Name: הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: למד שיטה יעילה להפרדת תאים זקיקים וביצים בזברהפיש באמצעות קפילרי זכוכית מושלש. טכניקה זו מפחיתה נזק לביצים ומאפשרת יישומי מחקר בביולוגיה התפתחותית ורבייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודת מחקר זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [32060170, 31601205 ו- 31560334], פרויקט חוקרים אורחים שנתמך על ידי מועצת המלגות של סין וקרן המעבדה המרכזית של המדינה לאקולוגיה של מים מתוקים וביוטכנולוגיה [2020FB05].

כל ההליכים המבוצעים בניסויי דגים הם בהתאם לתקנות ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הנורמלית הצפון-מערבית.
1. הכנות
<ol><li>חיות<ol>
<li>השתמש זברה נקבה בוגרת עם אורך גוף של 4-6 ס"מ. הערה: השתמשנו בזברהפיש משוק מקומי.</li>
		<li>שמור את דג הזברה במערכת מים מופצת עם אור 14 שעות ו 10 שעות מחזור כהה על 28 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להאכיל דגים פעמיים ביום עם שרימפס מלח שבקע לאחרונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נימי זכוכית משוכיים<ol>
<li>השתמש נימי זכוכית 15 ס"מ ומניחים את ראשו מבער אלכוהול כדי לחמם אותו. החזק קצה אחד של נימי זכוכית ביד והחזק את הקצה השני עם מלקחיים.</li>
		<li>לאחר חימום 5-10 שניות, הזכוכית על האש של מבער אלכוהול להיות אדום ורך. למתוח את הראש של נימי זכוכית עם מלקחיים כדי להפוך את הפתיחה נימי עם קוטר נדרש. הערה: הקוטר תלוי קטרים זקיק: previtellogenic (PV; קוטר של כ-0.30 מ"מ), ויטלוגני מוקדם (EV; קוטר של כ-0.40 מ"מ), מידוויטלוגני (MV; קוטר של כ-0.50 מ"מ), ויטלוגני מאוחר (קוטר של כ-0.60 מ"מ) וקוטרו מלא אך לא בוגר (FG; קוטר של כ-0.65 מ"מ).</li>
		<li>למתוח את הפתיחה של נימי זכוכית לקוטר המתאים, שהוא מעט קטן יותר בגודל של זקיקים מופרדים. נימי הזכוכית עם פתח גדול בהרבה מגודל זקיקי השחלות אינם יכולים לבצע הפרדה, אך הקטנים בהרבה ישברו את הזקיקים במהלך ההפרדה. תרגול מתיחה של נימי זכוכית מספר פעמים. הערה: זמן החימום תלוי בגודל נימי הזכוכית. אין למתוח ישירות את נימי הזכוכית על האש של מבער אלכוהול. זה ישבור את נימי הזכוכית.</li>
		<li>חותכים את נימי הזכוכית עם חותך אמפולה ולשבור את נימי זכוכית עם מלקחיים כדי לקבל חתך חלק. הערה: פתח חד או שבור של נימי הזכוכית יפגע בזקיקים.</li>
		<li>באמצעות צינור פלסטיק 30 ס"מ, להכניס קצה פיפטה 1 מ"ל עם אלמנט מסנן בקצה אחד, להכניס את נימי זכוכית משך בסוף פיפטה, ולחבר קצה פיפטה 200 μL בקצה אחר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הפרדת ביציות זברה ותאי זקיק בשלבים שונים
<ol><li>ניתוח השחלה של דג הזברה<ol>
<li>ממלאים דלי קרח עד 4/5 מלא בקרח תרחיף ומוסיפים מספיק מי דגים כדי לאפשר לקרח תרחיף לצוף. המתן 2-5 דקות, בדוק את טמפרטורת המים, וודא שהטמפרטורה היא בין 2-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש להנשים נקבות בוגרות על ידי הנחת דגים במי הקרח למשך 2-5 דקות לפחות, עד שהדגים יפסיקו את תנועת הזימים. ערפו את ראשם של הדגים על ידי ניתוק חוט השדרה באמצעות מספריים חדים כדי להבטיח את המוות.</li>
		<li>מניחים את הדג על צלחת הניתוח עם מלקחיים.</li>
		<li>השתמש בניתוח מספריים כדי לחתוך כדלקמן. לנתח מן הקלואקה לזימים לאורך קו האמצע של הבטן. חתוך מהחלק האחורי של הקלואקה. חותכים מהקצה הצדדי לצד הגבי. הסר בעדינות את העור והשרירים בצד אחד של הגוף. לחשוף את האיברים הפנימיים ולהוציא את השחלה כולה עם מלקחיים.</li>
		<li>מיד, מניחים את השחלות בעדינות לתוך צלחת תרבות 100 מ"מ המכיל 60% L-15 של ליבוביץ (L-15) בינוני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד זקיקי השחלות הערה: מערכת ההיערכות שאימצנו מבוססת על ההגדרה המקורית של סלמן ואח '4.<ol>
<li>באופן ידני לבודד זקיקים של שלבים שונים באמצעות זוג מלקחיים עדינים כמתואר בעבר8.</li>
		<li>קבץ את זקיקי השחלות לשלבים הבאים: שלבי PV, EV, MV, LV ו- FG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפרדת תאים זקיקיים וביצית מזקיקים בשחלות<ol>
<li>שים את זקיקי השחלות בשלבים שונים לתוך צלחת פטרי נקי המכיל 60% L-15 בינוני.</li>
		<li>באמצעות נימי זכוכית משך משלב 1.2, למצוץ את הזקיקים לתוך נימי זכוכית 2-3 ס"מ ולפוצץ אותם. הערה: כאשר קוטר הפתיחה של נימי הזכוכית מתאים, ניתן להפריד את הזקיק מן ביצית על ידי שאיפה פעם אחת.<ol>
<li>אם שכבת התא הזקיקית מחוברת לביצית בחוזקה, חזור 2-3 פעמים כדי להשיג הפרדה מלאה. הימנע ניסיונות מרובים לכפות זקיק דרך נימי קטן יותר, אשר יפגע זקיק. הערה: בתהליך של שאיפה ופיצוץ, השכבה הזקיקית נופלת ונפרדת מהביצית, ולבסוף, תאים זקיקיים וביציתות מקושטות מופרדים (איור 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>בריכה ביציות משופעת אך שלם ולאסוף את ביציות denuded ששרדו עבור מבחנים נוספים.</li>
		<li>כדי לחקור אם התאים הזקיקיים הופרדו מזקיקים שלמים, הכתימו את הזקיקים השלמים והפרידו ביציות עם 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI).<ol>
<li>לתקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde אגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 שעה. לשטוף מספר פעמים על ידי PBS.</li>
			<li>כתם על ידי DAPI ב RT במשך 30 דקות. נשטף מספר פעמים עם PBS. הצג וצלם במיקרוסקופ פלואורסצנטי (למשל, לייקה DFC7000 T).</li>
		</ol>
</li>
		<li>כדי לאשר את ההפרדה הושלמה, לתקן את הזקיקים שלמים ואת ביציות מופרדות ב 4% paraformaldehyde אגירה לילה ב 4 °C (69 °F), ולהטביע בינוני הקפאת intissue (למשל, לייקה) ב -25 °C (69 °F).<ol>
<li>חותכים את הרקמות הקבועות על מיקרוטום, ועולים על מגלשות זכוכית.</li>
			<li>שטפו את המקטעים ב- PBS והמחישו את גרעיני התא באמצעות DAPI. הצג וצלם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הפריה חוץ גופית (IVM) והפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית)
הערה: ההליך של IVM של IVF היה אחריו כמתואר קודם לכן עם שינוי מינורי 11,12,13.
<ol><li>הכינו מדיום התבגרות טרי (+מדיום DHP) לפני ניתוח השחלות של נקבת דג הזברה הבוגרת. להכנת מדיום ההבשלה הטרי, הוסיפו 9 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ, pH 9.0, ל-15 מ"ל צינורות חרוטים. הוסף 10 μL של 17α-20β-dihydroxy-4 פרגנן-3-אחד (DHP) (5 מ"ג / מ"ל), 490 μL של dH2O, ו 500 μL של 10% סרום שור אלבומין (BSA).</li>
	<li>הכינו את הפתרון של האנק ופתרון E3 מראש. הכן את הפתרון של הנקס כמתואר על ידי Baars ואח'14. הכן E3 בינוני: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, ו 1-5% מתילן כחול.</li>
	<li>בצע ניתוח של שחלת זברה-דג ובידוד של זקיקי השחלות כמו בשלבים 2.</li>
	<li>לאסוף זקיקי במה בוגרים ולהשתמש כמו ביציות לא בוגרות. עבור כל נקבה בוגרת זברה, לפחות 150-200 זקיקי במה בוגרים יכולים להיות מבודדים. בחר את הזקיקים שלמים ובריאים עבור IVM.</li>
	<li>דגירה זקיקי שלב בוגרים ב +DHP בינוני בצלחות 12-באר, בדיקה מעת לעת כדי להבטיח כי ביציות להישאר שלם. הסר את כל ביציות lysing עם פיפטה פסטר. הערה: במהלך התבגרות ביצית, ביציות יהפכו בהדרגה שקוף. רוב ביציות להיות שקוף לאחר טיפול DHP במשך 2 שעות. ניתן לראות זאת תחת מיקרוסקופ מנתח עם אופטיקת אור משודרת.</li>
	<li>הסר את התאים הזקיקיים החיצוניים ביותר מכל ביצית בוגרת כמתואר בשלב 2.3.</li>
	<li>מעבירים את הביציות המנוקדות לצלחת פטרי עם כמה טיפות של מדיום תרבותי וממשיכים להפריה.</li>
	<li>הכינו את תמיסת הזרע הטרי באמצעות אשכים שנותחו מלפחות שלושה זכרים ב-500 μL של הפתרון של הנקס. שים את תמיסת הזרע על קרח, שם הוא יכול לשמור על העוצמה של הפריה עד 2-3 שעות.</li>
	<li>הוסיפו 100 μL של תמיסת זרע ליציטים מנומרים והתבגרו על צלחת פטרי. מוסיפים בעדינות את תמיסת הזרע בין הביציות, ומסחררים את הזרע והביצים יחד בעזרת קצה פיפטה.</li>
	<li>מיד להוסיף 1 מ"ל של פתרון בינוני E3 כדי להפעיל את הביציות ושוב בעדינות מערבולת ביצים וזרע באמצעות קצה פיפטה.</li>
	<li>לאחר כדקה לאחר ההפריה (mpf), להציף את הצלחת עם פתרון בינוני E3. הרחבת chorion מלא ניתן לראות בתוך 10-15 mpf.</li>
	<li>בין 35-45 mpf, בחר את העוברים העוברים מחשוף סימטרי לשלב 2 תאים, אשר מופרים ולכן מופרים. הסר עוברים שאינם עוברים מחשוף תאים.</li>
	<li>אפשר לעוברים להתפתח בצלחת פטרי ב 28 מעלות צלזיוס, עם מגבלה של 80 עוברים לכל צלחת 10 ס"מ. הצג וצלם את התפתחות העובר.</li>
</ol>

<ol><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine%2Fparacrine+control+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endocrine/paracrine control of zebrafish development.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).</li>
<li>Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrafollicular+paracrine+communication+in+the+zebrafish+ovary%3A+the+state+of+the+art+of+an+emerging+model+for+the+study+of+vertebrate+folliculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).</li>
<li>Li, J., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+studying+ovarian+development%3A+Recent+advances+from+targeted+gene+knockout+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication+in+the+mammalian+ovary%3A+oocytes+carry+the+conversation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation.</a> Science. 296, 2178-2180 (2002).</li>
<li>Liu, L., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+9+and+its+spatiotemporal+expression+and+regulation+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary.</a> Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).</li>
<li>Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+%28PACAP%29+and+its+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+evidence+for+potentially+dual+roles+of+PACAP+in+controlling+final+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).</li>
<li>Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+3+is+involved+in+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish.</a> Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+G+protein-coupled+estrogen+receptor+1%2C+GPER%2C+in+inhibition+of+oocyte+maturation+by+endogenous+estrogens+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish.</a> Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).</li>
<li>Peyton, C., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+in+estrogen+inhibition+of+oocyte+maturation+mediated+through+the+G+protein-coupled+estrogen+receptor+%28Gper%29+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio).</a> Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).</li>
<li>Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+manipulation+of+maternal+gene+products+using+in+vitro+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).</li>
<li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135, 285-292 (2008).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+heat+shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).</li>
<li>Xie, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+based+on+in+vitro+oocyte+injection+to+improve+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 34555(2016).</li>
<li>Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+PDE9a+in+meiotic+maturation+of+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית להפרדה פשוטה ומהירה של תאים זקיקים וביציטים מזקיקים בשחלות זברה. לשיטה זו מספר יתרונות על פני השיטה המקובלת. העיקרי ביניהם הוא הקלות המוגברת מאוד של הפרדה עם יעילות ויעילות גבוהה, כמו רק מניפולציה אחת וחיצונית נדרשת. נקודה זו מגבירה את הישימות לחוקרים שאינם טובים באנטומיה מיקרוסקופית. על פי הניסיון שלנו, ניתן להפריד בהצלחה תאים זקיקים וביציטים מזקיק שלב בוגר בתוך 5-10 s באמצעות נימי זכוכית. עם זאת, לפחות 30-60 s יש צורך לעשות הפרדה זו באמצעות מלקחיים. חשוב מכך, בדרך כלל לפחות 20% של ביציות denu...

זברהפיש הוא אורגניזם מודל מרכזי לחקר התפתחות בעלי חוליות ופיזיולוגיה. דג הזברה יכול לשמש מודל טוב לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות השחלות1,2,3. תכונות רבות של התפתחות השחלות נשמרות הרבה במהלך האבולוציה מדגים ליונקים1,2. בדומה בעלי חוליות אחרים, מבוגרים זברה יש שחלות אסינכרוניות, המכיל זקיקי השחלות של כל השלבים ההתפתחותיים4. הזקיק הוא מרכיב הרבייה הבסיסי של השחלה. הזקיק מורכב מן ביצית כי הוא מוקף אחד או כמה שכבות של תאים סומטיים הנקראים תאים זקיקים. התפתחות הזקיקים תלויה בתקשורת הדו-כיוונית בין ביציות לתאים זקיקיים5. חיוני להפריד תאים זקיקים וביצים מזקיקים בשחלות למטרות מחקר שונות כגון תרבות ראשונית של תאים זקיקים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות ביציות והפריה חוץ גופית.
שיטות ההפרדה המסורתיות כוללות הפרדה מכנית על ידי מלקחיים ועיכול אנזימטי6,7,8,9,10. עם זאת, ההפרדה המכנית על ידי מלקחיים היא זמן רב ומייגע. זה גם יגרום לנזק גבוה ביצית במהלך ההפרדה. למרות ששיטת עיכול האנזים פשוטה לתפעול ודורשת זמן קצר, יש לאמת את זמן הטיפול ואת ריכוז האנזימים, ושיעור השלמות וההישרדות של ביציות מבודדות אינם אידיאליים. לכן, הקמנו שיטה פשוטה להפריד בין שני התאים בשלבים התפתחותיים שונים באמצעות צינורות נימי זכוכית משוכים.

<table><tbody><tr><td>17&alpha;,20&beta;-DHP</td><td>קיימן</td><td>16146-5 (5 מ"ג)</td><td></td></tr><tr>חותך אמפולה <td>קורנינג</td><td>3524</td><td></td> <td>צלחת 24 בארות</td></tr><tr><td></td><td>AS ONE</td><td>5-124-22 שקית אחת (100 חתיכות)</td><td></td></tr> <tr><td>נטול מים Na2HPO4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>שרימפס מלח</td><td>Hongjie</td><td>250 גרם</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית</td><td>Biosharp</td><td>BS-90-D (10 יחידות/PK)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>S2110 (25 מ"ל)</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ חיתוך</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לדיסקציה</td><td>VETUS</td><td>HRC30</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לדיסקציה</td><td>קפו</td><td>160 מ"מ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P (200 יח'/חבילה)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Solarbio</td><td>C0031 (1 מ"ג)</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>KH<תת>2</תת>PO<תת>4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ' s L-15 בינוני</td><td>Gibco</td><td>41300-039 (10& פעמים; 1L)</td><td></td></tr> <tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>Penicilia-streptomycia</td><td>Gibco</td><td>#15140122 (100 מ"ל)</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ZEISS</td><td>Discover.v20</td><td></td></tr></tbody></table>

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

זברה-פיש הפך למודל אידיאלי לחקר התפתחות השחלות של בעלי חוליות. הזקיק הוא היחידה הבסיסית של השחלה, המורכבת ביציות ותאי זקיקים שמסביב. חיוני להפריד הן תאים זקיקיים והן ביציות למטרות מחקר שונות כגון לתרבות ראשונית של תאים זקיקיים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות ביציות והפריה חוץ גופית וכו '. השיטה המקובלת משתמשת במלקחיים כדי להפריד בין שני התאים, שהם מייגעים, גוזלים זמן רב ויש להם נזק גבוה לבית החרמש. כאן, הקמנו שיטה פשוטה להפריד בין שני התאים באמצעות נימי זכוכית משוכים. תחת סטריאומיקרוסקופ, ביציות ותאי זקיק ניתן להפריד בקלות על ידי pipetting נימי זכוכית דק משך (הקוטר תלוי בקוטר זקיק). בהשוואה לשיטה המקובלת, שיטה חדשה זו יש יעילות גבוהה בהפרדת ביציות ותאים זקיקים ויש לו נזק נמוך ביציות. חשוב מכך, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זקיקים בשלב מוקדם כולל בשלב טרום vitellogenesis. לכן, שיטה פשוטה זו יכולה לשמש כדי להפריד תאים זקיקים וביציטים של זברה.

שיטה זו יכולה לשמש כדי להפריד תאים זקיקים ביציות בשלבים שונים של התפתחות זקיק השחלות ב zebrafish. איור 1 מראה את ההפרדה בין ביציות זברה ותאי זקיקים מזקיקים בשחלות באמצעות צינור זכוכית נימי(איור 1). כדי לחקור אם התאים הזקיקיים הופרדו מזקיקים שלמים, הזקיקים שלמים וביציטים מופרדים משלבים שונים של זקיקים משלב PV לשלב FG היו מוכתמים ב- DAPI (50 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הגרעין של תאים זקיקיים יכול להיות מוכתם על ידי DAPI. האות הכחול של DAPI נצפה...

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להפרדת תאים זקיקיים וביצית בזקיקים השחלות זברה, אשר יקל על חקירות של התפתחות השחלות ב זברה.

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד תאים זקיקיים ו Oocytes בזקיק השחלות של זברה. הזקיקים הם היחידה הבסיסית של השחלה, המורכבת מהאוציטים ומהתאים הזקיקיים שמסביב. זהו הכלי הרחב להפריד הן את התא הזקיקי והן את התאים החיצוניים למדיניות מחקרית היטב, כולל לכידה ראשונית של תאים זקיקיים ועולה על ביטוי גנים, כל הרוויה והפריה חוץ גופית.לאחרונה, הזברהפיש הפך למודל רב עוצמה של ניסאן, שחוקרת שליטה בהתפתחות כבר. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה, כך מפריד תאים זקיקיים וביציתות של זברהפיש זקיק אשר יאפשר חקירות של התפתחות כבר זברה המסחרי, אין מסה או שני נפרדים על תאים זקיקיים וכל הצדדים של ספינים משתמשים פוסט אשר יש מבוך, זמן רב היה נזק גבוה מבחוץ. כאן, הקמנו שיטה פשוטה לשני תאים נפרדים באמצעות משקפיים או חלק שיעור טמלה תחת שונית טהורה.היקף המטרו שלנו, הן בחוץ והן בתאים הזקיקיים ניתן לפברק בקלות על ידי הקלדת נימי זכוכית משך. ראשית, להכין נימי זכוכית משורר. הכה את ראשו של נימי זכוכית על מבער האלכוהול.השתמש בארבעה צדדים כדי למתוח את נימי הזכוכית לקוטר כרטיס הרייב. שנית, לדכא את זה overate מן הדגים נקבה בוגרת, לבודד זקיקי השחלות מן השחלה. לבסוף להשתמש נימי זכוכית נשאל כדי להפריד תא זקיקים ו Oocyte מזקיקי השחלות.מכינים את נימי הזכוכית, מיכל חדות, חותך בשפע, מבער אלכוהול ומלקחיים. שקר מבער אלכוהול, לקחת הביתה ני

separation-follicular-cells-oocytes-ovarian-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבשלה חוץ גופית של ביציות דג הזברה המשמש מניפולציה של מוצרים הגן האימהי מוצג כאן.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

קידום המחקר של פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית דורש שיטות יעילות לבידוד זקיקים משחלות בודדות. מוצג כאן פרוטוקול מכני יעיל לבידוד זקיקים משחלות בקר באמצעות מסוק רקמות והומוגנייזר. שיטה זו מאפשרת איסוף של מספר רב של זקיקים פרה-אנטרליים בני קיימא משחלה אחת.

בידוד זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלת הבקר באמצעות שילוב של פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי

פרוטוקול זה מתאר הליך שונה לבידוד מהיר של ביציות נקיות בשלב I בדגי זברה נטולות תאי גרנולוסה, ובכך מספק שיטה נוחה למחקר ספציפי לביציות.

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להפרדת תאי חלמון, גרנולוזה ותאי תקה בזקיקי קדם-ביוץ של עופות. טיפול מדויק זה מאפשר חקירות קריטיות של תפקידן של שכבות אלה בתפקוד הרבייה, ומסייע להבנת התפתחות הזקיקים, ויסות הורמונלי וחקר מחלות לשיפור התפוקה החקלאית ותובנות ביו-רפואיות.

הפרדה של גרנולוזה של זקיקי קדם-ביוץ של עופות ושכבות תאי Theca ליישומים במורד הזרם

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

אנו מציגים את הטכניקות הנדרשות לבידוד מקטע כלי הדם הסטרומלי (SVF) ממאגרי רקמות שומן מפשעתיים (תת עוריים) ופריגונדלים (קרביים) של עכברים כדי להעריך את ביטוי הגנים והפעילות הקולגנוליטית שלהם. שיטה זו כוללת העשרה של תאי גזעשמקורם בשומן גבוה Sca1 (ASCs) באמצעות הפרדת תאים אימונומגנטיים.

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

כתב יד זה מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין ביציות סוסים. באופן ספציפי, העבודה הנוכחית מדגימה כיצד לאסוף ביציות של בוגר בוגרת ובוגרת על ידי אולטראסאונד מונחה איסוף ביצית (OPU) וכיצד לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, acetylation היסטון גלובלי, ביטוי mRNA.

ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות

למד שיטה יעילה להפרדת תאים זקיקים וביצים בזברהפיש באמצעות קפילרי זכוכית מושלש. טכניקה זו מפחיתה נזק לביצים ומאפשרת יישומי מחקר בביולוגיה התפתחותית ורבייה.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

גלה סרטונים נוספים