הערכת תכולת תאית גבישית של ביומסה צמחית בשיטת Updegraff
15 במאי 2021
שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. המטרה העיקרית של הדגמה זו היא לספק פרוטוקול Updegraff מפורט להערכת תכולת תאית בדגימות ביומסה צמחית.
כאן, אנו מדגימים את שיטת Updegraff, השיטה הנפוצה ביותר בעולם להערכת תוכן תאית גבישית. תאית מורכבת בעצם מונומרים גלוקוז מקושר על ידי בטא 1, 4 קשרים גליקוסידיים. חילקנו את הפרוטוקול הזה לחמישה שלבים.
בשלב הראשון, אנו מכינים את החומר ביומסה הצמח. בשלב השני, אנחנו מוציאים את קיר התא הגולמי. בשלב השלישי, אנו משתמשים בטיפול Updegraff שבו Updegraff מורכב חומצה אצטית וחומצה חנקתית המסייעת בהסרת hemicellulose ו lignin מהדגימות שלנו.
בשלב הרביעי, אנו כפופים אותו חומצה הידרוליזה בעזרת חומצה גופרתית המייצרת מונומרים גלוקוז. לבסוף, בשלב החמישי, אנו משתמשים ב-anthrone assay כדי להעריך את תכולת התאית הגבישית. לאסוף את החומר הצמחי מהחממה, לשטוף אותם ביסודיות עם מים, אוויר יבש במשך יומיים, להפריד את הרקמה ולהעביר את הרקמה למיכלים המסומנים בנפרד דגירה באינקובטור ב 49 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים.
ואז לבסוף, לחתוך לחתיכות באמצעות מספריים או להב. להקפיא את הרקמה ולהעמיס לתוך מרגמה ועלי לטחינה עדינה לתוך אבקה אחידה או לחילופין להשתמש מקפיא / טחנה. כאן, אנו מדגימים באמצעות מקפיא / מיל, אז אנחנו מעמיסים את דגימות הרקמה שלנו לתוך בקבוקונים שחיקה אלה ומניחים אותם במקפיא / מיל ולהפעיל את מהירות 10 CP במשך שלושה מחזורים.
אבקת הרקמות נאספת בצינור פלקון כפי שמוצג כאן. שוקלים 20 מ"ג של אבקת הרקמה ומעבירים לצינור שני מ"ל שקל מראש. הוסיפו מ"ל אחד של מאגר סולובליזציה של חלבונים להסרת חלבונים. מערבולת.
צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את הסופרנט. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
מוסיפים מ"ל אחד של מים סטריליים לכדור השמור. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
הוסף ML אחד של 70% אתנול לכדור שנשמר. מערבולת. מעבירים לבלוק צלזיוס שחומם מראש ב-70 מעלות עם רעידות בו זמנית למשך שעה. לאחר דגירה של שעה, צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך חמש דקות.
חזור על שלב זה פעם נוספת. לכדור שנשמר, להוסיף מ"ל אחד של 100% מתילון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות.
הוסף ML אחד של מתנול כלורופורם. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את supernatant ולהוסיף mL אחד של אצטון. מערבולת.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. להשליך מחדש את supernatant ואוויר לייבש אותם ב 37 מעלות צלזיוס לילה או להמשיך על ידי ייבוש ואקום.
לטעון את הדגימות שלך לתוך מייבש ואקום ואוויר יבש במשך שעתיים עד שלוש שעות או עד גלולה יבש לחלוטין. לשקול חמישה מ"ג של תמצית דופן התא המתקבל מהשלב הקודם. העברה לצינור כובע בורג 2 מ"ל.
כלול גם שליטה חיובית בשלב זה. השתמש בשני מ"ג של נייר מסנן Whatman למטרה זו. העבר לצינור כובע בורג של שני מ"ל.
הוסף 1.5 מ"ל של ריאגנט Updegraff לכל תמצית קיר התא שקל. וורטקס ודגרת ב 100 מעלות צלזיוס בבלוק שחומם מראש במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות דגירה, להעביר למדף.
אפשר לו להתקרר על הספסל במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד ל-10 דקות. להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה.
מוסיפים מ"ל אחד של מים סטריליים. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד ל-10 דקות. השלך 500 מיקרוליטרים של העל-טבעי.
הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך ML אחד של העל-טבעי.
הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את העל-טבעי לחלוטין.
הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את הסופרנט.
יבש ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר דגירה של לילה אחד, העבר למדף. הוסף מ"ל אחד של 67% חומצה גופרתית. מערבולת.
דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם רעידות בו זמנית. לאחר דגירה של שעה, ודא את גלולה מומס לחלוטין. העבר למדף.
זהו השלב האחרון של החילוץ תאית. עכשיו הדגימות מוכנות לדילול דגימה. לדילול הדגימה, השתמשו ב-10 מיקרוליטרים של כל דגימה מהשלב הקודם והוסיפו 490 מיקרוליטרים של מים סטריליים.
חזור על זה לכל הדגימות הניסיוניות. להכנת עקומת הגלוקוז הסטנדרטית, הכינו מלאי טרי של מ"ג אחד לכל מ"ל גלוקוז והכינו אפס מיקרוגרם ל-200 ריכוזי מיקרוגרם על ידי הוספת מ"ג אחד לכל מ"ל גלוקוז במרווחים של 20 מיקרוליטר והגדלת הנפח הסופי ל-mL אחד עם מים סטריליים. יש ליטול 500 מיקרוליטר מכל תקן מוכן בצינור כובע בורג ולהוסיף 0.2% אנתרון מ"ל אחד.
ועכשיו הדגימות מוכנות לבדיקת אנתרון. הוסף מ"ל אחד של אנתרון שהוכן טרי. מערבבים מיד על ידי מערבולת ומעבירים לקרח.
חזור על הפעולה עבור כל הסטנדרטים והדגימות באותו אופן. לאחר מכן העבר לגוש צלזיוס שחומם מראש ל-100 מעלות למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות דגירה, להעביר קרח דגירה במשך חמש דקות על הקרח.
לאחר הדגירה, יש ליטול 200 מיקרוליטרים של כל דגימה בשלושה עותקים משוכפלים. חזור על הפעולה הן עבור תקנים והן עבור דוגמאות באותו אופן. וצלחת טעונה של 96 באר הועמסה לגלאי רב-מוד.
באמצעות תוכנית Smart Max Pro, הגדרנו את הגדרת המסנן ל- 620 ננומטר. סוג לוח לסוג של 96 באר. בחר את כל אזור הקריאה.
לחץ על אישור. קרא. קרא צלחת. אתה מקבל את קריאות הספיגה הן של תקנים והן של דוגמאות, שייאספו בגיליון Excel לצורך ניתוח נוסף והערכת תוכן תאית.
עקומת תקן גלוקוז מוכנה באמצעות ריכוזי הגלוקוז במיקרוגרם ל-mL על ציר x וערכי הספיגה המנורמלים של הריכוז המתאים ב-620 ננומטר על ציר ה-y. אנחנו מקבלים את קו הרגרסיה עם ערכי m ו- c בגרף הפיזור התואם שאנו משתמשים בו כדי להעריך את תכולת התאית הגבישית לדוגמה. בשלב הראשון, אנחנו ממוצע ערכי OD ב 620 ננומטר.
ואז נרמלנו את הנתונים על ידי חיסור הערך הריק. אנו מחשבים את ריכוז הסוכר באמצעות הנוסחה x שווה OD מינוס c/m שבו אנו מחברים c ו- m ערכים מהשלב הקודם של קו הרגרסיה בעקומה הסטנדרטית. מכיוון שהנפח הכולל ששימש לבדיקת אנתרון הוא 500 מיקרוליטרים, אנו מחלקים אותו בגורם דילול 2.
מכיוון שנפח הדגימה שהיה בשימוש היה רק 10 מיקרוליטרים, נתחלק עוד יותר ב-10 כדי לקבל מיקרוגרם לריכוז מיקרוליטר של גלוקוז השווה לריכוז מ"ג ל-mL. ואז השתמשנו בגורם הלחות 1.11 שהוא רווח הלחות בתהליך. ולבסוף, אנו מחשבים את אחוז התוכן תאית גבישית על ידי חלוקת אותו עם משקל דופן התא, אשר קרוב לחמישה מ"ג, ולהתרבות על ידי 100 כדי לקבל את האחוז.
ואז אנחנו ממוצע התוכן תאית גבישית של שלושה משכפלים ביולוגיים כדי לקבל את הערך עבור דגימות בודדות, אשר יושוו מול ממוצע קו ניסיוני אחר של שלושה משכפלים ביולוגיים. וניתן להשתמש במבחן t כדי לבחון את רמת המשמעות שלהם. כאן בטבלה A, אנו מציגים את ערכי הטבלה של הריכוז ואת OD בהתאמה ב 620 ננומטר, אשר שימש עוד יותר להתוות גרף פיזור וקו רגרסיה עם ערכי m ו- c ששימשו C להשגת הבדלי התוכן תאית בין שני קווי הניסוי.
לסיכום, שתי הדגימות מראות הבדלים בתאית. תודה שצפית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
הדגמה זו מפרטת את שיטת Updegraff, הטכניקה הנפוצה ביותר להערכת תכולת תאית גבישית בביומסה של צמחים. הפרוטוקול מחולק לחמישה שלבים נפרדים, המבטיחים גישה מקיפה להערכת התאית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של הצמחים
- הערכת תכולת תאית
- ניתוח ביומסה
רקע
- צלולוז מורכב ממונומרים של גלוקוז המקושרים באמצעות קשרי beta-1, 4 glycosidic.
- שיטת Updegraff חיונית להבנת הרכב הביומסה של צמחים.
- אומדן מדויק של צלולוז הוא קריטי למגוון מחקרים ביולוגיים ואקולוגיים.
- השיטה מסייעת בהבחנה בין צלולוז לרכיבים אחרים של דופן התא.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט להערכת תכולת תאית.
- שיפור ההבנה של הרכב הביומסה של צמחים.
- סיוע למחקר בביולוגיה של צמחים ובתחומים קשורים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת חומר ביומסה של צמחים.
- מיצוי דפנות תא גולמיות.
- טיפול Updegraff באמצעות חומצה אצטית וחומצה חנקית.
- הסרה של המיצלולוז וליגנין מהדגימות.
תוצאות עיקריות
- אומדן מוצלח של תכולת התאית בדגימות צמחים.
- הפרדה יעילה של תאית מרכיבים אחרים של דופן התא.
- הדגמה של מהימנות שיטת Updegraff.
מסקנות
- שיטת Updegraff היא טכניקה מהימנה להערכת תכולת תאית.
- הבנת תכולת התאית חיונית למחקר צמחים.
- ניתן להשתמש בפרוטוקול זה במגוון מחקרים ביולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הערכה כמותית של תאית גבישית בביומסה של צמחים היא קריטית עבור צוותי מו"פ בביופארמה המתמקדים באנרגיה ביולוגית, אופטימיזציה של חומרי גלם וביולוגיה של דופן התא. שיטת Updegraff מספקת סבב עבודה חסון וניתן לשחזור לבידוד ומדידה של תכולת התאית, ובכך תומכת בביטחון חיזוי באפיון ביומסה ובמחקרים השוואתיים. יכולת זו מהווה בסיס לגילויים מוקדמים, תיקוף מטרות ומחקר תרגומי בקווי ייצור של מוצרים ביולוגיים מבוססי צמחים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות מדויק של תאית עבור מחקרים מונחי-השערה על הרכב דופן התא הצמחי.
- תומך בתיקוף תפקודי של התערבויות גנטיות או כימיות המכוונות לביוסינתזה של תאית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד התאית מרכיבים מבלבלים של הדופן.
- מספק נקודות קצה כמותיות לצורך מיון תיקי פיתוח ותעדוף מטרות.
סקר ופיתוח בדיקה
- מספק הכנה סטנדרטית וניתנת לשחזור של דגימות עבור בדיקות קולורימטריות המשך.
- מאפשר סריקה בתפוקה גבוהה של קווי צמחים או טיפולים לצורך מדידת תנובת תאית.
- תומך בכיול הבדיקה באמצעות עקומות סטנדרט של גלוקוז ואנליזת רגרסיה.
- מבטיח תוצאים כמותיים ומהימנים לצורך הערכת תרכובת או תכונה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את אפיון הביומסה למטרות תרגומיות בתחומי הביו-אנרגיה והביוטכנולוגיה התעשייתית.
- מספק רצף מהשלב של הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של קווי צמחים מהונדסים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון המבוססות על מדדים כמותיים של תאית.
- תומך בביצוע השוואה (benchmarking) של חומרי גלם חדשים מול תקנים מבוססים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת Updegraff משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני של ביו-מוצרים מבוססי צמחים, ומאפשרת כימות מדויק של תאית בנקודות מפנה מרכזיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי בידוד תאית מביומסה מורכבת.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות ומסעות סריקה.
- אנליטיקה: מייצר מדידות מבוססות בליעה והערכות תאית המופקות מרגרסיה לצורך אנליטיקה השוואתית.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים להערכה פרה-קלינית של תכונות ביומסה הרלוונטיות ליישומים תעשייתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי ומאומץ באופן נרחב, הניתן להתאמה בין מיני צמחים ותוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות במחקרי הרכב דופן התא.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור לצורך כימות תאית.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ובמקצבת משאבים בקווי פיתוח של חומרי גלם ותכונות.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף של קווי צמחים או התערבויות בהתאם לסיכון, על בסיס נתונים כמותיים של תאית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בביומסה של צמחים וביצוע בדיקות קולורימטריות.
- נדרשת גישה לסנטריפוגה, לבלוקי חימום ומקראי פלטות רב-מצב (multimode plate readers) למדידת בליעה.
- דורש סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים לפרוטוקולים של הכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למיני צמחים וסוגי רקמות מגוונים באמצעות אופטימיזציה מתאימה.
- תלוי ביצירה מדויקת של עקומת סטנדרט ובניתוח סטטיסטי לצורך כימות מהימן.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:12
Phase I: Preparation of Samples
2:02
Phase II: Preparation of the Alcohol Insoluble Crude Cell Wall
4:52
Phase III: Removal of Hemicellulose and Lignin using Updegraff Reagent
7:10
Phase IV: Acid Hydrolysis of Cellulose into Glucose Monomers
7:49
Phase V: Anthrone Assay to Estimate the Glucose Concentration of Samples and Glucose Standard
10:04
Representative Results & Conclusion
