ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה מומן על ידי הקרן הרוסית למחקר בסיסי, מענק מספר 18-29-07002. P.K. נתמך על ידי הקצאת המדינה של משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מספר מענק AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. נתמך על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מספר 075-15-2019-1659 (תוכנית מרכז Kurchatov לחקר הגנום). העבודה נעשתה בחלקה על הציוד שנרכש במסגרת תוכנית הפיתוח של אוניברסיטת מוסקבה. I.C., S.L., ו M.V.B נתמכו בנוסף על ידי אוניברסיטת מוסקבה סטייט מענק "בית הספר המדעי המוביל תיבת נח".

1. הכנת תרבות שמרים
<ol><li>שמרים פס מתרבויות מלאי קפוא על צלחות טריות עם המדיום המתאים. שים את הצלחות באינקובטור תרבות ב 30 מעלות צלזיוס עבור 24-48 שעות. הערה: תן למוטנטים הרגישים לטמפרטורה לגדול בטמפרטורה המתירנית.</li>
	<li>לחסן תרביות שמרים ב 2 מ"ל של מדיום YPGal (2% פפטון, 1% תמצית שמרים, 2% גלקטוז) מן הפס הטרי ב 15 מ"ל צינורות לדגר אותם לילה נסער ב 200 סל"ד ב 30 °C (60 °F).</li>
	<li>למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באורך גל של 600 ננומטר (OD600).</li>
	<li>קח את הנפח המתאים 0.2 יחידות ספיגה בצינורות סטריליים, כדוריות שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר, ולזרוק את supernatant.</li>
	<li>לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. לדלל תאים ב 2 מ"ל של מדיום YPGal טרי.</li>
	<li>דגירה ב 200 סל"ד ו 30 °C (60 °F) עד OD600 מגיע 1.5-1.9 ערכים. הערה: שיעורי הצמיחה של שמרים משתנים, לכן היו מוכנים לחכות. סביר לעשות צעדים 1.3-1.6 מוקדם בבוקר. זה בדרך כלל לוקח 4-5 שעות, אבל יכול לקחת יותר זמן.</li>
</ol>2. התאגדות איזוטופ רדיואקטיבי
<ol><li>העבר את נפח התרבות המקביל ליחידה אופטית אחת בצינור מיקרוצנטריפוגה. לסובב את הצינורות ב 3,000 x g במשך 1 דקות ולהשליך את supernatant. לשטוף עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s.<ol>
<li>כדורי שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. הושהה מחדש של תאי שמרים ב- 0.5 מ"ל של מאגר תרגום סטרילי. מניחים את ההשעיה בצינור 15 מ"ל. הערה: מאגר תרגום הוא פתרון המכיל 2% גלקטוז (w /v) ו 50 מ"מ אשלגן פוספט עם pH 6.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף ציקלוהקסימיד להשעיית התא עד ריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל. דגירה במשך 5 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס כדי לעכב תרגום ציטוזולי. הערה: פתרון ציקולוהקסימיד (20 מ"ג / מ"ל, באתנול) צריך להיות מוכן טרי לפני הניסוי. כלורמפניקול יכול להיות מוחלף בהצלחה עם אניסומיצין באותו ריכוז7.</li>
	<li>הוסף 25-30 μCi של 35S-methionine להשעיית התא דגירה במשך 30 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס. הערה: ניתן להשתמש גם בתערובת של 35S-מת'ונין ו-35S-ציסטאין. תוצאות S-methionine טהורות באות החזק ביותר ויחס האות לרעש הטוב ביותר. בדרך כלל, מתונין יעיל יותר ציסטאין כי התוכן של חומצת אמינו זו בחלבונים המיטוכונדריים הוא גבוה יותר. עם זאת, תערובת EasyTag של 35S-methionine וציסטאין הוא פחות יקר ונותן תוצאותדומות 7. התראה: 35S-מתונין הוא רדיואקטיבי. פעל בהתאם לנוהלי הבטיחות הרגילים לטיפול בחומרים רדיואקטיביים. הערה: ידוע כי שילוב הרדיואקטיביות מגיע למגבלה שבגללה רמת האותות הכוללת לאורך זמן. ברגע שמגבלה זו מגיעה, כמעט בלתי אפשרי לקבוע את התעריפים שבאמצעותם מוצרי התרגום השונים מסונתזים. כדי לנתח את קצב התרגום המיטוכונדריאלי, זה הכרחי להיות במצב שבו עוצמת האות עולה עם זמן הדגירה עם 35S-methionine באופן ליניארי. עבור זנים נפוצים מסוג פראי במעבדה, האות כבר רווי לזמני דגירה קצרים בהרבה מ-30 דקות. מוטנטים תרגום יכולים להתנהג בצורה שונה מאוד. יש לבצע קורס זמן כדי לבסס את הקינטיקה של שילוב רדיואקטיביות ובכך את שיעור התרגום, לפחות בעת עבודה עם זן חדש. בשביל זה, אנו ממליצים לקחת דגימות עם מרווח של כמה דקות (למשל, 2.5, 5.0, 7,5, 10, ו 20 דקות).</li>
	<li>הוסף מתונין "קר" ללא תווית (הריכוז הסופי צריך להיות 20 מ"מ) ו puromycine (הריכוז הסופי צריך להיות 1-10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי לעצור את התיוג. דגירה במשך 10 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס. הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לתת ריבוזומים זמן לסיים לתרגם את הפפטידים. אחרת, כל הפוליפפטידים קצרים יותר מאורך מלא יזוהו בגודל שונה. ניסוי קורס זמן (דופק-מרדף) יכול להיעשות בשלב זה כדי לקבוע את היציבות של מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. בשביל זה, להמשיך את הדגירה לוקח דגימות עם מרווח של 30 דקות (למשל, 30, 60, 90, ו 120 דקות).</li>
</ol>3. תמוגה של תאי שמרים ומיצוי חלבונים
<ol><li>לאסוף תאי שמרים על ידי צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 30 s. לשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x גרם עבור 30 s בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט. הערה. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אחסן את הדגימות ב- -20 °C (69 °F).</li>
	<li>הוסף 75 μL של מאגר תמוגה לכדור ומערבולת במשך 5-10 s. הערה: מאגר תמוגה הוא פתרון של 1.8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol, ו 1 mM PMSF במים. הימנע דגירה מוגזמת עם מאגר תמוגה המוביל הידרוליזה אלקליין של חלבונים. המשך מיד לשלב 3.3.</li>
	<li>הוסף 500 μL של 0.5 M Tris-HCl מאגר עם pH 6.8. וורטקס לזמן קצר.</li>
</ol>4. משקעים של חלבונים
התראה: מתנול וכלורופורם הם ממיסים אורגניים. בצע את נוהלי הבטיחות הרגילים לטיפול בחומרים אורגניים.
<ol><li>הוסף 600 μL של מתנול לדגימה. וורטקס במשך 5 שניות.</li>
	<li>הוסף 150 μL של כלורופורם לדגימה. וורטקס במשך 5 שניות.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימות במשך 2 דקות ב 12,000 x g. השלך בזהירות את השלב העליון עם סמפלר.</li>
	<li>הוסף 600 μL של מתנול לדגימה. מערבבים בזהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימות במשך 2 דקות ב 12,000 x g. השלך את הסופרנט.</li>
	<li>אוויר לייבש את גלולה במשך 2 דקות ב 80 מעלות צלזיוס. הערה: כל הנוזל צריך להתאדות. קיים סיכון להפרדה חריגה של חלבונים בג'ל אם גלולה היה מיובש מספיק. עם זאת, לא ניתן לייבש יתר על הערך את גלולה, כך שזה יכול אפילו להיות מאוחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ממיסים חלבונים משקעים ב-60 מיקרו-μL של מאגר מדגם 1x Laemmli.</li>
	<li>מחממים במשך 10 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. הערה: הימנע רותחים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס, כי זה גורם לצבירה. אם הצבירה עדיין נוצרת, סובב את הדגימות במהירות של 12,000 x g למשך 2 דקות ואסוף את ה- supernatant. ניתן לאחסן דגימות ב- -20 °C (69 °F). ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>5. עמוד SDS
<ol><li>יצוק 17.5% Laemmli SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל. הערה: 6 M אוריאה ניתן להוסיף את הג'ל כדי לפתור טוב יותר atp8 ו atp9. ג'לים הדרגתיים של 15%-20% יכולים גם לתת רזולוציה טובה יותר.</li>
	<li>טען 15 μL (40-50 מיקרוגרם) של כל מדגם בכיסים. הערה: אין צורך למדוד ריכוז חלבון אם ערכי OD600 היו קרובים בשלב 1.6. אם לא, למדוד ריכוזי חלבון באמצעות מבחני עם ריאגנטים תואמי דטרגנט.</li>
	<li>מפעילים את הג'ל בחדר קר עד שהצבע הכחול מגיע לכ-65% מאורך הג'ל. הערה: עבור המערכת בשימוש (למשל, Protean II xi תא), אנו משתמשים בכל אחד משני המצבים: 16-17 שעות ב 5 V / cm או 5 שעות ב 15 V / cm. אין חלבונים לרוץ מהר יותר מאשר צבע כחול ברומופנול, אבל ריצות ארוכות יכול לגרום טשטוש של אותות atp8 ו- atp9.</li>
	<li>הכתימו את הג'ל בכחול בוהק של Coomassie ובצעו סריקה או תמונה, הנדרשת כבקרת טעינה. הערה: דרך חלופית לעשות בקרת טעינה היא immunoblotting עם נוגדן לגן "שמירה על הבית" המיטוכונדריאלי, למשל, פורין 1.</li>
</ol>6. אוטורדיוגרפיה
<ol><li>יבש את הג'ל במייבש ג'ל. שמור אותו בקלטת עם מסך זרחן אחסון למשך 3-5 ימים. הערה: חלופה להקרנת הג'ל המיובש היא העברת חלבונים לקרום ניטרוסלולוז על ידי נפיחות אלקטרו והקרנתו לאחר מכן. התוצאה היא אותות חזקים יותר ולהקות חדות יותר.</li>
	<li>סרוק את המסך על זרחן. הערה: כחלופה להדמיית זרחן, ניתן להשתמש בסרט רנטגן גם כדי לחשוף את האותות.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חקירות של ביטוי גנים תופסות חלק מרכזי במדעי החיים המודרניים. פותחו שיטות רבות המספקות תובנות על תהליך מורכב זה. כאן, תיארנו את השיטה המאפשרת גישה לביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה S. cerevisiae של בייקר. זה מיושם בדרך כלל כדי להשוות יעילות תרגום של mRNAs במיטוכונדריה של זן שמרים מוטנטים לעומת סוג פראי כדי לגשת להשלכות של המוטציה הנחקרת. זהו אחד הניסויים הבסיסיים שהחוקרים עורכים כאשר הם חוקרים את הפונקציה המיטוכונדריאלית של תאי שמרים הנושאים את המוטציה המוצעת להשפיע על המיטוכונדריה8,...

המיטוכונדריה הם אברונים מעורבים עמוק בחילוף החומרים של תא אוקריוטי. שרשרת העברת האלקטרונים שלהם מספקת לתא ATP, המטבע האנרגטי העיקרי המשמש במסלולים ביוכימיים מרובים. חוץ מזה, הם מעורבים אפופטוזיס, חומצת שומן סינתזה heme, ותהליכים אחרים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא מקור ידוע של מחלה אנושית1. זה יכול לנבוע מוטציות בגנים גרעיניים או מיטוכונדריאליים קידוד רכיבים מבניים או רגולטוריים של organelles2. שמרי בייקר Saccharomyces cerevisiae הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר ביטוי גנים מיטוכונדריאלי בשל מספר סיבות. ראשית, הגנום שלהם רצף לחלוטין3, מבואר היטב, וסכום גדול של נתונים כבר זמין בספרות הודות להיסטוריה הארוכה של חקירות שבוצעו עם האורגניזם הזה. שנית, המניפולציות עם הגנום הגרעיני שלהם הן מהירות וקלות יחסית בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם ומערכת רקומביניזציה הומולוגית יעילה מאוד. שלישית, שמרי האופה S. cerevisiae הוא אחד האורגניזמים הבודדים שעבורם המניפולציות עם הגנום המיטוכונדריאלי מפותחות. לבסוף, שמרי האופה הוא אורגניזם פקולטטיבי אווירוב-אנארוב, המאפשר בידוד וחקר של מוטציות פגומות בדרכי הנשימה, שכן הם יכולים לגדול במדיה המכילה מקורות פחמן מותססים.
אנו מתארים את השיטה ללמוד ביטוי גנים מיטוכונדריאלי של שמרי אופה S. cerevisiae ברמה התרגומית4. העיקרון העיקרי שלה מגיע מכמה תצפיות. ראשית, הגנום המיטוכונדריאלי של השמרים מקודד רק שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p5. מספר זה קטן, וניתן להפריד את כולם על ידי אלקטרופורזה על ג'ל יחיד בתנאים המתאימים. שנית, ריבוזומים מיטוכונדריאליים שייכים למעמד הפרוקריוטי ולא לאוקריוטיקה6, ולכן הרגישות לאנטיביוטיקה שונה עבור ריבוזומים ציטופלזמים ומיטוכונדריאליים. זה מאפשר עיכוב של תרגום ציטופלסמי עם ציקלוהקסימיד, מתן התנאים כאשר חומצת אמינו שכותרתו(35S-מתיונין) משולב רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, הניסוי מספק מידע על קצב שילוב חומצות האמינו בחלבונים המיטוכונדריים מסונתז דה נובו, המשקף את היעילות הכוללת של תרגום מיטוכונדריאלי עבור כל אחד משמונת המוצרים

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מד צפיפות תאים Biowave CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>קוביות חד פעמיות סטנדרטיות</td><td>למותג Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלקטוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מחמם בלוק דיגיטלי</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-מתיונין, 500&micro; Ci (18.5MBq), תמיסה מימית מיוצבת</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק Innova 44/44R חממת שייקר</td><td>ניו ברונסוויק פפטון מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבשר, בקטריולוגי</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתאן סולפוניל פלואוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון Pierce 660nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac ספק כוח בסיסי</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi תא</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride מ- Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>221465</td><td></td></tr><tr><td>סטורם 865 מצלמת זרחן</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריזמה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ג'ל מחומם בוואקום</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב cerevisiae שמרים של בייקר

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. הם מכילים גנום מעגלי ומנגנון ביטוי גנים. גנום מיטוכונדריאלי של שמרי אופה מקודד שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p. מטרת השיטה המתוארת כאן היא לתייג במיוחד חלבונים אלה עם 35S methionine, להפריד אותם על ידי אלקטרופורזה לדמיין את האותות כמו להקות נפרדות על המסך. ההליך כרוך במספר שלבים. ראשית, תאי שמרים מתרבתים במדיום המכיל גלקטוז עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמי המאוחר. לאחר מכן, טיפול ציקלוהקסימיד חוסם תרגום ציטופלסמי ומאפשר 35S שילוב מתיון רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, כל החלבונים מופקים מתאי שמרים ומופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד. לבסוף, הג'ל מיובש ומדגיר עם מסך זרחן האחסון. המסך נסרק על זרחן החושף את הלהקות. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעור הביוסינתזה של פוליפפטיד יחיד במיטוכונדריה של זן שמרים מוטציה לעומת סוג הבר, אשר שימושי לחקר פגמים ביטוי גנים מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מספק מידע רב ערך על קצב התרגום של כל mRNAs המיטוכונדריה שמרים. עם זאת, הוא דורש מספר בקרות וניסויים נוספים כדי להסיק מסקנות נכונות.

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הקצינו מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי משני זני S. cerevisiae: סוג הבר (WT) ומוטנט הנושא מחיקה של הגן AIM23 (AIM23Δ), קידוד גורם ייזום תרגום מיטוכונדריאלי 3 (טבלה 1)8. מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי סומנו באופן רדיואקטיבי והופרדו ב- SDS-PAAG9. הדגימות נאספו כל 2.5 דקות לפני הרוויה כדי לבנות קורס זמן (איור 1A). הג'ל היה מוכתם, מיובש ומוקרן לאחר התערוכה בת 5 הימים (איור 1A).</st...

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. תפקודם הלקוי הוא מקור ידוע למחלה אנושית. המיטוכונדריה של שמרי בייקר מכילה קידוד גנום עגול שמונה חלבונים.בסרטון זה, תיארנו את הפרוטוקול המשמש לחקר ביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה של שמרים באמצעות תיוג רדיואקטיבי של מוצרים תרגומיים והפרדה עוקבת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. ההליך כולל מספר שלבים עיקריים. שמרים פסים מתרבויות מלאי קפואות על צלחות טריות עם מדיום מתאים.שים את הצלחות באינקובטור התרבות ב 30 מעלות במשך 24 עד 48 שעות. לחסן תרבויות אלה בשני מיליליטרים של מדיום מן הפס הטרי בצינור 15 מיליליטר ולהדגיר אותם לילה נסער ב 200 סל"ד ב 30 מעלות. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באורך הגל של 600 ננומטר.קח את הנפח המתאים 0.2 יחידות ספיגה בתאי שמרים פלטת צינורות סטריליים ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט הזה. לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות.תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט. לדלל תאים בשני מיליליטר של מדיום אגר ניגוב טרי.קצה הדגירה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות עד הצפיפות האופטית מגיע מ 1.5 ל 1.9 מ 1.5 עד 1.9 ערכים. העבר את נפח התרבות שווה ערך ליחידה אופטית אחת בצינור מיקרו צנטריפוגה. לסובב את הצינורות ב3000 G לדק

labelling-visualization-mitochondrial-genome-expression-products

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

מי חמצן (H 2 O2) הםגם מקור לנזקי חמצון וגם מולקולת איתות. פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד H 2 O2מיטוכונדריאלי באמצעות HyPer7 ממוקד מיטוכונדריה (mtHyPer7), ביוסנסור יחסי מקודד גנטית, בשמרים חיים. הוא מפרט כיצד לייעל את תנאי ההדמיה ולבצע אנליזה כמותית תאית ותת-תאית באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי.

הדמיה של mtHyPer7, ביוסנסור רציומטרי למי חמצן מיטוכונדריאליים, בתאי שמרים חיים

שמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe מתגלים כמודל אטרקטיבי לחקר מיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח השפע וההרכבה של קומפלקסי הנשימה המיטוכונדריאלים ב-S. pombe. זה מאפשר לאפיין את הפונקציות החדשות של גנים שמורים בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe

למד תיוג רדיואקטיבי והפרדת חלבונים באלקטרופורזה בג'ל לחקר ביוסינתזת חלבונים במיטוכונדריה של שמרים Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת הדמיית שמונה פוליפפטידים מיטוכונדריאליים ומסייעת להבנת תפקוד מיטוכונדריאלי ומחלות קשורות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

גלה סרטונים נוספים