ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes
9 בנובמבר 2020
כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.
שיטת קיבוע השיפוע, בה מבוצעת צנטריפוגה של שיפוע גליצרול בנוכחות מקשר צולב, מסייעת בזיהוי אינטראקציות בין חלבונים הנקשרים באופן חולף לקומפלקסים מרובי תת-יחידות. השימוש בריאגנטים לקיבוע בשיפוע הגליצרול מייצב את קשירת הגורמים הרופפים, ללא היווצרות משקעים, ומאפשר זיהוי האינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם קומפלקסים למחצה מחוברים. ההדגמה של פרוטוקול הקצה עוזרת למשתמשים בפעם הראשונה ללמוד מידע שעשוי להיות קשה להבנה מטקסט כתוב בלבד.
להכנת תמצית כוללת של שמרים, גדל את תאי השמרים המבטאים את אחד מגורמי השחבור המאוחים לתג הברז וליטר אחד של מדיום גלוקוז Y ו-B בתוספת חומצות אמינו או בסיסי גרעין מתאימים. כאשר התרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של אחד, אוספים את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה בשלושה בקבוקי צנטריפוגות של 500 מיליליטר, ושוטפים את התאים פעמיים ב-10 מיליליטר מים סטריליים קרים לכל שטיפה. לאחר השטיפה השנייה, השעו מחדש את התאים בעשירית מנפח התא של מאגר קר A, והקפיאו 50 טיפות מיקרוליטר מתרחיף תאי השמרים בחנקן נוזלי.
לאחר ההקפאה, טוחנים את כדורי התאים הקפואים בשישה מחזורים ב-20 הרץ למשך שלוש דקות במכשיר טחנת כדורים, וטובלים את מיכל התאים הקפואים בחנקן נוזלי בסוף כל מחזור. לאחר המחזור האחרון, הכניסו את הצינורות המכילים את התמציות למים בטמפרטורת החדר עם ניעור מדי פעם. לאחר ההמסה, צנטריפוגה לאיסוף התמציות.
ולכמת את החלבון שהסופרנטנטים נוקו בשיטת BCA. לאחר מכן הקפיאו במהירות את כמות התמציות בחנקן נוזלי לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להכנת שיפוע גליצרול, הוסף ריכוז סופי של 0.1% של החומר הצולב גלוטרלדהיד לתמיסת 30% גליצרול וחוצץ A, וערבב להומוגניזציה.
הוסף שישה מיליליטר של גליצרול קר 10% וחוצץ תמיסת A לצינור צנטריפוגה של 12 מיליליטר והשתמש במזרק מכשיר ראשי שיפוע המצויד במחט ארוכה כדי לשכב את תמיסת הגליצרול גלוטראלדהיד 30% בתחתית הצינור. השתמש בהתקן ראשי של שיפוע כדי ליצור שיפוע גליצרול ליניארי בהתאם למפרט היצרן. שכבה זהירה של 200 מיקרוליטר של גליצרול 7% וחצץ כרית A לחלק העליון של השיפוע לפני הוספת כשני מיליגרם תמצית תאים לחלק העליון של הצינור.
לאחר יצירת שיפוע גליצרול, הנח את הדגימה ברוטור דלי נדנדה מקורר מראש ואסוף את התמצית על ידי צנטריפוגה. בחר את הדגימה מכל צינור דגימה של 12 מיליליטר ב-24,500 שברים של מיקרוליטר, והשתמש במשאבה פריסטלטית כדי לדחוף תמיסת גליצרול של 40% דרך השיפוע של 10 עד 30% מהצינור לאוסף השברים. לאחר מכן טען 50 מיקרוליטר מכל שבר ישירות על ממברנות הניטרוצלולוזה על כתם נקודה, ולאחר מכן הוסף חיץ חוסם, והשתמש בנוגדנים ראשוניים נגד CBP כדי לזהות את החלבון על הכתם החיסוני, ונוגדנים משניים מתאימים לפי הצורך.
בהיעדר קישור צולב CWC 24 מרוכז בין שברים 5 ו-13, המקבילים לקומפלקסים של כ-80 עד 200 מגה-דלטון. עם זאת, בנוכחות המקשר הצולב, המיקום של CWC 24 על השיפוע מועבר לשברים בתחתית השיפוע המתאימים לקומפלקסים גדולים יותר. השוואת שקיעת CWC 24 לזו של יחידת המשנה U5 snRNP, Prp8, ותת-יחידת NTC, Prp19 מגלה ש-CWC 24 מרוכז באותם שברים.
אבל, מכיוון שהוא מתקשר באופן חולף עם הספליסאוזום, הוא קיים גם בשברים הקלים יותר. מעניין ששברים 11 ו-12 הם אלה שבהם Prp8 ו-19 מתחילים להתרכז, מה שמרמז על כך שזהו החלק של השיפוע שבו קומפלקס B Act מתחיל לשקוע. ניתוח כתמים מערביים של שברים 11 ו-12 חושף אותות Prp8 ו-19 כמריחות שבקושי נכנסות לג'ל אקרילאמיד של 8%, מה שמראה שהם אכן חלק מקומפלקסים גדולים.
CWC 24 קיים גם בשבר 12, אך בריכוז נמוך בהרבה, התואם את הקישור החולף שלו לקומפלקס B Act. יחד, תוצאות אלה מראות כי גלוטרלדהיד יכול לשמש כמקשר צולב לייצוב הקישור של גורמים חולפים לתת-קומפלקסים שחבור. ניתן ליישם שיטה זו לחקר כל קומפלקסים של תת-יחידות מוטוריות דינמיות המקושרות באופן חולף לחלק ממרכיביהם, כגון ה-spliceosome.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את שיטת קיבוע הגרדיאנט, המנצלת צנטריפוגת גרדיאנט גליצרול עם קישור צולב כדי לזהות אינטראקציות חולפות בין גורמי ספליסינג למתחם הספליסוזום. השיטה מייצבת אינטראקציות חלבון רופפות ללא יצירת משקעים, ומאפשרת את המחקר על אינטראקציות חלבון ספציפיות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- קיבוע גרדיאנט היא טכניקה המשמשת לחקר אינטראקציות חלבון.
- היא מסייעת בזיהוי אינטראקציות חולפות בתוך מתחמים רב-תת-יחידתיים.
- השימוש בקישור צולב משפר את יציבות האינטראקציות הללו.
- שיטה זו שימושית במיוחד לחקר גורמי ספליסינג.
מטרת המחקר
- להדגים את שיטת קיבוע הגרדיאנט לזיהוי אינטראקציות חלבון.
- לספק פרוטוקול שמסייע למשתמשים ראשונים בהבנת הטכניקה.
- להקל על חקר גורמי ספליסינג בשמרים.
שיטות ששימשו
- צנטריפוגת גרדיאנט גליצרול עם קישור צולב.
- הכנה של תמציות טוטאליות מתאי שמרים המבטאות גורמי ספליסינג.
- איסוף ושטיפת תאי שמרים.
- הקפאה של מתלים תאיים לניתוח נוסף.
תוצאות עיקריות
- השיטה מייצבת בהצלחה אינטראקציות חלבון חולפות.
- זוהו אינטראקציות ספציפיות בין גורמי ספליסינג למתחם הספליסוזום.
- הפרוטוקול נגיש לחוקרים חדשים לטכניקה.
- הדגמת פרוטוקול הסוף מסייעת בהבנה מעשית.
מסקנות
- קיבוע גרדיאנט היא שיטה יעילה לחקר אינטראקציות חלבון חולפות.
- טכניקה זו יכולה לשפר את הבנתנו של מנגנוני ספליסינג.
- היא מספקת כלי חשוב לחוקרים בביולוגיה מולקולרית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Identifying transient protein interactions is critical for target validation in dynamic complexes like the spliceosome, where weak or short-lived associations can be missed by conventional methods. The Grafix (Gradient Fixation) method stabilizes these interactions using glycerol gradient centrifugation with a cross-linker, enabling detection without precipitate formation. This approach supports mechanistic de-risking by clarifying binding partners in disease-relevant systems, improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transient splicing factor interactions that may represent therapeutic targets in RNA-processing pathways.
- Operational Value: Stabilizes weak binders for detection, reducing false negatives in target validation assays.
- Scientific Value: Supports pathway clarification by mapping co-sedimentation of factors like CWC 24 with U5 snRNP and NTC subunits.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares fractionated complexes for downstream analysis via dot blot, enabling quantitative assessment of splicing factor presence.
- Operational Value: Generates reproducible sedimentation profiles that can be standardized across runs for assay consistency.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by isolating subcomplexes in defined gradient fractions for targeted probing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant insight into spliceosome dynamics, which are implicated in cancers and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by stabilizing transient interactions for functional follow-up.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing stable versus transient associations in macromolecular machines.
Pipeline & Workflow Integration
The Grafix method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing of transient interactions before progressing to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about transient splicing factor binding by stabilizing interactions for detection in gradient fractions.
- Screening: Produces assay-ready fractions with standardized glycerol gradients, enabling reproducible compound or factor screening.
- Analytics: Delivers quantitative sedimentation data and co-localization outputs (e.g., CWC 24 with Prp8/Prp19) to compare conditions and assess binding shifts.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying factors whose transient binding may be modulated in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any dynamic sub-unit complex with transient components, not limited to spliceosome.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing transient interactors otherwise lost in standard lysates.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized gradient generation and fractionation, reducing variability across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic ambiguity in multi-subunit target complexes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction networks in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast cell lysis, gradient preparation, and fractionation techniques.
- Depends on access to gradient master devices, swing bucket rotors, and fractionation equipment.
- Necessitates standardization of cross-linker concentration (e.g., glutaraldehyde) to avoid over-stabilization or precipitation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-yeast systems or alternative complexes.
- Includes practical limitations such as potential epitope masking by cross-linking, requiring validation of antibody accessibility post-fixation.
