Name: זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למד את פרוטוקול הזריעה השלבית של תאי אנדותל ותומכים על פיגומים תלת-ממדיים ליצירת רשתות כלי דם מאורגנות. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של התנהגות כלי דם ומחלות מחזוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך במימון אוניברסיטת מישיגן - שותפות ישראלית למחקר. המחברים מבקשים להודות לאורי מרדלר, ליאור דבי וגליה בן דוד על עזרתם ותמיכתם הרבה, נדין וואנג, Ph.D. ופילאר הררה-פיירו, Ph.D. של מתקן Nanofabrication לוריא באוניברסיטת מישיגן, כמו גם לואיס Solorio, Ph.D. עבור דיונים מאירי עיניים של טכניקות פוטוליטוגרפיה.

<ol><li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).</li>
<li>Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Engineered+Vasculature+within+3D+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2(2018).</li>
<li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+Limits+of+an+in+Vitro+Thick+Prevascularized+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (12), (2005).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li>
<li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li>
<li>Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Bioprinting+for+Vascularized+Tissue+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering%3A+Beyond+Creating+Static+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11, (2012).</li>
<li>Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vasculature+Architectural+effects+on+microcapillary-like+structure+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly.</a> PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+Networks+and+Models%2C+In+vitro+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascularization+for+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microvascular Networks and Models, In vitro Formation.</a> Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Models+of+Vascular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Models of Vascular Functions.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li>
<li>Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+the+vasculature+using+Organ-on-Chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), (2020).</li>
<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li>
<li>Jordahl, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Jet+Writing%3A+Functional+Microtissues+Based+on+Tessellated+Scaffold+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1707196(2018).</li>
<li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li>
<li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003(2018).</li>
<li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li>
<li>Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Trends+in+Information-Driven+Engineering+of+Complex+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems.</a> Advanced Materials. 31 (26), 11806898(2019).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Scaffold+System+for+Studying+the+Effect+of+Local+Geometry+and+Topology+on+the+Development+and+Orientation+of+Sprouting+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels.</a> Advanced Functional Materials. , 1901335(2019).</li>
<li>Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+molecular+discoveries+in+angiogenesis+and+antiangiogenic+therapies+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).</li>
<li>Gui, L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Tissue+Engineering%3A+Building+Perfusable+Vasculature+for+Implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).</li>
<li>Blache, U., Ehrbar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inspired+by+nature%3A+Hydrogels+as+versatile+tools+for+vascular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering.</a> Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).</li>
<li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology%3A+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li>
<li>Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+SU-8+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering.+C%2C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility.</a> Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).</li>
<li>Mathew, R., Ravi Sankar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+on+Surface+Stress-Based+Miniaturized+Piezoresistive+SU-8+Polymeric+Cantilever+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano-Micro+Letters%22%5BJournal%5D)">A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors.</a> Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).</li>
<li>Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinking-based+bioprinting%3A+Examining+crosslinking+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes.</a> Bioprinting. 5, 10-18 (2017).</li>
<li>Redd, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+human+microvascular+grafts+enable+rapid+vascularization+and+increase+perfusion+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8+Photoresist%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">SU-8 Photoresist.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).</li>
<li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-Chip+Systems%3A+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li>
<li>Freiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+endothelial+and+mesenchymal+stem+cells+enhance+vascular+network+formation+on+three-dimensional+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5(2016).</li>
<li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li>
<li>Nguyen, D. -H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li>
<li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li>
<li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li>
<li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185(2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הצורך בכלי דם עשיר בתוך מוטבע ברקמות מהונדסות הוא קריטי לבניית הישרדות ותפקוד תקין1. למרות הנדסת מערכת כלי הדם כבר המוקד של כמות עצומה של מחקר, הרבה נשאר לחקור ולהבין24. בפרט, בעת יצירה מחדש של רקמה ספציפית, microvasculature צריך להתנהג ולארגן בהתאם12. הגישה הנפוצה ביותר ליצירת מיקרו-סלבסלים היא תאי אנדותל ותמיכה בזריעת תאים בתוך סביבה תלת-ממדית מתאימה התואמת לחיבור לתאים, התפשטות והיווצרות כלישיט 25. מתודולוגיה זו גורמת לעתים...

תחום הנדסת הרקמות מתקדם במהירות לקראת ייצור מבנים מהונדסים להחלפת איברים ורקמות חסרים או פגומים1. עם זאת, מבנים מתפקדים במלואם טרם הושגו, בין השאר, שכן יצירת רשתות כלי דם תפעוליות להזנת רקמות נותרה אתגר יוצא מן הכלל. ללא כלי דם נאותים, רקמות מהונדסות מוגבלות להובלת דיפוזיה פסיבית של חמצן וחומרים מזינים, מה שמגביל את עובי הרקמה המקסימלית בת קיימא למגבלת הדיפוזיה, כ -200 מיקרומטר2. עוביים כאלה אינם מתאימים לתיקון פגמים ברקמות גדולות או לייצור איברים מלא, מה שהופך את נוכחותה של רשת כלי דם תפקודית למאפיין חובה לרקמות פונקציונליות ומושתלות3.
מערכת כלי הדם מורכבת ממגוון רחב של כלי דם, בגדלים שונים, פנוטיפים וארגון, הקשורים קשר הדוק לרקמה המארחת. הבנת ההתנהגות, התגובה והחלטות ההגירה המתבצעות על ידי כלי השיט המתפתחים והנבטיים יכולה להורות על שילובם ברקמות מהונדסות4. נכון לעכשיו, הגישה הנפוצה ביותר ליצירת רשתות כלי דם במבחנה היא שילוב תאי אנדותל (ECs) עם תאי תמיכה (SCs, עם היכולת להבדיל לתאי ציור קיר), זרע בתוך מיקרו-סביבה תלת מימדית. סביבה זו מספקת רמזים כימיים ופיזיים כדי לאפשר לתאים לצרף, להתרבות ולהרכיב את עצמם לרשתות כלישיט 2,5,6,7,8. כאשר הם מתרבתים במשותף, SCs מפרישים חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM) תוך מתן תמיכה מכנית למחשבים האלקטרוניים, היוצרים את המבנים הצינוריים. יתר על כן, אינטראקציה צולבת בין שני סוגי התאים לקדם tubulogenesis, כלי נבט והגירה, בנוסף התבגרות SCs ובידול לתוך α חלקה שריר actin-ביטוי (αSMA) תאים ציורי קיר4. פיתוח רשת כלי השיט נחקר בדרך כלל בסביבות תלת מימדיות שנוצרו באמצעות הידרוג'לים, פיגומים פולימריים נקבוביים, או שילוב שלהם. האפשרות השנייה מספקת באותה מידה סביבה ידידותית לתאים ואת התמיכה המכנית הנדרשת הן עבור התאים והן עבור ECM9.
כמות גדולה של עבודה בוצעה כדי לחקור את התפתחות כלי הדם, כולל שיתוף culturing התאים על הידרוג'לים10, הידרוג'לים-פיגומים שילובים11,12, פלטפורמות 2D, והתקנים microfluidic13. עם זאת, הידרוג'לים יכולים להיות מעוותים בקלות על ידי הכוחות המופעלים על ידי התא14, בעוד מערכות דו-צדדיות ומיקרופלואידיות אינן מצליחות ליצור מחדש סביבה קרובה יותר לטבע כדי להשיג תגובה נוספת15,16. הבנת האופן שבו כלי שיט יוצרים מגיבים לסביבתם יכולה לספק תובנה קריטית שעשויה לאפשר ייצור סביבות מהונדסות עם היכולת להדריך את פיתוח כלי השיט באופן צפוי. הבנת תופעות היווצרות כלי דם היא קריטית במיוחד כדי לשמור על קצב עם הופעתה המהירה של טכניקות ייצור בקנה מידה תת-מיקרון, כגון סטריאוליטוגרפיה, ליתוגרפיה הקרנה דיגיטלית, ייצור ממשק נוזלי מתמשך, 3D להמיס אלקטרו jetwriting, פתרון מבוסס 3D אלקטרו סילון כתיבה, וטכניקות bioprinting המתעוררים17,18,19,20,21. יישור השליטה של טכניקות micromanufacturing אלה עם הבנה מעמיקה של ביולוגיה של כלי הדם הוא המפתח ליצירת כלי דם מהונדס מתאים עבור רקמת היעד.
כאן, אנו מציגים מערכת תלת מימדית כדי לחקור את התגובה של כלי להרכיב ונבטים חדשים לגיאומטריית הפיגומים שמסביב, תוך התבוננות במקור הנבטים שלהם ובנדידההבאה 22. על ידי שימוש בפיגומים תלת-ממדיים עם גיאומטריות תאים עם סלקציה, וטכניקת זריעה דו-שלבית, הצלחנו ליצור רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בצורה ברורה וקלה לניתוח. הגיאומטריות הממוקדות מספקות מערכת תפוקה גבוהה עם יחידות בודדות המכילות כלי שיט המגיבים לסביבתם המקומית. באמצעות מחשבים אלקטרוניים צבעוניים, עקבנו אחר מקורות היווצרות נבטים ודפוסי העברה עוקבים, בקורלציה לגיאומטריית התא ולמיקום SCs22.
למרות שהפרוטוקול המוצע הוכן לנתח את ההשפעות של רמזים גיאומטריים על התנהגות כלי הדם, ניתן להרחיב גישה זו וליישם אותה על מגוון יישומים חדשים. הפיגום המוצף והרשתות הניתנות להדפסה בקלות מאפשרים ניתוח פשוט של אינטראקציה בין ECs ו- SCs שונים, תוספת של תאי איברים ספציפיים והאינטראקציה שלהם עם רשתות כלי הדם, השפעת סמים על רשתות כלי דם ועוד. תוצאות המערכת המוצעות שלנו מאוד תכליתי של ייצור ועיבוד פשוטים.

<table><tbody><tr><td>תוכנה חינמית של Angiotool</td><td>NIH-CCR</td><td></td><td>להורדה בחינם ב</td></tr><tr><td>https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home סרום אלבומין בקר Probumin</td><td>Millipore</td><td>82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע של מוך שיניים</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>ECM מדיה + ערכת כדורים</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 96%</td><td>גדות-קבוצה</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>איטום פיברין Evicel</td><td>Johnson& ג'ונסון</td><td>EVB05IL</td><td>מספק גם תמיסות תרומבין וגם פיברינוגן (BAC2)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן עיזים נגד עכבר Cy3</td><td>ג'קסון</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב Alexa-Fluor 488</td><td>Thermo- Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>תאי מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>אנושי פיברונקטין</td><td>סיגמא</td><td>F0895-5MG</td><td>ריכוז מלאי: 1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>להורדה בחינם ב https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>גדות-גרופ</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>מגיב הרמה</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>G112850</td><td>שם מסחרי Omnicoat</td></tr><tr><td>Low-glucose DMEM</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד SMA עכבר</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBS</td><td>ChemCruz</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-vWF נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab9378</td><td></td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון</td><td>עמק הסיליקון מיקרואלקטרוניקה (SVM)</td><td></td> <td>פרוסות 4 אינץ', סוג N-1-10, עובי 500-550 מיקרון</td></tr><tr><td>SU-8 2050 photoresist</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y11058</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 מפתח</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Tryton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>תסמונת 57836</td><td></td></tr></tbody></table>

זריעת תאים stepwise על פיגומים tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

מערכת הלב וכלי הדם היא שחקן מפתח בפיזיולוגיה האנושית, מתן הזנה לרוב הרקמות בגוף; כלי שיט נמצאים בגדלים שונים, מבנים, פנוטיפים וביצועים בהתאם לכל רקמה מפוזרת ספציפית. תחום הנדסת הרקמות, שמטרתו לתקן או להחליף רקמות גוף פגומות או חסרות, מסתמך על אנגיוגנזה מבוקרת כדי ליצור כלי דם נאות בתוך הרקמות המהונדסות. ללא מערכת כלי דם, מבנים מהונדסים עבים לא ניתן להזנה מספקת, אשר עלול לגרום למוות תאים, תחריט לקוי, ובסופו של דבר כישלון. לכן, הבנה ושליטה על ההתנהגות של כלי דם מהונדסים היא אתגר יוצא דופן בתחום. עבודה זו מציגה מערכת תפוקה גבוהה המאפשרת יצירת רשתות כלי שיט מאורגנות וחוזרות על עצמן לחקר התנהגות כלי שיט בסביבת פיגומים תלת-ממדית. פרוטוקול זריעה דו-שלבי זה מראה כי כלי שיט בתוך המערכת מגיבים לטופוגרפיית הפיגומים, ומציגים התנהגויות נבטים ייחודיות בהתאם לגיאומטריית התא שבה שוכנים כלי השיט. התוצאות המתקבלות והבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו ניתן ליישם על מנת ליידע טוב יותר 3D ביו מודפס עיצובים מבנה פיגומים, שבו ייצור של גיאומטריות 3D שונות לא ניתן להעריך במהירות בעת שימוש בהדפסה 3D כבסיס לסביבות ביולוגיות תאיות. יתר על כן, ההבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו עשויה להיות מנוצלת לשיפור סינון תרופות מהיר, ההתפתחות המהירה של מודלים של תרבויות משותפות, וחקירת גירויים מכניים על היווצרות כלי דם כדי להעמיק את הידע של מערכת כלי הדם.

הפרוטוקול המוצג, בטכניקות סטריאוליטוגרפיה, מאפשר ייצור של פיגומים עם טסלה העשויים מפוטורסיסט SU-8. הושגו פיגומים עם גיאומטריות תא נפרדות (ריבועים, משושים ועיגולים) ותכונות מדויקות וחוזרות על עצמן ביותר (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61995/61995fig01.jpg"> איור 1: סריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים מייצגות של הגיאומטריות ...

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לחקור את תהליך היווצרות רשת כלי השיט בצורה ברורה וקלה למעקב, פתיחת הדלתות למחקרים חדשים ושפיכת אור על התנהגות כלי הדם. טכניקה זו מציגה את האפשרות של יצירת רשתות כלי דם מאורגנות מאוד חוזר עם להגיב לסביבה שמסביב. תאים אנדותל מחולים הסובלים ממחלת כלי דם ניתן לאחזר באמצעות מערכת זו, מה שמאפשר לשחזר את מחלת כלי הדם ולמצוא טיפול מתאים.השיטה המוצעת ניתן להרחיב לחקר התנהגות רשת כלי הדם כאשר יחד עם סוגי תאים שונים, המאפשר לבחון את האינטראקציה של כלי פיתוח עם סוג רקמה ספציפי. התחל על ידי שקיעת הפיגומים ב 70% אתנול במשך מינימום של 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים PBS. יש לערבב 1.5 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי פיברונקטין עם 28.5 מיקרוליטרים של PBS לפיגום.הכן דילול פיברונקטין אחד שישמש עבור כל הפיגומים כדי למנוע שגיאות pipetting. מניחים את הפיגומים בדלילות על גבי משטח הידרופובי ומכסים כל פיגום עם 30 מיקרוליטרים של דילול פיברונקטין. החלף את מכסה הלוח והכנס את הפיגומים המכוסים בפיברונקטין לאינקובטור שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס ולחות של 100% למשך שעה לפחות.לאחר הדגירה, לשטוף קלות את הפיגומים PBS כדי להסיר שרידים fibronectin. הפיגומים יכולים להישמר ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. הכן תא אנדותל או מדיום EC על ידי ערבוב המדיום הבסיסי עם רכיבי הערכה הבינונית המתאימים, כולל פתרון אנטיביוטי, FBS, ותוספי צמיחת תאי אנדותל כפי שצוין על ידי היצרן.הפוך את ההשעיה תא אנדותל microvascular שומן אנושי במדיום EC עם ריכוז של ארבעה מיליון תאים למיליליטר. בעזרת מלקחיים, מניחים פיגום אחד מצופה פיברונקטין לבאר בצלחת 24 באר שאינה TC. מכסים כל פיגום ב-25 טיפות מיקרוליטר של השעיית התא, ומוודאים שלא ניתן להשעיה לזרום הרחק מהפיגום.שים את המכסה על הצלחת ומניחים אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו 100% לחות במשך 60 עד 90 דקות. לאחר הדגירה, מלאו כל באר ב-700 מיקרוליטרים של מדיום EC. דגירה פיגומים אנדותל עד מפגש EC ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או במשך שלושה ימים.לשנות את המדיום כל יומיים. הכן מדיום DPSC על ידי ערבוב 500 מיליליטר של DMEM גלוקוז נמוך, 57.5 מיליליטר של FBS, 5.75 מיליליטר של חומצות אמינו לא חיוניות, 5.75 מיליליטר של גלוטמקס, ו 5.75 מיליליטר של פתרון פניצילין סטרפטומיצין-נייסטטין. מעבירים את הפיגומים עם האנדותל לצלחת חדשה שאינה TC 24 באר.השלך את כל המדיה מהצלחת הנוכחית באמצעות פיפטה או יניקת ואקום, מקפיד לא להחיל ואקום ישירות על הפיגום. מניחים פיגום אחד במרכז כל באר, ואז לייבש את האזור שמסביב עם ואקום קל. לדלל פתרונות מלאי תרומבין ופיברינוגן עם PBS לריכוז סופי של חמש יחידות למיליליטר ו 15 מיליגרם למיליליטר בהתאמה.הכינו השעיה של שמונה מיליון DPSC למיליליטר בדילול תרומבין והפיצו 12.5 מיקרוליטרים של המתלים למיקרו-צינורות בודדים לפיגום שייזרעו. הגדר פיפטה של 5 עד 50 מיקרוליטר ל-12.5 מיקרוליטר ומלא אותה בתמיסת פיברינוגן. מבלי להסיר את הקצה, הגדר את הפיפט ל-25 מיקרוליטרים.החומר בקצה צריך לעלות ולהשאיר נפח ריק. לחץ לאט על כפתור הכועף עד שהנוזל מגיע לפתיחת הקצה, אך אינו דולף החוצה. החזק את הוכנה במצב זה ולשים את הקצה לתוך אחד הצינורות microcentrifuge המכילים את התאים המתלים תרומבין, לוודא את הקצה הוא במגע עם הנוזל.שחרר בעדינות את לחצן הכועף ומשוך את המתלה של התא לקצה. ביסודיות לערבב את שני החומרים, הימנעות היווצרות בועה. מחלקים במהירות את החומרים המעורבים על גבי פיגום אנדותל.חזור על השלבים הקודמים עבור כל פיגום, הקפד לשנות טיפים בין שימושים כדי למנוע היווצרות ג'ל פיברין בלתי צפוי בתוך הקצה. החלף את מכסה הצלחת ודגר את הפיגומים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-100% לחות למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, מלאו כל באר במיליליטר אחד של DPSC אחד לאחד ובינוני EC.תרבות לשבוע אחד, שינוי המדיום כל יומיים. בנקודות זמן שונות במהלך התרבות, להסיר את המדיום מן הבאר תמונה המבנים באמצעות מיקרוסקופ confocal ללמוד את התפתחות כלי הדם או כל פרמטר אחר של עניין. פרוטוקול זה מאפשר ייצור של פיגומים tessellated עשוי SU-8 photoresist.הושגו פיגומים עם גיאומטריות תא נפרדות ותכונות מדויקות וחוזרות על עצמן. עם זריעה סימולטנית מסורתית של תאי אנדותל ותאי תמיכה, התאים הופצו באופן הומוגני על הפיגום וכתוצאה מכך רשתות כלי דם בלתי צפויות ולא מאורגנות. להיפך, זריעת תאים חורגת הביאה לרשתות כלי דם מאורגנות מאוד.בעת שימוש בתאי אנדותל פלואורסצנטיים, ניתן לדמות את כלי הדם בזמן אמת. חלבון פלואורסצנטי אדום המבטא תאי אנדותל היה מתורבת על פיגומים משושים ודימוי. תאי התמיכה נוספו ביום הראשון ורשתות כלי הדם צולמו כל יומיים כדי לכמת את התפתחות כלי השיט.עבור כל נקודת זמן, תמונות רחבות של הפיגום כולו נלקחו. צמיחת כלי השיט כמתה כאורך כלי שיט ושטח כוללים. בוצעה הדמיה קונפוקלית של זמן לשגות כדי לאפשר מעקב אחר כלי שיט יחיד באמצעות תאי אנדותל צבעוניים.נתיב הספינה נוצר מהזמן לשגות, מה שמאפשר לצפות בנדידת כלי שיט. התבגרות כלי נצפתה על ידי נוכחות של actin שריר חלקה ותאי תמיכה. עבור התאים המעגליים, המשושה והמרובעים, התאים מתרבים ומתארגנים למבנים.ביום השביעי, כל הצורות הראו רשת כלי דם עשירה ומורכבת. תמונות הגדלה גבוהות יותר חשפו אקטין שרירים חלק צפוף יותר ונוכחות תא תמיכה במשותף עם כלי נוצר, מעורר גיוס תא תמיכה ובידול סביב מבני כלי הדם. טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את ההתנהגות של רשתות כלי דם תלת מימדיים כאשר נחשפים לתנאים שונים, כגון מעכבי תאים ספציפיים או בנוכחות סוגי תאים נוספים.

stepwise-cell-seeding-on-tessellated-scaffolds-to-study-sprouting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

פרוטוקול צעד אחר צעד גמישה, תקופה ארוכה ניטור התהליך של שיפוץ כלי הדם והשפלה לגרדום בתרבות בזמן אמת של מתכלה פולימריים מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם עם גירוי פועמת באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית מתואר כאן.

ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

שיטה זו מתארת את התרבות של תאים מבוססי iPSC-נגזרות כמו 40 מיקרוכלי תלת-ממד של מיקרו בפלטפורמת microfluאידיג מתוקננת. פלטפורמה זו מאפשרת לימוד של לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי ב-3D, כולל השקה וייצוב של נבטי האנגיוגנטי באופן מדרגי ותפוקה גבוהה.

שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

מאמר זה מפרט את השלבים הדרושים כדי לזרוע שורות תאי נוירובלסטומה על פיגומים תלת-ממדיים מבוססי קולגן שתוארו קודם לכן, לשמור על גדילת התאים למסגרת זמן שנקבעה מראש, ולאחזר פיגומים עבור מספר ניתוחים של צמיחת תאים והתנהגות תאים ויישומים במורד הזרם, הניתנים להתאמה כדי לספק מגוון מטרות ניסוי.

מודל ביומימטי תלת מימדי במבחנה של נוירובלסטומה באמצעות פיגומים מבוססי קולגן

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של כלי דם המארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומושרים פלוריפוטנטים. רשתות כלי דם אלה מציגות רשת אנדותל נרחבת ומחוברת המוקפת בפריציטים, אקטין שריר חלק וקרום מרתף רציף.

יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

הנבטת אנגיוגנזה, הבסיסית להתפתחות ומחלות, כרוכה בתהליכים מולקולריים ומכניים מורכבים. אנו מציגים מודל 2.5D ex vivo רב-תכליתי המנתח נביטה תאית מעורקי הצוואר החזיריים, וחושף אנגיוגנזה תלוית קשיחות ומכניקת תאים מובילה-עוקב מובהקת. מודל זה מסייע בקידום אסטרטגיות הנדסת רקמות וגישות לטיפול בסרטן.

מודל 2.5D לאפיון מכני ex vivo של אנגיוגנזה מונבטת ברקמה חיה

למד את פרוטוקול הזריעה השלבית של תאי אנדותל ותומכים על פיגומים תלת-ממדיים ליצירת רשתות כלי דם מאורגנות. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של התנהגות כלי דם ומחלות מחזוריות.

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

גלה סרטונים נוספים