CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

טכניקה זו מועילה להחדרת מוטציות מדויקות ל-C.elegans על ידי עריכת גנום CRISPR/Cas9 בתוך מסגרת זמן קצרה. טכניקה זו מספקת דרך יעילה ויעילה לעריכת הגנום של C.elegans, שכן השימוש בסמן Co-CRISPR משפר מאוד את ההסתברות לזיהוי תולעים שנערכו באופן חיובי. הקפידו לתרגל את ביצוע המיקרו-הזרקות ולהזריק את שתי זרועות בלוטת המין של כמה שיותר תולעים כדי להגדיל את הסיכוי להשיג את העריכות הרצויות.

ידגימו את ההליך איימי סמית', מרי ברגוול, דניטה מת'יו, אלי סמית' וקרטר דירלם, כולם סטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלי. כדי להכין תולעים בוגרות צעירות להזרקה, בחרו L2, L3 stage C.elegans על מדשאה חיידקית טרייה על צלחת MYOB ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, הכינו את תערובת ההזרקה כמתואר בטבלה בצינורות סטריליים נטולי נוקלאז וערבבו על ידי פיפטינג.

דגרו את תערובת ההזרקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להרכיב את קומפלקסי הריבונוקלאופרוטאין לפני סיבוב התערובת על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ מנתח כדי לבחור כ-30 תולעים בוגרות צעירות עם פחות מ-10 עוברים ברחם, והזריקו לשתי זרועות בלוטת המין של כל תולעת כמה פיקוליטר של תערובת הזרקה לכל זרוע. לאחר מיקרו-הזרקה, השתמש במנגנון התאוששות כדי להחדיר בעדינות פיפטה תולעים שהוזרקו מכרית ההזרקה על צלחת MYOB בגודל 60 מילימטר עם OP50 E.coli.

אפשר לתולעים המוזרקות להתאושש במשך שעה בטמפרטורת החדר. בתום תקופת ההחלמה, השתמשו בחוט פלטינה כדי להעביר כל תולעת מוזרקת על צלחת אגר MYOB 35 מילימטר אחת, ואפשרו לתולעים להטיל ביצים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, העבירו את התולעים המוזרקות לצלחות בודדות חדשות של 35 מילימטר.

במשך שלושה עד ארבעה ימים לאחר ההזרקה, השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לזהות לוחות שיש להם צאצאי F1 המציגים פנוטיפים רולריים, כפי שמצוין על ידי גוף החיה המסתובב סביב צירו הארוך כאשר בעלי החיים נעים בתבנית מעגלית, ופנוטיפים דפוקים, כפי שמעידה פיזיולוגיה קצרה וחזקה יותר בהשוואה לחיות ביקורת באותו שלב התפתחותי. העבירו 50 עד 100 תולעי רולר F1 לצלחות האישיות שלהן ואפשרו לתולעים להטיל ביצים למשך יום עד יומיים. לאחר יום עד יומיים של ייצור תולעת F2, העבירו כל אם רולר F1 בודדת מצלחת ממוספרת לתוך צינור ה-PCR הממוספר המתאים לה המכיל 2.5 מיקרוליטר של מאגר ליזה בתוספת דילול של 1:100 של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K. הקפיאו את הצינורות במינוס 30 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני שתולעים ישנו בתרמחזורלר, כפי שצוין.

בסוף המחזור, הוסף 12.5 מיקרוליטר של תערובת PCR 2X המכילה טריפוספטים דאוקסינוקלאוזיד, פולימראז DNA, מגנזיום כלוריד וצבע טעינה, מיקרוליטר אחד של פריימר קדימה של 10 מיקרומולרי, מיקרוליטר אחד של פריימר הפוך של 10 מיקרומולרי, ומספיק מים סטריליים כדי להביא את תערובת התגובה ל-25 מיקרוליטר לכל דגימת תולעת ליזה. לאחר מכן הפעל את הדגימות על התרמו-סייקלר כפי שמצוין. כדי לסנן עריכות באורך של פחות מ-50 זוגות בסיסים, העבירו 10 מיקרוליטר מכל תגובת PCR לצינור חדש והוסיפו חמישה מיקרוליטרים מתערובת העיכול הראשית לכל צינור.

דגרו על תגובות העיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בתום הדגירה מחממים ומפעילים את העיכול בדגירה של 10 עד 15 דקות בחום של 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טען את כל התגובה מכל צינור לבאר אחת של ג'ל אגרוז של 1% עד 2% והפעל את הג'ל ב-110 מיליאמפר עד להשגת הפרדת רצועה נכונה.

בסוף הריצה, דמיין ג'ל אגרוז תחת אור UV כדי לזהות את גדלי רצועת ה-DNA. תולעים שעברו עריכה חיובית יציגו פס נוסף של DNA בגודל הצפוי עקב עריכה באמצעות תבנית התיקון, הנושאת את אתר ההגבלה במיקום הרצוי בתוך גנום התולעת. בחר שמונה עד 12 תולעי F2 שאינן מתגלגלות בעלות מראה פראי מלוחות תולעי הגליל F1 הערוכים באופן חיובי ואפשר לתולעים להטיל ביצים ולייצר צאצאים למשך יום עד יומיים.

לאחר מכן זהה את קווי התולעת ההומוזיגוטיים כפי שהודגמו עבור תולעים שנערכו באופן חיובי ונתח את תוצאות הריצוף באמצעות תוכנת ניתוח רצף כדי לאשר את נוכחות העריכה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כאן, ניתן לצפות ב-DNA הגנומי וב-CRISPR RNA המעוצב ותבנית התיקון עבור הגן C.elegans rbm-3.2. בניתוח מייצג זה, שבע מתוך 73 תולעי F1 נמצאו חיוביות לעריכה.

תולעים לא ערוכות הציגו את מקטע ה-DNA היחיד של 445 זוגות בסיסים בעת עיכול EcoRI, בעוד שתולעים הנושאות קודון עצירה מוקדם בגן rbm-3.2 הציגו שני שברים ב-265 ו-166 זוגות בסיסים בעת עיכול EcoRI. תולעים ערוכות הטרוזיגוטיות הציגו שלושה שברים בעיכול EcoRI. שש מתוך 12 תולעי F2 מההטרוזיגוטים החיוביים שזוהו נמצאו הומוזיגוטיים לעריכה המעניינת.

לאחר מכן ניתן היה להשתמש ב-DNA הגנומי של קו תולעת ערוך הומוזיגוטי שזוהה כדי להגדיר תגובת ריצוף DNA, שאישרה את נוכחות העריכה במצבה ההומוזיגוט. הקפד כי ריאגנטים לעריכה ופריימרים להקרנה מתוכננים כהלכה, ושתערובת ההזרקה מוכנה כראוי. מיקרו-הזרקה מדויקת היא גם קריטית.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע אימות פנוטיפי של העריכה, אם רלוונטי, וניתוח ביטוי גנים וחלבונים כדי לאמת את דיוק עריכת הגנום.