ייצור פלטפורמות מגנטיות עבור ארגון בקנה מידה מיקרון של נוירונים מחוברים

הגישה שלנו מאפשרת לשלוט היווצרות רשת עצבית באמצעות מניפולציות מגנטיות. זהו כלי יעיל למחקרים במבחנה של רשתות ומציע כיוון טיפולי חדשני למכשירי biointerfacing. בטכניקה זו אנו יכולים לשלוט הן במיקום התא והן בצמיחתו בקנה מידה מיקרון, המאפשר עיצוב גמיש של התבנית המגנטית ובכך ארגון הרשת.

סטרילופטי חלקיק מגנטי יעיל ולא רעיל הוא קריטי. כדי להצליח, חלקיקים מגנטיים מתאימים נדרשים. התכונות החשובות הן הגודל, הציפוי וערך המגנטיזציה של המצב.

מי שידגימו את ההליכים יהיו רעות פלן ודפנה לבנברג, סטודנטיות לתואר שני במעבדה שלי. כדי להתחיל, לחתוך שקופיות זכוכית לשניים על ידי שני סנטימטר חתיכות באמצעות עט סופר. לנקות את שקופיות זכוכית אצטון ולאחר מכן isopropanol במשך חמש דקות כל אחד באמבטיה ultrasonication.

ואז לייבש אותם עם חנקן טוהר גבוה במיוחד. מצפים את הזכוכית עם פוטורסיסט באמצעות ציפוי ספין ב 6, 000 סל"ד במשך 60 שניות כדי להשיג 1.5 מיקרומטר עובי ואופים 100 מעלות צלזיוס במשך 60 שניות. חשוף את הדגימה למקור אור באמצעות פוטומסק או ליטוגרפיה ללא מסכות כדי להשיג את התבנית הרצויה.

לפתח את המדגם במשך 40 שניות מפתח מדולל במים מזוקקים על פי הוראות היצרן. ואז לשטוף אותו במים במשך 45 שניות ולייבש אותו עם גז חנקן UHP. בדוק את התבנית תחת מיקרוסקופ אופטי.

הכנס את הדגימה לתא נעילת העומס של מערכת התצהיר והמתן ללחץ בסיסי. מעבירים את הדגימה בתא הראשי ומגדירים את הדגימה בגובה המתאים לתצהיר. הגדל את העוצמה בכל יעד עד להשגת הקצב הרצוי.

הפעל את הסיבוב, ולאחר מכן להפקיד את multilayer ferromagnetic, לסירוגין בין מטרות קובלט, ברזל, פלדיום על ידי פתיחה וסגירה של תריסי היעד בהתאמה. הפקד 14 bilayers של פלדיום ברזל קובלט ולסיים עם שכבת פלדיום מכסה נוספת. לאחר השלמת התצהיר, בטל את טעינת הדגימה ממערכת התצהיר.

משרים את המדגם באצטון במשך 30 דקות ולשטוף אותו עם isopropanol. ואז לייבש אותו עם חנקן UHP ולבחון אותו תחת המיקרוסקופ. יש לשמור אותו בסביבה נקייה ויבשה עד לשימוש.

השתמש במגלשת זכוכית עם פס מגנטי בצורת צלב ברוחב 100 מיקרומטר המופקד עם שכבות פרומגנטיות. חבר את הדגימה למחזיק באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי. השתמש בשעבוד תיל כדי לחבר ארבעה חוטים לדגימה, אחד על כל רגל של האלקטרודה הצולבת.

הגדר את מחזיק הדגימה ודגימה בתוך מערכת מדידת התובלה עם שדה מגנטי, כך השדה המגנטי הוא בניצב לדגימה. בצע מדידות מתח רוחביות כמתואר בכתב היד של הטקסט. לטאטא את השדה המגנטי ולמדוד את המתח הרוחבי כפונקציה של השדה.

התווה את ההתנגדות הרוחבית כפונקציה של השדה המגנטי כדי לקבוע את אות האולם החריג, שהוא פרופורציונלי למגנטיזציה הניצבת בסרט. הכן מדיום צמיחה בסיסי מדיום בידול עבור תרבות התא PC12 כמתואר בכתב היד טקסט. לגדל תאים בבקבוק תרבות שאינו מטופל עם 10 מיליליטר של מדיום צמיחה בסיסי, הוספת 10 מיליליטר של בינוני לבקבוק כל יומיים עד שלושה ימים.

תת-תרבות התאים לאחר שמונה ימים. לספיגה תאית, צנטריפוגה השעיית התא במשך שמונה דקות ב 200 G וטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשליך את supernatant. התחדשו בתאים בשלושה מיליליטרים של מדיום צמיחה בסיסי טרי.

צנטריפוגה התאים שוב במשך חמש דקות, ואז להשליך את supernatant ו resuspend התאים בשלושה מיליליטרים של מדיום בידול טרי. לשאוף את התאים 10 פעמים באמצעות מזרק ומחט כדי לשבור את אשכולות התא, ואז לספור את התאים באמצעות hemocytometer וזרע מיליון תאים בצלחת רגילה, לא צבוע 35 מילימטר. הוסף את הנפח המחושב של מתלי MNP ובינוני בידול לצלחת כדי להשיג את ריכוז MNP הרצוי.

מערבבים את התאים, ה-MNPs והבידול בינוני, ואז מדגרים את המנה באינקובטור לח של 5% פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לנקות את המצע בדוגמת עם 70% אתנול ומניחים אותו בצלחת תרבות 35 מילימטר בשכונה. מניחים מגנט גדול מתחת למצע בדוגמת במשך דקה אחת, ולאחר מכן להסיר אותו על ידי הזזת המנה למעלה ושם ולקחת את המגנט מתוך מכסה המנוע.

הדליקו את האור האולטרה סגול במשך 15 דקות. כדי להכין מצע זכוכית מצופה קולגן, לדלל קולגן סוג אחד ביחס אחד עד 50 ב 30% אתנול. מכסים את הזכוכית עם הפתרון.

השאירו את המנה חשופה במכסה המנוע במשך ארבע שעות עד שכל הפתרון מתאדה, ואז לשטוף אותו שלוש פעמים PBS סטרילי. מוציאים את התאים מהאינקובטור, צנטריפוגה השעיית התא במשך חמש דקות ב 200 G ולזרוק את supernatant. להחזיר את התאים במיליליטר אחד של מדיום בידול טרי ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.

זרעים 10 לחמשת התאים על גבי המצע בצלחת תרבות של 35 מילימטר ומוסיפים שני מיליליטר של מדיום בידול. דגירה את התרבות באינקובטור לח 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, להוסיף אחד עד 100 מורין טרי בטא-NGF לתאים.

לחדש את מדיום הבידול ולהוסיף בטא-NGF טרי כל יומיים. תמונה התאים כל יומיים באמצעות מיקרוסקופ אור ולבצע immunostaining על התאים לאחר היווצרות הרשת. פלטפורמות מגנטיות עם צורות גיאומטריות שונות היו מפוברקות ו- MNPs תחמוצת ברזל פלואורסצנטית סונתז על ידי גרעינים.

מדידות מגנטומטריות של חברי הפרלמנט מראות שלעקומת המגנטיזציה לא הייתה היסטרזיס, שדה רוויה נמוך ורווית מגנטיזציה גבוהה יחסית. תאי PC12 דגירו במדיום מעורבב עם MNPs פלואורסצנטי תחמוצת ברזל, הפיכתם ליחידות מגנטיות. חברי הפרלמנט הופנמו לתוך הסומה של התאים, אבל לא בגרעין.

ריכוז הברזל בתוך התאים גדל עם הגידול בריכוז MNP במדיום. הכדאיות של תאי PC12 טעונים MNP עבור ריכוזים שונים של MNPs הוערך על ידי השוואת פרמטרים מורפולוגיים של תאים טעונים MNP באמצעות ניתוח Shoal, מראה שום הבדל מתאי בקרה. XTT ו Resazurin מבוסס מבחנים אישרו כי הריכוזים המוערכים של MNPs הראו שום ציטוקסיות משמעותית כלפי התאים.

תאי PC12 עם וללא טיפול MNP גדלו והובדלו על מצע מגנטי. התאים הממגנטים נמצאו מחוברים לדפוסים המגנטיים ומגדלים ענפים בהתאם לדפוסים, בעוד שתאים ללא טיפול MNP גדלו ללא זיקה למכשירים המגנטיים. מיקום תאים על מצע עם גיאומטריה משושה מוצג כאן.

75% מגופי התאים הטעונים של MNP היו במגע עם הפסים המגנטיים, בעוד שרק 35% מהתאים הלא ממוגנטים היו ממוקמים על הפסים. בנוסף לאפקט מיקום התאים, פלטפורמות מגנטיות אלה נמצאו כדי לשלוט בכיוון של הנויריטים הגדלים. כדי להעריך את ההשפעה המגנטית על כיווניות הצמיחה העצבית, נמדדה הזווית בין הנויריטים לפסים המגנטיים, והראתה מתאם משמעותי עם אוריינטציה של הפסים המגנטיים.

הליך זה מותאם בקלות להכוונת תרכובות פעילות, כמו תרופות, לאחר הטייתן לננו-חלקיקים מגנטיים. ניתן לתרגם לבדיקות סינון תרופות בתפוקה גבוהה או לטיפול מקומי בתוך רקמות. גישה חדשנית זו פותחת אפשרויות חדשות לפונקציונליזציה של מצעים או התקנים אחרים על ידי הוספת מבנים מגנטיים אטרקטיביים.

נכון לעכשיו, אנו מפתחים ממשקי שבב נוירון תואמים ביולוגית משופרים.