Name: ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: חקור את שיטת הקיבוע בגרדיאנט לזיהוי אינטראקציות חולפות בין גורמי שחבור לקומפלקס הספלייסוזום ב-Saccharomyces cerevisiae. השיטה משתמשת בצנטריפוגציית גליצרול עם קשר-צולב לייצוב אינטראקציות חלבוניות רופפות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק FAPESP (15/06477-9).

1. הכנת תמצית שמרים
<ol><li>לגדל את תאי שמרים המביעים את אחד הגורמים splicing התמזגו תג TAP9 ב 1 L YNB-דבק מדיה (שמרי חנקן בסיס בתוספת 2% מ '/v גלוקוז) עם חומצות אמינו מתאימות או בסיסים גרעיניים, במקרה זה, אדנין (20 מיקרוגרם / מ"ל), לאוצין (30 מיקרוגרם / מ"ל), טריפטופן (30 מיקרוגרם / מ"ל), עד OD600 = 1.0.</li>
	<li>לאסוף את התאים מתרבות 1 L על ידי צנטריפוגה בשלושה בקבוקי צנטריפוגה 500 מ"ל ב 17,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F) לשטוף פעמיים עם מים סטריליים 10 מ"ל.</li>
	<li>Resuspend תאי שמרים שנאספו ב 1/10 של נפח התא של חיץ קר A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v / v גליצל, 0.5 mmol L-1 DTT, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA).</li>
	<li>להקפיא טיפות קטנות של השעיית תא בחנקן נוזלי. טיפות קטנות ניתן להשיג על ידי pipetting פתרון התא resuspended ושחרור 50 μL ישירות לתוך חנקן נוזלי. אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לפציעות במגע עם העור או העיניים. יש לטפל בשימוש בציוד בטיחות מתאים. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. טיפות קפואות של השעיית התא ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F).</li>
	<li>הכן תאי שמרים lysates על ידי שחיקה בהתקן כדור מיל דרך שישה מחזורים ב 20 הרץ / s במשך 3 דקות. הערה: לאחר כל מחזור, לטבול את המיכל מחסה התאים הקפואים בחנקן נוזלי כדי למנוע נמס. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן לאחסן את התמציות הקפואות ב-80 מעלות צלזיוס. שמרים splicing תמציות יכול להיות מוכן גם באמצעות homogenizers ליסייט spheroplasts10, או באמצעות מרגמה ועלי11,12.</li>
	<li>ממיסים את התמצית על ידי הצבת הצינורות המכילים אותם במים בטמפרטורת החדר, רועד מדי פעם.</li>
	<li>צנטריפוגות תמציות ב 45,000 x g עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>לכמת את תכולת החלבון של supernatant פינה על ידי שיטת BCA13.</li>
	<li>הכן aliquots של תמציות, להקפיא אותם במהירות חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 °C (80 °F). הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>2. הכנת הדרגתי גליצריול
<ol><li>הכן שני פתרונות גליצריל במאגר A, אחד המכיל 10% v/v והשני המכיל 30% v / v גליסול.</li>
	<li>הוסף את סוכן הקישורים glutaraldehyde ל 0.1% v /v בפתרון 30% v / v גליצלול ומערבב הומוגניזציה. אזהרה: יש לטפל בגלוטארלדהיד בתוך מכסה המנוע באמצעות ציוד בטיחות מתאים.</li>
	<li>הוסף 6 מ"ל של פתרון גליסול 10% v / v קר בתחתית צינור צנטריפוגה 12 מ"ל (14 x 89 מ"מ).</li>
	<li>הוסף 6 מ"ל של פתרון גליצריל 30% v/v קר בתוספת גלוטרלדהיד עם מזרק המחובר למחט ארוכה המסופקת עם התקן מעבר צבע מאסטר בתחתית הצינור, ממש מתחת לפתרון 10% v / v גליצל. הערה: לחלופין, פתרון 10% v /v גליצריל ניתן להקפיד בזהירות על החלק העליון של 30% v / v גליסטרול / glutaraldehyde פתרון.</li>
	<li>השתמשו בהתקן 'תבנית מעבר צבע מאסטר' ליצירת מעבר צבע של צפיפות רציפה. הערה: בהתקן מעבר צבע מאסטר, הצינורות ממוקמים בארון תקשורת מתאים ומסתובבים לזמן קצר, בעקבות המלצות היצרן לקביעת הפרמטרים (זמן/ זווית / מהירות). בעבודה זו השתמשנו: 2:25 דקות / 81.5 ° / 11 סל"ד.</li>
	<li>בזהירות להוסיף 200 μL של 7% v / v גליצל / חוצץ כרית על החלק העליון ממש לפני התוספת של תמציות התא. הערה: ריכוז הגליצרול של הכרית חייב להיות נמוך יותר מפתרון הגליצרול הפחות מרוכז המשמש ליצירת מעבר הצבע ליניארי.</li>
</ol>3. צנטריפוגה תמציות
<ol><li>טען כ 2 מ"ג של חלבון הכולל על גבי כל 12 מ"ל שיפוע גליסול ליניארי 10%-30% גלוטרלדהיד עם כרית.</li>
	<li>מניחים את הצינורות ברוטור דלי נדנדה מקורר מראש. הערה: יש לטפל בצינורות בעדינות כדי להימנע מערבוב לפני אולטרה-צנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 194,000 x g עבור 16 שעות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>Aliquot כל צינור 12 מ"ל בעשרים וארבעה שברי μL באמצעות EconoSystem מותאם או על ידי צנרת בקפידה. הערה: EconoSystem מותאם מורכב ממשאבה פרייסטלית, גלאי UV ואספן השבר המחובר למכשיר ניקוב הצינור. ניתן לעקוב אחר פרופיל המשפך על ידי מדידת הספיגה ב- 280 ננומטר.</li>
	<li>השתמש בתמיסת 40% v/v glycerol דרך המשאבה peristaltic כדי לדחוף את הגליצריל 10%-30% הדרגתי מהצינור לאספן השברים. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. יש לאחסן את השברים ב- -80 °C (70 °F) עד לשימוש.</li>
	<li>טען 50 μL של כל שבר ישירות על ממברנות ניטרוצלולוז על כתם נקודה או התקן כתם חריץ. לזהות חלבון על ידי אימונובלוט באמצעות נוגדן נגד CBP (1:6,000, כדי לזהות את החלק CBP של תג TAP) ו IgG אנטי ארנב מצומד עם פרשת Peroxidase (1:15,000) נוגדן משני.</li>
</ol>

<ol><li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409(2019).</li>
<li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li>
<li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GraFix%3A+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li>
<li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafix%3A+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li>
<li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p%2FCef1p%2C+novel+pre-mRNA+splicing+factors%2C+and+snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li>
<li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9, 855-868 (1995).</li>
<li>Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+EA+%22Spliceosomal+Pre-mRNA+Splicing%3A+Methods+and+Protocols.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology</a>. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).</li>
<li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Analalytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li>
<li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li>
<li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mRNA+splicing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

חלבון-חלבון וחומצות ריבונוקלאיות-חלבון אינטראקציות ניתן לייצב באמצעות חומרים crosslinking. חשוב כי המתחם המתקבל יציב לעמוד ultracentrifugation על מעבר צבע גליצריול. בנוסף, תנאי המאגר אמורים לאפשר את האינטראקציה, אך מחמירים מספיק כדי להימנע מאיגוד לא ספציפי. בניסויים המוצגים כאן, השתמשנו בפתרון חיץ שכבר הוקם עבור תגובות15.
המהירות וזמן של צנטריפוגה צריך להיות מותאם עבור המתחמים מנותחים. בדקנו תנאי משקעים שונים, דגימות צנטריפוגה ב 94,000 x g ו 194,000 x g</em...

שכפול הוא תהליך דינמי ביותר הדורש כריכה ושחרור של מספר רב של גורמים באופן מתואם. גורמי חוג אלה כוללים חלבונים מחייבים RNA, ATPases, helicases, קינאז חלבון ופוספטסות, רצועות בכל מקום, בין היתר1,2,3; ולאפשר את הסידורים המולקולריים להתקיים, חלק מהגורמים האלה נקשרים באופן ארעי מאוד לתת-קומפלקסים של spliceosome, מה שהופך את הבידוד והזיהוי של מתחמי ביניים אלה RNP מאתגרים מאוד.
כאן, השתמשנו בשיטת Grafix4,5 כדי לייצב את האינטראקציה של גורם חיבור שמרים Cwc24 עם קומפלקסB act 6 כדי לאפשר זיהוי של גורמים אחרים הקשורים במקביל לתת-קומפלקס זה ולקבוע אם ligase Ubiquitin Prp19 ממלא תפקיד כלשהו בכריכה או שחרור של Cwc24 למתחם תשע עשרה (NTC) ולסוף 5 ' של האינטרון לפני ההפעלה ותגובת הטרנססטרציה הראשונה לוקחת מקום. היתרון של חשיפת macromolecules לריכוז הולך וגדל של crosslinker לאורך שיפוע הגליצריול הוא שהוא נמנע בין מתחמים crosslinks4,5, ולכן, היווצרות של אגרגטים.
שיטה זו שימשה כהשלמה לקוימונופרציפיטציה של חלבון ובדיקות משיכה, שלמרות שאפשרו בידוד של מתחמים גדולים, לא יכול להיות אמין לשמירה על אינטראקציות חולפות בתוך מתחמים דינמיים גדולים7,8. השימוש ריאגנטים קיבעון בשיפוע הגליצריול מייצב את הכריכה של גורמים כאלה, ומאפשר אישור של אינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם subcomplexes חוג. מכיוון שהקישור הנבחר היה בלתי הפיך מבחינה כימית, חלבונים שנמצאים בשברים שנמצאו נותחו על ידי כתם נקודה לאחר צנטריפוגת ההדרגה.

<table><tbody><tr><td>אנטי-קלמודולין קושר חלבון אפיטופ</td><td>Millipore</td><td>07-482</td><td></td></tr><tr><td>ECL אנטי-ארנב IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>EconoSystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1-800-424-6723</td><td>חלקים של EconoSystem בשימוש: משאבה פריסטלטית, גלאי UV ואספן השברים</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז ללא EDTA קוקטייל</td><td>רוש</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>מערכת שחזור שברים</td><td>בקמן קולטר</td><td>270-331580</td><td>מכשיר ניקוב צינורות שהיה מחובר לחלקי EconoSystem</td></tr><tr><td>Gradient Master דגם 107ip</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>טחנת מיקסר MM 200</td><td>Retsch</td><td>207460001</td><td>מכשיר טחנת כדורים</td></tr><tr><td>רוטור F12-6x500Lex</td><td>Thermo Scientific</td><td>096-062375</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>רוטור דלי מתנדנד P40ST</td><td>היטאצ'י</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה CP 80 NX</td><td>היטאצ'י</td><td>901069</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחד (14 x 89 מ"מ)</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td></td></tr></tbody></table>

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

שיתוף טרום-mRNA הוא תהליך דינמי מאוד הכולל סידורים מולקולריים רבים של תת-קומפלקסים spliceosome במהלך הרכבה, עיבוד RNA, ושחרור של הרכיבים המורכבים. צנטריפוגציה הדרגתית גליצל שימשה להפרדת חלבונים או מתחמי RNP (RiboNucleoProtein) למחקרים פונקציונליים ומבניים. כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), אשר פותח לראשונה כדי לטהר ולייצב מתחמים macromolecular עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונים חלקיק יחיד, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי חוג שנקשרים ארעית למתחם spliceosome. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה של דגימות לריכוז הולך וגדל של ריאגנט קיבעון לייצוב מתחמים. לאחר צנטריפוגה של שמרים סה"כ תמציות טעון על שיפועים גליצריול, שברים התאושש מנותחים על ידי כתם נקודה לזיהוי של תת-מתחמים spliceosome וקביעה של נוכחות של גורמי splicing בודדים.

כדי לנתח את פרופיל המשקעים של Cwc24-TAP ולקבוע אם שיטת Grafix הייתה יעילה לייצוב האיגוד שלה לשיתוף תת-קומפלקסים, הפרדנו בין תמציות שמרים כוללות של תאים המבטאים Cwc24-TAP באמצעות צנטריפוגציה על שיפועי גליצול, בנוכחות או היעדר גלוטרלדהיד כסוכן קישור צולב. דגימות של עשרים וארבעה שברי μL 500 נותחו לאחר מכן על ידי כתם חריץ עם נוגדן נגד חלק CBP של תג TAP. התוצאות מראות כי בהיעדר ההצלבה, Cwc24 מרוכז בין שברים 5 ל -13 (איור 1B),המקביל למתחמים של כ 80 עד 200 מד"א14. עם זאת, בנ...

כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

שיטת קיבוע השיפוע, בה מבוצעת צנטריפוגה של שיפוע גליצרול בנוכחות מקשר צולב, מסייעת בזיהוי אינטראקציות בין חלבונים הנקשרים באופן חולף לקומפלקסים מרובי תת-יחידות. השימוש בריאגנטים לקיבוע בשיפוע הגליצרול מייצב את קשירת הגורמים הרופפים, ללא היווצרות משקעים, ומאפשר זיהוי האינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם קומפלקסים למחצה מחוברים. ההדגמה של פרוטוקול הקצה עוזרת למשתמשים בפעם הראשונה ללמוד מידע שעשוי להיות קשה להבנה מטקסט כתוב בלבד.להכנת תמצית כוללת של שמרים, גדל את תאי השמרים המבטאים את אחד מגורמי השחבור המאוחים לתג הברז וליטר אחד של מדיום גלוקוז Y ו-B בתוספת חומצות אמינו או בסיסי גרעין מתאימים. כאשר התרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של אחד, אוספים את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה בשלושה בקבוקי צנטריפוגות של 500 מיליליטר, ושוטפים את התאים פעמיים ב-10 מיליליטר מים סטריליים קרים לכל שטיפה. לאחר השטיפה השנייה, השעו מחדש את התאים בעשירית מנפח התא של מאגר קר A, והקפיאו 50 טיפות מיקרוליטר מתרחיף תאי השמרים בחנקן נוזלי.לאחר ההקפאה, טוחנים את כדורי התאים הקפואים בשישה מחזורים ב-20 הרץ למשך שלוש דקות במכשיר טחנת כדורים, וטובלים את מיכל התאים הקפואים בחנקן נוזלי בסוף כל מחזור. לאחר המחזור האחרון, הכניסו את הצינורות המכילים את התמציות למים בטמפרטורת החדר עם ניעור מדי פעם. לאחר ההמסה, צנטריפוגה לאיסוף התמציות.ולכמת את החלבון שהסופרנטנטים נוקו בשיטת BCA. לאחר מכן הקפיאו במהירות את כמות התמציות בחנקן נוזלי לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להכנת שיפוע גליצרול, הוסף ריכוז סופי של 0.1% של החומר הצולב גלוטרלדהיד לתמיסת 30% גליצרול וחוצץ A, וערבב להומוגניזציה.הוסף שישה מיליליטר של גליצרול קר 10% וחוצץ תמיסת A לצינור צנטריפוגה של 12 מיליליטר והשתמש במזרק מכשיר ראשי שיפוע המצויד במחט ארוכה כדי לשכב את תמיסת הגליצרול גלוטראלדהיד 30% בתחתית הצינור. השתמש בהתקן ראשי של שיפוע כדי ליצור שיפוע גליצרול ליניארי בהתאם למפרט היצרן. שכבה זהירה של 200 מיקרוליטר של גליצרול 7% וחצץ כרית A לחלק העליון של השיפוע לפני הוספת כשני מיליגרם תמצית תאים לחלק העליון של הצינור.לאחר יצירת שיפוע גליצרול, הנח את הדגימה ברוטור דלי נדנדה מקורר מראש ואסוף את התמצית על ידי צנטריפוגה. בחר את הדגימה מכל צינור דגימה של 12 מיליליטר ב-24,500 שברים של מיקרוליטר, והשתמש במשאבה פריסטלטית כדי לדחוף תמיסת גליצרול של 40% דרך השיפוע של 10 עד 30% מהצינור לאוסף השברים. לאחר מכן טען 50 מיקרוליטר מכל שבר ישירות על ממברנות הניטרוצלולוזה על כתם נקודה, ולאחר מכן הוסף חיץ חוסם, והשתמש בנוגדנים ראשוניים נגד CBP כדי לזהות את החלבון על הכתם החיסוני, ונוגדנים משניים מתאימים לפי הצורך.בהיעדר קישור צולב CWC 24 מרוכז בין שברים 5 ו-13, המקבילים לקומפלקסים של כ-80 עד 200 מגה-דלטון. עם זאת, בנוכחות המקשר הצולב, המיקום של CWC 24 על השיפוע מועבר לשברים בתחתית השיפוע המתאימים לקומפלקסים גדולים יותר. השוואת שקיעת CWC 24 לזו של יחידת המשנה U5 snRNP, Prp8, ותת-יחידת NTC, Prp19 מגלה ש-CWC 24 מרוכז באותם שברים.אבל, מכיוון שהוא מתקשר באופן חולף עם הספליסאוזום, הוא קיים גם בשברים הקלים יותר. מעניין ששברים 11 ו-12 הם אלה שבהם Prp8 ו-19 מתחילים להתרכז, מה שמרמז על כך שזהו החלק של השיפוע שבו קומפלקס B Act מתחיל לשקוע. ניתוח כתמים מערביים של שברים 11 ו-12 חושף אותות Prp8 ו-19 כמריחות שבקושי נכנסות לג'ל אקרילאמיד של 8%, מה שמראה שהם אכן חלק מקומפלקסים גדולים.CWC 24 קיים גם בשבר 12, אך בריכוז נמוך בהרבה, התואם את הקישור החולף שלו לקומפלקס B Act. יחד, תוצאות אלה מראות כי גלוטרלדהיד יכול לשמש כמקשר צולב לייצוב הקישור של גורמים חולפים לתת-קומפלקסים שחבור. ניתן ליישם שיטה זו לחקר כל קומפלקסים של תת-יחידות מוטוריות דינמיות המקושרות באופן חולף לחלק ממרכיביהם, כגון ה-spliceosome.

utilization-grafix-for-detection-transient-interactors-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

מאמר זה מתאר את ההליכים הניסיוניים עבור (א) דלדול של U1 snRNP מתמציות גרעיניות, עם אובדן במקביל של פעילות splicing; ותואר (ב) שחזור של פעילות ההצמדה בתמצית U1-מרוקנת על ידי חלקיקי גלקטין-3 - U1 snRNP הקשורים חרוזים בשילוב עם נוגדנים אנטי-גלקטין-3.

השלמת פעילות התרסיס על ידי מתחם גלקטין-3 - U1 snRNP על חרוזים

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

חקור את שיטת הקיבוע בגרדיאנט לזיהוי אינטראקציות חולפות בין גורמי שחבור לקומפלקס הספלייסוזום ב-Saccharomyces cerevisiae. השיטה משתמשת בצנטריפוגציית גליצרול עם קשר-צולב לייצוב אינטראקציות חלבוניות רופפות.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

גלה סרטונים נוספים