Name: שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנא2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למד לזהות נזק ל-DNA בלבבות עוברי דגי זברה בעזרת חיסון פלואורסצנטי. השיטה מאפשרת זיהוי מדויק של ביטוי חלבונים ומעוותים לבביים כמו בצקת פריקרדיאלית ושינויי לולאה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81870239, 81741005, 81972999) ופיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות ההשכלה הגבוהה בג'יאנגסו.

דגי זברה מסוג בר (AB) המשמשים במחקר זה התקבלו ממרכז המשאבים הלאומי לדגי זברה בווהאן, סין. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת סוכו.
1.2.5 דגימה ומיצוי תרכובות אורגניות
הערה: PM2.5 נאסף באזור עירוני בסוז'ואו, סין, 1-7 באוגוסט 2015, כפי שתואר קודם לכן5.
<ol><li>אופים מסנני קרום קוורץ 47 מ"מ בכבשן עמעם של 500 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להסיר את הרכיבים האורגניים.</li>
	<li>מקם מסנן בסמפלר PM2.5 למשך 24 שעות של דגימה ללא הפרעה.</li>
	<li>מוציאים את המסנן ומייבשים למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כימת את המסנן עם איזון אנליטי.</li>
	<li>לחלץ רכיבים אורגניים מהמסנן על ידי מיצוי Soxhlet באמצעות dichloromethane כמו ממס19.</li>
	<li>יבש את EOM על ידי אידוי סיבובי באמבט מים 60 °C וזרימת חנקן. להמיס EOM ב- DMSO ולאחסן ב -20 °C (70 °F).</li>
</ol>2. איסוף וטיפול בעוברי דגי זברה
<ol><li>שמור על דג הזברה ב 28.5 ± 0.5 °C (5 °F) במערכת חקלאות ימית במחזור מחדש עם מחזור פוטופריוד 14 שעות ו 10 שעות כהה photoperiod.</li>
	<li>הניחו דגי זברה בוגרים בריאים במיכל ביחס של 2:1 בין זכר לנקבה.</li>
	<li>למחרת, לאסוף את העוברים ולשטוף אותם עם מי מערכת (כלומר, מי רבייה של דגי זברה).</li>
	<li>בחר וחלק באופן אקראי עוברי דגי זברה המדגים התפתחות נורמלית (גודל אחיד, דגנים מלאים וללא קרישת ביצים) ל-4 קבוצות בצלחות פטרי מזכוכית בודדות בקוטר של 7 ס"מ (כ-50 עוברים למנה).</li>
	<li>לטפל בעוברים עם PM2.5 (5 מ"ג / ליטר) בנוכחות או היעדר NAC ב 0.25 מיקרומטר מ 2 כ"ס עד 72 כ"ס. השתמש ב- DMSO כפקד רכב לריכוז סופי של 0.1% (v/v).</li>
</ol>3. תצפית מורפולוגית של עוברים דגי זברה ניתור לב
<ol><li>ב 72 כ"ס, להעביר עוברים שקופיות זכוכית להתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו. הקלט מומים בלב, כגון בצורת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל.</li>
	<li>חשב שיעורי מום (אחוז העוברים עם מומים בלב מתוך סך העוברים החיים) ולנתח הבדלים בין קבוצות באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טורקיה (p < 0.05 = מובהק סטטיסטית).</li>
	<li>למרדים את העוברים עם 0.6 מ"ג / מ"ל MS-222 כדי לשתק אותם על מגלשות זכוכית.</li>
	<li>הקלט פעימות לב עבור 30 s ולכומת את קצב הלב באמצעות תוכנת ImageJ5,20.</li>
	<li>לנתח לבבות מעוברי דגי זברה עם מחט מזרק חד פעמית תחת מיקרוסקופ סטריאו. אזהרה: הימנעו מהריסת צורת הלב.</li>
</ol>4. אימונופלואורסצנטיות
<ol><li>כדי להשתמש בבדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5 בלב העוברים של דגי זברה, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול בצד זכוכית נקי.</li>
	<li>הוסף 50 μL של 4% paraformaldehyde כדי 1.25 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי להפוך פתרון קבוע.</li>
	<li>מניחים 3 לבבות ניתחו לתוך מעגל עט מחסום הידרופובי אחד ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דקת הפתרון מתחת למיקרוסקופ ולייבש את הדגימות בטמפרטורת החדר לפחות 5 דקות, כך הלבבות מחוברים לחלוטין שקופיות זכוכית.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS עם 0.1% Tween 20 (PBST) במשך 5 דקות לכביסה.</li>
	<li>הוסף 50 μL של אלבומין סרום בקר (BSA) כדי 1000 μL של PBST כדי להשיג פתרון 5% BSA ודגורת השקופיות בתא לח עבור 1 שעה כדי לחסום כריכת נוגדנים ספציפית.</li>
	<li>Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.</li>
	<li>לדלל 2 μL של נוגדן חד שבטי עכבר נגד 8-OHdG ו 2 μL של נוגדן פוליקלונלי ארנב נגד γH2AX ב 296 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים ראשוני עובד.</li>
	<li>לדגור את דגימות הלב עם 50 μL של פתרון קוקטייל הנוגדנים העיקרי נגד 8-OHdG ו γH2AX בתא לח לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (דגירה לילה יכול להגביר את עוצמת האות).</li>
	<li>Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.</li>
	<li>לדלל 1 μL של נוגדן משני נגד עכבר עיזים תווית FITC ו 1 μL של נוגדן משני נגד ארנב עז cy3 ב 498 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים משני עובד ודגורת הדגימות עם הנוגדנים המשניים (1:500 ב PBST) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף מוגן מפני אור.</li>
	<li>הוסף 20 μL של DAPI (4',6-diamidino-2-פנילינדול) לדגימות עבור כתמים גרעיניים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש למרוח כיסוי על החלקה ולאטום עם לק כדי למנוע ייבוש ותנועה. לאחר מכן צלם את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמת את אות הפלואורסצנטיות של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים עם הממוצע של דגימות פקד DMSO. קבע את המשמעות הסטטיסטית של הנתונים כמו בשלב 3.2.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
<li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs%3A+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li>
<li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+senescence%2C+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li>
<li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+%28PM2.5%29+collected+in+Abidjan%2C+Cote+d%27Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li>
<li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li>
<li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation%2C+apoptosis%2C+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+biochemistry+and+physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li>
<li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diabetology%22%5BJournal%5D)">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine%2C+reactive+oxygen+species+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).</li>
<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

למרות דג זברה הוא מודל בעל חוליות מצוין לחקר הרעילות ההתפתחותית הלבבית של כימיקלים סביבתיים, בשל הגודל הקטן של הלב העובר, קשה להשיג מספיק חלבון לניתוח כתם מערבי. לכן, אנו מציגים שיטה חיסונית רגישה לכימות רמות ביטוי החלבון של סמנים ביולוגיים נזק DNA בלבם של עוברים דג זברה חשוף PM2.5.
במהלך הניתוח, חשוב לשמור על שלמות הלב ללא פגע. מניסיוננו, קל יחסית לבצע את הבידוד ב 72 כ"ס. בנוסף, יש להכניס את הלב לפתרון הקיבעון בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. צעד קריטי נוסף הוא ייבוש הדגימות כדי לוודא שהל...

זיהום אוויר הוא כיום בעיה סביבתית חמורה העומדת בפני העולם. חומר חלקיקי הסביבה בסדר (PM2.5), שהוא אחד האינדיקטורים החשובים ביותר של איכות האוויר, יכול לשאת מספר רב של חומרים מזיקים ולהיכנס למערכת הדם, גרימת נזק חמור לבריאותהאדם 1. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי חשיפה PM2.5 יכול להוביל לסיכון מוגבר של מומים מולדים בלב (CHDs)2,3. עדויות מניסויים בבעלי חיים הראו גם כי PM2.5 יכול לגרום להתפתחות לב חריגה בעוברי דגי זברה וצאצאים של עכברים, אבל המנגנונים המולקולריים של הרעילות ההתפתחותית הלבבית של PM2.5 עדיין לא ידוע במידה רבה4,5,6.
נזק לדנ"א יכול לגרום למעצר מחזור התא ולגרום לאפופטוזיס, אשר עלול להרוס בהרחבה את הפוטנציאל של תאים אבות, וכתוצאה מכך, לפגוע בהתפתחות הלב7). זה כבר מתועד היטב כי מזהמים סביבתיים, כולל PM2.5, יש פוטנציאל לתקוף DNA באמצעות מנגנוני עקה חמצונית8,9. הן התפתחות הלב האנושי והן של דג הזברה רגישים ללחץ חמצוני10,11,12. 8-OHdG הוא סמן נזק DNA חמצוני, ואות γH2AX הוא סמן של שברי גדיל כפול DNA. N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC), מבשר סינתטי של ציסטאין תאי וגלוטתיון, נמצא בשימוש נרחב כתרכובת נוגד חמצון. במחקר זה, אנו משתמשים NAC כדי לחקור את התפקיד של עקה חמצונית PM2.5- נזק DNA המושרה13.
דגי זברה כעליית חוליות מודל שימשו באופן נרחב לחקר התפתחות הלב ומחלות לב וכלי דם אנושיים מכיוון שמנגנונים של התפתחות הלב נשמרים מאוד בקרב בעלי חוליות14,15. היתרונות של שימוש בדגי זברה כמודל כוללים את גודלם הקטן, יכולת הרבייה החזקה ועלות האכלה נמוכה. עניין מיוחד במחקרים אלה, עוברים דג זברה אינם תלויים במערכת הדם במהלך ההתפתחות המוקדמת ויכולים לשרוד מום לב חמור14. יתר על כן, השקיפות שלהם מאפשרת את כל הגוף להיות נצפה ישירות תחת מיקרוסקופ. לכן, עוברים דגי זברה מספקים הזדמנות יוצאת דופן להערכת המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוס רעילות התפתחותית לבבית כתוצאה מחשיפה לכימיקלים סביבתיים שונים5,16,17. דיווחנו בעבר כי PM2.5- סטרס חמצוני המושרה מוביל לנזק DNA אפופטוזיס, וכתוצאה מכך מומים בלב דג זברה18. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקירת נזק DNA המושרה PM2.5בלב העוברים של דגי זברה.

<table><tbody><tr><td>8-OHdG נוגדן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"ב</td><td>sc-66036</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>Sartorius, סין</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>SW3015</td><td>לחסימת</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam, ארה"ב</td><td>ab104139</td><td>עבור כתם נגד גרעיני.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס, יפן</td><td>IX73</td><td>להדמיית אותות פלואורסצנטיים/</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG Cy3</td><td>קרלסבד, ארה"ב</td><td>CW0159</td><td>נוגדן עז</td></tr><tr><td>משני נגד ארנב IgG FITC</td><td>קרלסבד, ארה"ב</td><td>RS0003</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC)</td> <td>אדמס-בטא, שנחאי, סין</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>QILINBEIER, סין</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, סין</td><td>P6148</td><td>הכינו 4% paraformaldehyde לקיבוע.</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח HyClone, ארה"</td>ב <td>SH30256.01</td><td>הכן 0.1% טווין ב- PBS לכביסה.</td></tr><tr><td>דגימת PM2.5</td><td>טיאן-הונג, ווהאן, סין</td><td>TH-150C</td><td>לדגימת PM2.5 ללא הפרעה של 24 שעות.</td></tr><tr><td>מערכת חקלאות ימית במחזור מחדש</td><td>HaiSheng, שנחאי, סין</td><td></td><td>דג הזברה נשמר בה.</td></tr><tr><td>מחלץ Soxhlet</td><td>ZhengQiao, שנחאי, סין</td><td>BSXT-02</td><td>למיצוי רכיבים אורגניים.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון, קנדה</td><td>SMZ645</td><td>לדיסקציה של לב מעוברי דג זברה.</td></tr><tr><td>טריקאין מתאנסולפונאט (MS222)</td> <td>סיגמא, סין</td><td>E10521</td><td>להרדמת עוברי דג זברה</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, סין</td><td>P1379</td><td></td></tr> <tr><td>& gamma; נוגדן H2AX</td><td>Abcam, ארה"ב</td><td>ab26350</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr></tbody></table>

שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

חשיפה חלקיקית עדינה סביבתית (PM2.5)עלולה להוביל לרעילות התפתחותית של הלב, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם ברורים. 8-הידרוקסי-2'deoxygenase (8-OHdG) הוא סמן של נזק DNA חמצוני ו γH2AX הוא סמן רגיש עבור שברי גדיל כפול DNA. במחקר זה, אנו שואפים לזהות PM2.5-המושרה 8-OHdG ו γH2AX שינויים בלב של עוברים דג זברה באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנטיות. עוברים דגי זברה טופלו בעניינים אורגניים הניתנים לחילוץ (EOM) מ PM2.5 ב 5 מיקרוגרם / מ"ל בנוכחות או היעדר נוגד חמצון N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC, 0.25 מיקרומטר) ב 2 שעות לאחר ההפריה (hpf). DMSO שימש כפקד רכב. ב 72 כ"ס, לבבות נותחו מעוברים באמצעות מחט מזרק קבוע וחלחל. לאחר שנחסמו, דגימות נבדקו עם נוגדנים ראשוניים נגד 8-OHdG ו γH2AX. לאחר מכן נשטפו הדגימות ודגרו בנוגדנים משניים. התמונות שהתקבלו נצפו תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וכימותו באמצעות ImageJ. התוצאות מראות כי EOM מ PM2.5 משופר באופן משמעותי 8-OHdG ו γH2AX אותות בלב העוברים של דגי זברה. עם זאת, NAC, הפועל כנבלות חמצן תגובתי (ROS), נטרל חלקית את נזק ה- DNA שנגרם על ידי EOM. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסצנטיות לחקירת תפקידו של נזק לדנ"א ב- PM 2.5 - מומים בלב הנגרמים על ידי PM2.5שניתן להחיל על גילוי שינויים בביטוי חלבון סביבתי המושרה כימי בלבם של עוברים דגי זברה.

בדיקה חיסונית זו היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים בביטוי חלבונים בליבם של עוברים דגי זברה החשופים לכימיקלים סביבתיים.
בניתוח מייצג זה, עוברים שנחשפו PM2.5 בהיעדר או נוכחות של NAC נוגד חמצון הוערכו לנוכחות של מומים בלב (איור 1). כפי שנצפו, EOM מ PM2.5 גרם לעלייה משמעותית טרטוגנזה לב, כגון בצקת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל, לעומת לבבות שטופלו בקרה DMSO. קצב פעימות הלב...

פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות במדויק ובקלות את הביטוי של חלבוני היעד בלב דג הזברה. השינוי בחלבון היעד מזוהה ישירות על ידי מדידת אימונופלואורסצנטיות. בצע איסוף וטיפול בעוברי דגי זברה, כמתואר בכתב היד של הטקסט.ב 72 שעות לאחר ההפריה, להעביר את העוברים שקופיות זכוכית, ולצפות בהם תחת מיקרוסקופ סטריאו. הקלט מומים בלב, כגון בצורת קרום הלב, לולאה שונה וירידה בגודל. חשב שיעורי מום וניתח הבדלים בין קבוצות באמצעות ANOVA בכיוון אחד, ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טורקיה.לאחר להרדים את העוברים עם 0.6 מיליגרם למיליליטר MS222, להקליט פעימות לב במשך 30 שניות, ולכומת את קצב הלב באמצעות תוכנת Image J. בזהירות לנתח לבבות מעוברי דג זברה עם מחט מזרק חד פעמית תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על מגלשת זכוכית נקייה.הוסף 50 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde ל 1.25 microliters של PBS כדי להפוך פתרון קבוע, ולאחר מכן למקם שלושה לבבות ניתחו לתוך מעגל מחסום הידרופובי אחד, ודגרה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. דקת הפתרון מתחת למיקרוסקופ ולייבש את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפחות. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST במשך חמש דקות לכביסה.הוסף 50 מיקרוליטרים של BSA ל- 1, 000 מיקרוליטרים של PBST כדי להשיג פתרון 5%BSA, ודגר את השקופיות בתא לח למשך שעה אחת כדי לחסום כריכת נוגדנים לא ספציפית. פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לדלל שני microliters של נוגדן חד שבטי עכבר נגד 8-hydroxydeoxygugusine ושני microliters של נוגדן פוליקלונלי ארנב נגד גמא-H2AX ב 296 microliters של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים ראשוני עובד.לדגור על דגימות הלב עם 50 מיקרוליטרים של פתרון קוקטייל הנוגדנים העיקרי בתא לח לפחות שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. הדק את הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. לדלל microliter אחד של נוגדן משני נגד עכבר עיזים תווית FITC ומיקרוליטר אחד של psy-3 עיזים נגד ארנב נוגדן משני ב 500 microliters של PBST כדי לקבל פתרון קוקטייל נוגדנים משני עובד.לדגור על הדגימות עם הנוגדנים המשניים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. הוסף 20 מיקרוליטרים של DAPI לדגימות להכתמה גרעינית, ודגר אותם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.החל פתק כיסוי על השקופית ולאטום אותו עם לק כדי למנוע ייבוש ותנועה. צלם את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמת את האות הפלואורסצנטי של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים באמצעות הממוצע של דגימות בקרת DMSO וקבע את המשמעות הסטטיסטית של הנתונים.עוברים שנחשפו PM 2.5 בהיעדר או נוכחות של נוגד חמצון, N-אצטיל-L-ציסטאין, או NAC, הוערכו לנוכחות של מומים בלב. EOM מ PM 2.5 עלה עלייה משמעותית טרטוגנזה לב, כגון בצקת קרום הלב, לולאה שונה וירידה בגודל, לעומת לבבות מטופלים בקרת DMSO. קצב הלב גם ירד באופן משמעותי בעוברים שנחשפו ל- EOM.תוספת של NAC נכה מומים בלב הנגרמים על ידי EOM. בדיקת אימונופלואורסצנטיות שימשה להערכת היקף הנזק לדנ"א ברקמות שטופלו ב- EOM. רמות 8-הידרוקסידוקסיגואנוסין וביטוי גמא-H2AX עלו באופן משמעותי בליבם של עוברים דגי זברה שטופלו ב- EOM, מה שמצביע על עלייה בנזק לדנ"א חמצוני ושברים כפולים של DNA, בהתאמה.נזק ה-DNA שנגרם על ידי EOM היה מנוגד חלקית על ידי תוספי NAC. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש להקפיד בעת שטיפת הדגימות עם PBS, כי הלב דג זברה עשוי לקלף את השקופית.

using-immunofluorescence-to-detect-pm25-induced-dna-damage-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

סרטון זה מדגים בדיקה רגישה ביותר המבוססת על אימונופלואורסנציה לאיתור נזק חמצוני הנגרם על ידי PM2.5 בליבם של עוברי דגי זברה על ידי מדידת רמות 8-OHdG ו- γH2AX, המצביעות על נזק לדנ"א ושברי DNA דו-גדיליים, בהתאמה.

בדיקת Immunofluorescence לזיהוי נזק ל- DNA בתיווך PM2.5 בעוברי דגים

הפרעות גנטיות מסוימות או חשיפה לרעלים עלולות לשבש תהליכי התפתחות תקינים ולהוביל למוות של סוגי תאים ספציפיים. הניתוח של Caspase 3 המופעל על ידי אימונופלואורסצנציה שלמה בעוברי דג הזברה חושף לוקליזציה ספציפית לשלב ולרקמות של תאים העוברים אפופטוזיס באופן ספציפי.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

המטרה של פרוטוקול זה היא לפרט את השיטה החדשנית להערכת תפקוד הלב הסגור של הדגים העובריים תחת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים.

ניתוח הזחה של אוטם שריר הלב מכני (יהלום) חושף Segmental של תפקוד הלב של מעובריים בדג

אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

מחקר זה קובע שיטת הדמיה רגישה מבוססת אימונופלואורסצנציה לכימות מתילציה גלובלית של DNA בלבבות עובריים בודדים של דגי זברה. גישה זו מתגברת על האתגר של מגבלות חומר רקמה ועוקפת את הצורך בהמרת ביסולפיט.

זיהוי מתילציה גלובלית של DNA בלבבות זחלי דגי זברה

למד לזהות נזק ל-DNA בלבבות עוברי דגי זברה בעזרת חיסון פלואורסצנטי. השיטה מאפשרת זיהוי מדויק של ביטוי חלבונים ומעוותים לבביים כמו בצקת פריקרדיאלית ושינויי לולאה.

שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א_2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה

גלה סרטונים נוספים