Name: יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למד שימוש בתאי גזע עובריים הפלואידים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע ביצירת עוברים חצי-משובטים בעכברים. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית של גמטות ומחקר הדפסה גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד"ר ג'וליו די מינין על הפקת קווי phaESC וד"ר רמו פריימן על ניתוח ציטומטריית זרימה. אנו גם מכירים בגברת מיכל שפנר ומר תומאס מ. הנאק על תמיכה טכנית בהעברת עוברים. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ (מענק 31003A_152814/1).

<ol><li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+genetic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li>
<li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice%3A+A+decision+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li>
<li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072(2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li>
<li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li>
<li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li>
<li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li>
<li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
<li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li>
<li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li>
<li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li>
<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li>
<li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+genome%3A+role+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+Supplement%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li>
<li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350(2019).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיבוט של יונקים על ידי העברה גרעינית תא סומטי (SCNT) כבר חלוץ בשנות ה-90 19,20,21. התפתחויות אלה בעקבות מחקרי שיבוט שנערכו 30 שנה קודם לכן דו-חיים22. העיכוב הניכר משקף את הקושי באמברולוגיה ובהטבעה גנומית ביונקים. הפיתוח של SCNT יונקים הוא הבסיס ליישום של haESC להחלפת זרע, אשר מפורט בפרוטוקול זה.
סינכרון מחזור התא הוא גורם חשוב להצלחת SCNT23. זה גם המקרה להזרקה של haESC בפרוטוקול זה. החדרת גנום תורם לנמען דורשת להתאים את שלבי מחזור התא כדי למנוע שבירה כרומוזומלית או aneuploidies שיבטל את התפתחות העובר. שיבוט למחצה יש את המורכבות הנוספת כי שני גנומים ציטופלסט צריך להיות תואם. דו"ח קודם הוכיח כי הזרקה של M-שלב נעצר אנדרוגנטיקה haESCs הניב שיעור התפתחותי טוב יותר של עוברים משובטים למחצה מאשר הזרקה של G1-שלב haESCs לתוך ביציות7. דוח זה מציע M-phase כנקודת סינכרון מתאימה לשכפול למחצה. בהתאם לכך, phaESCs נעצרו במיטוזה עם demecolcine והוזרק לתוך ooplasm של ביציות MII, אשר נעצרו באופן טבעי מטפאאז השני של מיוזיס. חשוב לציין, מעצר שלב M יכול להיות מושגת ב- ESCs העכבר ביעילות גבוהה, מתן סנכרון מעולה בין מחזורי תא התורם הנמען.
במהלך המיטוזיס, הקרום הגרעיני מתפרק וצורות ציר שאליהן מתחברים הכרומוזומים המשוכפלים. לאחר הזרקת DKO-phaESCs שלב M, כרומטידים אחות מופרדים לתוך גוף קוטב מדומה ואת zygote7 (איור 3E). כתוצאה מכך, קבוצה אחת של כרומוזומים מ- DKO-phaESC תורמת לעובר המשובט למחצה. זה קריטי כי כרומטידים אחות של כרומוזומי DKO-phaESC ניתן להפריד כראוי לאחר הזרקה. קרום הפלזמה של DKO-phaESC שלם מונע הפרדה לגוף קוטב מדומה. אכן ראינו מקרים נדירים שבהם קרום הפלזמה של DKO-phaESCs לא נקרע, ועוברים הציגו DKO-phaESCs שלמים באופלזמה לאחר ההזרקה(איור 3D). לכן, יש להקפיד להסיר את קרום הפלזמה של DKO-phaESCs על ידי pipetting. במהלך ההזרקה, חשוב באותה מידה כדי למנוע את ההפרעה של ציר meiotic של ביצית, אשר יכול להוביל פגמים בהפרדה כרומוזום לגרום aneuploidy גם כן.
ביונקים, הטבעה גנומית מגבילה את היישום של phaESCs כתחליף זרע. haESCs הפרתנוגנטיים יש תצורה אימהית של הטבעות גנומיות, ואילו הזרע יש תצורה אבהית. לכן, הדור של גורים לטווח מלא לא התרחשה לאחר הזרקת phaESCs סוג פראי כתחליף זרע. כדי להתגבר על מגבלה זו, מחיקות של IG- ו- H19-DMRs מתוכננות ב- phaESCs. שינוי של ביטוי מוטבע ב Igf2-H19 האימהי ו Gtl2-Dlk1 loci מספיק כדי לשנות את התצורה של הטבעות גנומיות המאפשר הדור של עכברים משובטים למחצה בתדירות של מעל 5.1%, בהתבסס על עוברים 2 תאים שהועברו. תצפיות אלה מצביעות על כך שהתמקדות בשני גנים מוטבעים מעבירה את הגנום של phaESCs לתצורה אבהית תפקודית שיכולה להחליף זרע בעכברים. עם זאת, נדרש שינוי גנטי קבוע של ה- phaESCs עבור אסטרטגיה זו. כאסטרטגיה חלופית, ניתן לשקול haESC אנדרוגנטי. ה-HAESCs האנדרוגנטיים נגזרים מגנום הזרע ובעלי הטבעות אבהיות. היו דיווחים כי haESCs אנדרוגנטיים wildtype תרמו כתחליף זרע כדי ליצור גורים לטווח מלא בתדירות בין 1.3% ו 1.9% של עוברים שהועברו4,7,24. גורים לטווח מלא התקבלו גם על ידי הזרקת haESCs אנדרוגנטיים עם מחיקות של IG- ו H19-DMRs בתדירות של 20.2% של עוברים 2 תאים שהועברו24. היעילות המוגברת של שיבוט למחצה באמצעות haESCs אנדרוגנטית שונה סביר כי הטבעות יכול להיות לא יציב בתרבות. פגמים בהטבעה מתוקנים על ידי מחיקות גנטיות של DMRs קריטיים.
בהתחשב בקושי בהחדרת שינויים גנטיים ישירות לתוך גנום ביצית או זרע, haESCs הם כלי רב ערך למניפולציה הגנום ההורי בנפרד. שימוש ב- haESCs כתחליף לזרע מספק יתרון יוצא דופן לעריכת גנום בחיידק העכבר. מחקר שנערך לאחרונה שילב עריכת גנום מבוסס CRISPR /Cas9 עם היישום של haESCs לאפיון אזורי הטבעה שהם קריטיים להתפתחות עוברית12. מחקר זה ניתח את התפקיד של Rasgrf1-DMR בשילוב עם H19-ו- IG-DMRs בפיתוח של עכברים דו-מטרניים, ואת הפונקציה של 7 DMRs שונים בהתפתחות של עכברים דו-קוטביים. השיטה להחלפת haESCs לזרע היוותה את הבסיס לגישות סינון גנטי לזיהוי חומצות אמינו מרכזיות בתוך חלבון DND1 בהתפתחות תאי נבט ראשוניים ולזיהוי גנים בהתפתחותהעצם 24,25,26. מחקרים על הטבעה גנומית והקרנה גנטית כדי לזהות גורמי מפתח בהתפתחות העוברית הם גישות ניכרות ליישום של haESCs כמו גנומים גמטיים.

ביונקים, גמטות הן התאים היחידים שמעבירים מידע גנטי לדור הבא. היתוך של ביצית וזרעון יוצר זיגוטה דיפלואידית המתפתחת לחיה בוגרת. מוטציות בגנומים גמטיים עוברות בירושה לצאצאים ונוהגות וריאציה גנטית במינים1. מבוא של מוטציות הנבט הוחל לייצר בעלי חיים מהונדסים גנטית למחקרים ביולוגיים מגוונים כולל אפיון של תפקוד גנים ומידול מחלות. הן ביציות והן זרעונים הם תאים מובחנים סופניים ומתמחים מאוד שהפסיקו את התפשטותם. לכן, שינוי ישיר של gametes הוא קשה מבחינה טכנית, וגישות מיוחדות פותחו. שינויים גנטיים ניתן להכניס לתוך נבט העכבר על ידי הזרקת ESCs מהונדסים גנטית לתוך blastocysts, שם הם משתלבים העובר המתפתח ליישב את הנבט. בנוסף, שינוי גנטי של זיגוטים באמצעות גישות עריכת גנום, כולל מערכת CRISPR / Cas9,הפך מאומץנרחב 2 .
לאחרונה דווח על גישה יוצאת דופן, המיישמת haESCs כתחליף לגנום גמטי3,4,5,6,7,8. HaESCs הם קווי תאי גזע הנגזרים ממסת התא הפנימית של בלסטוציסטים הפלואידיים פרתנוגנטיים או אנדרוגנטיים ובעלי קבוצה אחת של כרומוזומים4,7,9,10. הוכח כי הן haESCs parthenogenetic ו אנדרוגנטית יכול לתרום הגנום של עכברים משובטים למחצה לאחר הזרקה intracytoplasmic לתוך ביציות. בניגוד לגישות אחרות, הגנומים של haESCs ניתן לשנות ישירות בתרבות בשל יכולת ההתחדשות העצמית שלהם. החדרת שינויים גנטיים לתוך הנבט על ידי החלפת זרע עם haESCs היא שיטה חשובה למחקרים ביולוגיים. הוא מספק אפשרות בנפרד תרבות ולתפעל את הגנום האימהי או האבהי, אשר נגזרים haESCs parthenogenetic או אנדרוגנטית, בהתאמה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב- HaESCs כתחליף גנום גמטי, אשר יתרון במיוחד עבור מחקרים של הטבעה גנומית, ביטוי ספציפי לאל ותהליכים ספציפיים להורים.
בעכברים, מידע גנומי אימהי וגברי נדרש להתפתחות עוברית תקינה11. לכן, גורים לטווח מלא לא ניתן היה להשיג כאשר haESCs פרתנוגנטיים מסוג בר (phaESCs) הוזרקו להחליף את הגנום הזרע5,8. כדי להתגבר על הבלוק ההתפתחותי, יש לתקן את ההטבעה הגנומית הגנומית האימהית של ה- haESCs הפרתנוגנטיים לתצורה אבהית. זה יכול להיות מושגת על ידי מניפולציה של אזורים מתילציה דיפרנציאלית (DMRs). עד כה, מחיקות ממוקדות של H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR, ו Rasgrf1-DMR נחקרו כדי להדחיק גנים מבוטאים אימהית ב phaESCs3,5,8,12. מחקרים אלה הראו כי מחיקות של H19-DMR ו- IG-DMR מספיקות כדי להמיר אימהי לתצורת חותם אבהי שיכולה להחליף כרומוזומי זרע. הזרקה תוך-טופלסמית של phaESCs הנושאים את שתי מחיקות DMR לתוך ביציות הניבו גורים משובטים למחצה בתדירות שבין 5.1% ל -15.5% מהעוברים הדו-תאיים שהועברו.
פרוטוקול זה מבוסס על היישום של phaESCs עם מחיקות של H19-DMR ו- IG-DMR, אשר אנו במונח כפול נוקאאוט phaESCs (DKO-phaESCs). אנו מספקים הוראות מפורטות לשינוי ההטבעה הגנומית ב- phaESCs כדי להקים קווי DKO-phaESC, להזרקת DKO-phaESCs לביוציטים כתחליף לגנום זרע, לתרבות של עוברים משובטים למחצה לבסטוציסטים, ולקבלת עכברים משובטים למחצה. פרוטוקול זה הוא התייחסות לחוקרים הזקוקים למניפולציה מדויקת וישירה של הגנום האבהי ודור של עוברים ועכברים משובטים למחצה.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל תרבית</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>מ"ל תרבית ESC</td></tr><tr><td>15 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td></td><td>188271 תרבית ESC</td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>150628</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>142475</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>140675</td><td>תרבית ה-ESC</td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>תרמו מדעי</td><td>167008</td><td>תרבית ESC</td></tr> <tr><td>ובטא;-מרקפטואתנול</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>שבר BSA</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>תרבית</td></tr><tr><td>ESC תמיסת Demecolcine</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>תרבית</td></tr><tr><td>ESC DMEM</td><td>גיבקו</td><td>41965-039</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>גיבקו</td><td>11320-033</td> עכבר <td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>DR4</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>3208</td><td>haESC תרבית</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC תרבית</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC תרבית</td></tr><tr><td>מדיום הקפאה</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC תרבית</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC</td></tr><tr><td>תרבית Hepes תמיסת</td><td>Hepes Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC תרבית</td></tr><tr><td>MEF מוקרנת</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC תרבית</td></tr><tr><td>LIF (גורם מעכב לוקמיה)</td> <td>(תוצרת בית)</td><td>-</td><td>haESC</td></tr><tr><td>מגיב ליפופקציה</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC תרבית</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC</td></tr><tr><td>תרבית PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC</td></tr><tr><td>תרבית עט Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC</td></tr><tr><td>תרבית חזיר פלסמיד הנושא CAG-EGFP טרנסגן</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC</td></tr><tr><td>תרבית חזירBac טרנספוזאז פלסמיד</td><td>מערכת Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>תרבית</td></tr> <tr>ESC<td>pX330 פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>pX458 פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>גיבקו</td><td>15090-046</td><td>תרבית ESC</td></tr><tr><td>DNA פולימראז</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>גנוטיפ</td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור</td><td>פלקון</td><td>352063</td><td>זרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור עם מכסה מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow Cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow Cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>קודן</td><td>62.1640</td><td>סופר-ביוץ</td></tr><tr><td>30-מד 1/2 אינץ' מחט</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 עכבר</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>100006</td><td>סופר-ביוץ</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD בריאות בעלי חיים</td><td>49451</td><td>סופר-ביוץ</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td>10010015-Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 יחב"</td>ל <td>סופר ביוץ</td></tr><tr><td>צלחת 10 ס"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>צלחת 4 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>227261</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>צלחת 6 ס"מ</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>150288</td><td>מניפולציה</td></tr> <tr>של עוברים<td>צלחת באר מרכזית</td><td>קורנינג</td><td>3260</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>נדנדה דיגיטלית</td><td>תרמו מדעי</td><td>88880020</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>M16 בינוני</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>M2 בינוני</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>סטרונציום כלוריד</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>מניפולציה של עובר</td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט מוצר</td><td>מדעי</td><td>GB100T-8P</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>CellTram 4r שמן</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>פלואורינרט FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מחזיק פיפטה</td><td>מכשירים ביו-רפואיים-מיקרוסקופ</td><td></td> הפוך <td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td></td><td>ניקון</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מיקרו-הזרקה מיקרו-הזרקה</td><td>מכשירים ביו-רפואיים</td><td></td> <td>מיקרו-מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מיקרו-טיפים מיקרולאודר</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>זרועות מיקרומניפולאור</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>חולץ מיקרו-פיפטה מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td></td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-1000</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>PVP (פוליוויניל פירולידין)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td> מסנן מזרק <td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td></td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>מיקרו הזרקה</td></tr></tbody></table>

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

באורגניזמים עם רבייה מינית, תאי נבט הם המקור לתאים totipotent המתפתחים לאנשים חדשים. בעכברים, הפריה של ביצית על ידי זרעון יוצר זיגוטה totipotent. לאחרונה, מספר פרסומים דיווחו כי תאי גזע עובריים haploid (haESCs) יכול להיות תחליף גנומים גמטיים ולתרום עוברים, אשר מתפתחים לעכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליישם haESCs parthenogenetic כתחליף של זרע כדי לבנות עוברים על ידי הזרקה intracytoplasmic לתוך ביציות. פרוטוקול זה מורכב שלבים להכנת haESCs כתחליף זרע, להזרקת כרומוזומי haESC לתוך ביציות, ולתרבות של עוברים משובטים למחצה. העוברים יכולים להניב עכברים פוריים משובטים למחצה לאחר העברת העובר. שימוש ב- haESCs כתחליף זרע מקל על עריכת הגנום בחיידק, מחקרים על התפתחות עוברית וחקירת הטבעה גנומית.

מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

פרוטוקול זה מתארך באופן שגוי את השינוי של ההטבעה הגנומית בתאי גזע עובריים של עכברים הפלואידים, כפי שהנבדק שלנו נובע מזרע כוזב, המאפשר יצירת עוברים בגידול ביתי בעכברים. השינוי הגנטי של גמט דורש בדרך כלל טכניקות קשות. באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן לתפעל גמטות הוריות בתאי גזע עובריים היברידיים להחדרה לאחר מכן לעכברים כאופציה להחלפת זרע.מכיוון ששיטה זו מאפשרת שינוי ספציפי מלאכותי של גמט אבהי בעוברים, היא ישימה במיוחד לחקר הטבעה גנומית וצריבה. מי שידגים את ההליך הזה יהיה צ'ארלס אטיין דומו, אמבריולוג עכברים מהמעבדה שלי. כדי להכין פיפטות אחיזה ומיקרו-הזרקה לניסוי, ראשית, השתמש במושך מיקרופיפטות כדי למשוך נימי זכוכית בורוסיליקט בעלי צורה מוארכת והתחדדות הדרגתית.להכנת פיפטות אחיזה, מקם נימים משוכים בקוטר חיצוני של 60 עד 100 מיקרומטר במיקרו זיוף מעל חרוז הזכוכית על הנימה. הפעל את החוט והורד את הנימים עד שהוא יוצר קשר עם החרוז. כאשר הנימים נצמדו לחרוז, כבו את החוט ומשכו את הנימים, מה שגורם לנימים להישבר בקצה ישר.לאחר מכן, מקם את קצה הנימים השבור אופקית ליד חרוז הזכוכית על החוט וחמם את החוט כדי להמיס את הקצה עד שהקוטר הפנימי של קצה הנימים מגיע לקוטר של 10 עד 20 מיקרומטר. לאחר מכן מקם את הנימים מעל חרוז הזכוכית כמילימטר אחד מהקצה וחמם את החוט כדי לאפשר לכופף את הנימים לזווית של 20 מעלות. להכנת פיפטה מיקרו הזרקה, מקם נימים משוכים בקוטר חיצוני של כשישה מיקרומטר מעל חרוז הזכוכית על החוט המחומם והורידו את הנימים עד שהוא נוגע בחרוז.לאחר חיבור הנימים, כבה את החוט והחזר את הנימים. הנימים יישברו בקצה ישר. לאחר מכן העבירו את הנימים מעל חרוז הזכוכית כמילימטר אחד מקצה הנימים וחממו את החוט כדי לאפשר לכופף את הנימים לזווית של 20 מעלות.לביצוע הזרקה תוך ציטופלזמית, הניחו חמש טיפות מיקרוליטר של תמיסת PVP ו -20 טיפות מיקרוליטר של מדיום M2 על המכסה ההפוך של צלחת בגודל 10 סנטימטר וכסו את הטיפות בשמן מינרלי. הניחו את המנה על הבמה והתקינו פיפטה אחיזה על המיקרומניפולטור. השתמש בקצה מעמיס מיקרו כדי למלא את פיפטת המיקרו-הזרקה בשמן פלואורוקרבון ולהרכיב את הפיפטה על מפעיל הפיזו.תוך התבוננות דרך המיקרוסקופ, הורד את פיפטת המיקרו-הזרקה לטיפה של תמיסת PVP. כאשר הפיפטה טובלת, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לצפות את הזכוכית ב-PVP. טען נפח קטן של תמיסת PVP לתוך פיפטת המיקרו-הזרקה.טבלו את המיקרו-הזרקה והחזקת פיפטות במדיום M2 והתמקדו בפיפטה בתחתית הטיפה. העבירו כשני מיקרוליטר של תרחיף תאי ה-ES הפרתוגני הכפול לתוך הטיפה הבינונית M2 והשתמשו בפיפטה בפה כדי להעביר 10 ביציות M2 לאותה טיפה. סובב ביצית אחת והפעל לחץ שלילי דרך פיפטת האחיזה כדי להחזיק את הביצית כך שהחלל הפריוויטלין יפנה לפיפטה המיקרו-הזרקה, תוך הקפדה על כך שהצלחת המטאפאזה השנייה לא תמוקם בנתיב של פיפטת המיקרו-הזרקה.צייר תא ES פרטוגני כפול אחד לקצה פיפטת המיקרו-הזרקה ואשר את הקרע של קרום התא. הפעל לחץ שלילי קל על פיפטת המיקרו-הזרקה והעביר ארבעה דחפי פיזו תוך דחיפת קצה פיפטת המיקרו-הזרקה לכיוון החלל הפריוויטליני כדי לפרוץ את ה-zona pellucida. חדור לביצית עם פיפטה מיקרו-הזרקה כך שהאולמה נמתחת לצד הנגדי והפעל דופק פייזו אחד כדי לנקב את האולמה, וודא שהאולמה היא נרגעת לאורך הפיר של פיפטת המיקרו-הזרקה.הזרקו את תא ה-ES הפרתוגני הכפול עם נפח מינימלי של מדיום לתוך האופלזמה ומשכו את פיפטת המיקרו-הזרקה בצורה חלקה מהביצית. שחרר את הביצית המוזרקת מהפיפטה המחזיקה והעביר אותה לצד המיקרו טיפה לאיסוף מאוחר יותר. לאחר שכל הביציות הוזרקו, העבירו את הביציות לצלחת באר מרכזית שחוממה מראש המכילה מדיום KSOM ודגרו על המנה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה לפני ההפעלה.ניתוח תכולת ה-DNA של קו תאי ES פרתוגני כפול מייצג זה, הנושא את הטרנסגן CAG/EGFP על ידי ציטומטריית זרימה, ממחיש את התפלגות התאים ההפלואידים והדיפלואידים בשלבים G0, G1, S ו-G2 M. ניתן לבצע גנוטיפ כדי לאשר את היעדרם של אללים מסוג בר באזורים H19 ובאזורים בין-גניים עם מתילציה דיפרנציאלית. ניתן להכניס טרנסגן CAG/EGFP לתאי ES פתוגניים כפולים כדי לחקור את תרומתם לעוברים משובטים למחצה על ידי הדמיה של פלואורסצנציה ירוקה תחת מיקרוסקופ.ניתוח ציטומטריית זרימה מראה שתי אוכלוסיות המתאימות לשלב G2 M עצרו תאים הפלואידים ודיפלואידים לאחר טיפול בדמוקלקן. היעדר שיא הפלואיד 1N מצביע על כך שמחזור המנוחה של התא הושלם ברובו. לאחר ההזרקה, ביטוי EGFP מתגלה לעתים רחוקות בעוברים המשובטים למחצה הבנויים.כאשר הציטופלזמה של תאי ES פרתוגניים כפולים מתפזרת לתוך הציטופלזמה הגדולה של הביצית. שש שעות לאחר ההפעלה ניתן לצפות בעד שלושה גופים קוטביים תחת המיקרוסקופ. הגוף הקוטב הראשון והשני של הביצית וגוף פסאודו קוטבי אחד מה-ESC הפלואידי.כדי להדגים את יכולתם ההתפתחותית, ניתן לתרבית עוברים משובטים למחצה לשלב הבלסטוציט. יתר על כן, ניתן להשיג עכברים נקבות לטווח מלא מעוברים משובטים למחצה בשלב שני תאים המועברים לביציות של נקבות מקבלות. במהלך הזרקת מיקרו חשוב לקרוע את קרום הפלזמה של תאי גזע עובריים הפלואידים מכיוון שהוא נכנס כדי למנוע הפרדת כרומוזומים כאשר הביצית מופעלת.במקום תאי ES הפלואידים פרתנוגנטיים, ניתן להשתמש גם בתאי ES הפלואידים אנדרוגניים. מה שמאפשר לבחור את הגמט האימהי או האבהית כתחליף הזרע בהתאם למטרת המחקר.

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

הפרוטוקולים של תא החיידק השתלת רקמות xenografting testis מתוארים. תא הנבט השתלת תוצאות spermatogenesis, התורם המופק האשכים הנמען ומהווה assay הכינון מחדש תפקודית לזיהוי בתאי גזע spermatogonial (SSCs). רקמת אשך xenografting מתרבה פיתוח testis ו spermatogenesis של מינים שונים התורמות בעכברים הנמענים.

נבט השתלת ורקמות testis Xenografting ב עכברים

כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאושש בהצלחה על ידי הפריה חוץ גופית.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להגביר את ייצור כמירה ללא השימוש של ציוד חדש. שינוי כיוון פשוטה של העובר להזרקה ניתן להגדיל את מספר העוברים המיוצר, להפחית באופן פוטנציאלי את ציר הזמן germline שידור.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

שיטת מניפולציית צוואר הרחם המוצגת יכולה לגרום לפסאודו-הריון בעכברים ללא צורך בגידול נקבות עם זכרים שעברו כריתת כלי דם. השראת פסאודו-הריון נדרשת להצלחת החזרת עוברים לא כירורגית והזרעה מלאכותית לא ניתוחית, שניהם מוצגים גם.

גרימת פסאודו-הריון בעכברות נקבות ללא צורך בזכרים שעברו כריתת כלי דם לפני החזרת עוברים לא ניתוחיים או הזרעה מלאכותית

כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע הזרקת זרע עגולה (ROSI) בעכברים, טכניקה עם יישומים קליניים מבטיחים ותועלת לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות עוברית.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

למד שימוש בתאי גזע עובריים הפלואידים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע ביצירת עוברים חצי-משובטים בעכברים. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית של גמטות ומחקר הדפסה גנומית.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

גלה סרטונים נוספים