vis.BTS1/ERG20 מוביל לייצור גבוה פי 35 של בטא קרוטן בהשוואה למתח עם ERG20 בלבד. כמו כן, הייצור של ליקופן הוא כ 16.5 קיפול גבוה יותר בזן עם BTS1/ERG20 לעומת ERG20 לבד. הפלסמיד האינטגרטיבי הרב-גנים שימש לשיבוש מוקד ADE2, בין אם עם gRNA ובין אם ללא דנ"א עוזר או עם gRNA ופלסמיד אינטגרטיבי מרובה גנים כדנ"א עוזר.לאחר שלושה עד ארבעה ימים, מושבות אדומות נצפו על לוחית YPD עם Nourseothricin, המציין כי ADE2 שובש בהצלחה. בעת ניסיון שיטה זו, הדבר החשוב ביותר לזכור הוא למדוד את ריכוזי ה- DNA במדויק פיפטה בזהירות בעת הגדרת תערובת תגובה זו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום ההנדסה המטבולית שמרים לסקר מספר רב של גנים ויחצנים עבור תפוקת מוצר מקסימלית.

rapid-assembly-multi-gene-constructs-using-modular-golden-gate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי לתכנן ולבצע מיקוד מרובבת של משפרי עם החלבון פיוז'ן deactivating SID4X-dCas9-קראב, המכונה גם משפר הפרעה (משפר-i). פרוטוקול זה מאפשר זיהוי משפרי המווסתים ביטוי גנים ואסטמה ומקילה על ניתוח היחסים בין משפרי ויסות גנים מטרה משותפת.

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

. הנה, פשוט, יעיל, בעלת שיטה חסכונית של שיבוט sgRNA מחולקת לרמות.

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

כאן, אנו מציגים מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה בקלות מגה-פלקס gRNA וקטורים עבור גישות CRISPR/Cas9. STAgR הופך gRNA ריבוב פשוטה ויעילה, הניתנים להתאמה אישית.

פרוטוקול ניתן להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), שיטה לבנייה בתפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בדרוזופילה תוך שימוש במשאבי cDNA/ORF הזמינים לציבור. CRISPRmass ניתן ליישם על עריכת ספריות פלסמיד שונות.

הרכבה מודולרית מבוססת CRISPR לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF

מאמר זה מציג פרוטוקול צעד-אחר-צעד המדגים כיצד ניתן להתאים שיבוט מודולרי (MoClo) לשיבוט של אופרון פוליציסטרוני.

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

למד הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להרכבת פלסמידים רב-גניים ביעילות באמצעות ערכת Yeast MoClo.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

גלה סרטונים נוספים