יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

פרוטוקול זה מתארך באופן שגוי את השינוי של ההטבעה הגנומית בתאי גזע עובריים של עכברים הפלואידים, כפי שהנבדק שלנו נובע מזרע כוזב, המאפשר יצירת עוברים בגידול ביתי בעכברים. השינוי הגנטי של גמט דורש בדרך כלל טכניקות קשות. באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן לתפעל גמטות הוריות בתאי גזע עובריים היברידיים להחדרה לאחר מכן לעכברים כאופציה להחלפת זרע.

מכיוון ששיטה זו מאפשרת שינוי ספציפי מלאכותי של גמט אבהי בעוברים, היא ישימה במיוחד לחקר הטבעה גנומית וצריבה. מי שידגים את ההליך הזה יהיה צ'ארלס אטיין דומו, אמבריולוג עכברים מהמעבדה שלי. כדי להכין פיפטות אחיזה ומיקרו-הזרקה לניסוי, ראשית, השתמש במושך מיקרופיפטות כדי למשוך נימי זכוכית בורוסיליקט בעלי צורה מוארכת והתחדדות הדרגתית.

להכנת פיפטות אחיזה, מקם נימים משוכים בקוטר חיצוני של 60 עד 100 מיקרומטר במיקרו זיוף מעל חרוז הזכוכית על הנימה. הפעל את החוט והורד את הנימים עד שהוא יוצר קשר עם החרוז. כאשר הנימים נצמדו לחרוז, כבו את החוט ומשכו את הנימים, מה שגורם לנימים להישבר בקצה ישר.

לאחר מכן, מקם את קצה הנימים השבור אופקית ליד חרוז הזכוכית על החוט וחמם את החוט כדי להמיס את הקצה עד שהקוטר הפנימי של קצה הנימים מגיע לקוטר של 10 עד 20 מיקרומטר. לאחר מכן מקם את הנימים מעל חרוז הזכוכית כמילימטר אחד מהקצה וחמם את החוט כדי לאפשר לכופף את הנימים לזווית של 20 מעלות. להכנת פיפטה מיקרו הזרקה, מקם נימים משוכים בקוטר חיצוני של כשישה מיקרומטר מעל חרוז הזכוכית על החוט המחומם והורידו את הנימים עד שהוא נוגע בחרוז.

לאחר חיבור הנימים, כבה את החוט והחזר את הנימים. הנימים יישברו בקצה ישר. לאחר מכן העבירו את הנימים מעל חרוז הזכוכית כמילימטר אחד מקצה הנימים וחממו את החוט כדי לאפשר לכופף את הנימים לזווית של 20 מעלות.

לביצוע הזרקה תוך ציטופלזמית, הניחו חמש טיפות מיקרוליטר של תמיסת PVP ו -20 טיפות מיקרוליטר של מדיום M2 על המכסה ההפוך של צלחת בגודל 10 סנטימטר וכסו את הטיפות בשמן מינרלי. הניחו את המנה על הבמה והתקינו פיפטה אחיזה על המיקרומניפולטור. השתמש בקצה מעמיס מיקרו כדי למלא את פיפטת המיקרו-הזרקה בשמן פלואורוקרבון ולהרכיב את הפיפטה על מפעיל הפיזו.

תוך התבוננות דרך המיקרוסקופ, הורד את פיפטת המיקרו-הזרקה לטיפה של תמיסת PVP. כאשר הפיפטה טובלת, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לצפות את הזכוכית ב-PVP. טען נפח קטן של תמיסת PVP לתוך פיפטת המיקרו-הזרקה.

טבלו את המיקרו-הזרקה והחזקת פיפטות במדיום M2 והתמקדו בפיפטה בתחתית הטיפה. העבירו כשני מיקרוליטר של תרחיף תאי ה-ES הפרתוגני הכפול לתוך הטיפה הבינונית M2 והשתמשו בפיפטה בפה כדי להעביר 10 ביציות M2 לאותה טיפה. סובב ביצית אחת והפעל לחץ שלילי דרך פיפטת האחיזה כדי להחזיק את הביצית כך שהחלל הפריוויטלין יפנה לפיפטה המיקרו-הזרקה, תוך הקפדה על כך שהצלחת המטאפאזה השנייה לא תמוקם בנתיב של פיפטת המיקרו-הזרקה.

צייר תא ES פרטוגני כפול אחד לקצה פיפטת המיקרו-הזרקה ואשר את הקרע של קרום התא. הפעל לחץ שלילי קל על פיפטת המיקרו-הזרקה והעביר ארבעה דחפי פיזו תוך דחיפת קצה פיפטת המיקרו-הזרקה לכיוון החלל הפריוויטליני כדי לפרוץ את ה-zona pellucida. חדור לביצית עם פיפטה מיקרו-הזרקה כך שהאולמה נמתחת לצד הנגדי והפעל דופק פייזו אחד כדי לנקב את האולמה, וודא שהאולמה היא נרגעת לאורך הפיר של פיפטת המיקרו-הזרקה.

הזרקו את תא ה-ES הפרתוגני הכפול עם נפח מינימלי של מדיום לתוך האופלזמה ומשכו את פיפטת המיקרו-הזרקה בצורה חלקה מהביצית. שחרר את הביצית המוזרקת מהפיפטה המחזיקה והעביר אותה לצד המיקרו טיפה לאיסוף מאוחר יותר. לאחר שכל הביציות הוזרקו, העבירו את הביציות לצלחת באר מרכזית שחוממה מראש המכילה מדיום KSOM ודגרו על המנה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה לפני ההפעלה.

ניתוח תכולת ה-DNA של קו תאי ES פרתוגני כפול מייצג זה, הנושא את הטרנסגן CAG/EGFP על ידי ציטומטריית זרימה, ממחיש את התפלגות התאים ההפלואידים והדיפלואידים בשלבים G0, G1, S ו-G2 M. ניתן לבצע גנוטיפ כדי לאשר את היעדרם של אללים מסוג בר באזורים H19 ובאזורים בין-גניים עם מתילציה דיפרנציאלית. ניתן להכניס טרנסגן CAG/EGFP לתאי ES פתוגניים כפולים כדי לחקור את תרומתם לעוברים משובטים למחצה על ידי הדמיה של פלואורסצנציה ירוקה תחת מיקרוסקופ.

ניתוח ציטומטריית זרימה מראה שתי אוכלוסיות המתאימות לשלב G2 M עצרו תאים הפלואידים ודיפלואידים לאחר טיפול בדמוקלקן. היעדר שיא הפלואיד 1N מצביע על כך שמחזור המנוחה של התא הושלם ברובו. לאחר ההזרקה, ביטוי EGFP מתגלה לעתים רחוקות בעוברים המשובטים למחצה הבנויים.

כאשר הציטופלזמה של תאי ES פרתוגניים כפולים מתפזרת לתוך הציטופלזמה הגדולה של הביצית. שש שעות לאחר ההפעלה ניתן לצפות בעד שלושה גופים קוטביים תחת המיקרוסקופ. הגוף הקוטב הראשון והשני של הביצית וגוף פסאודו קוטבי אחד מה-ESC הפלואידי.

כדי להדגים את יכולתם ההתפתחותית, ניתן לתרבית עוברים משובטים למחצה לשלב הבלסטוציט. יתר על כן, ניתן להשיג עכברים נקבות לטווח מלא מעוברים משובטים למחצה בשלב שני תאים המועברים לביציות של נקבות מקבלות. במהלך הזרקת מיקרו חשוב לקרוע את קרום הפלזמה של תאי גזע עובריים הפלואידים מכיוון שהוא נכנס כדי למנוע הפרדת כרומוזומים כאשר הביצית מופעלת.

במקום תאי ES הפלואידים פרתנוגנטיים, ניתן להשתמש גם בתאי ES הפלואידים אנדרוגניים. מה שמאפשר לבחור את הגמט האימהי או האבהית כתחליף הזרע בהתאם למטרת המחקר.