Name: אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: חקור פרוטוקול חדשני לתרבית רשתית אורגניוטיפית אנושית המשמר את כל שכבות הרשתית, RPE-כורואיד וסקלרה. שיטה זו מאפשרת מחקר מחלות רשתית ובדיקת תרופות טיפוליות חדשות בצורה קלינית רלוונטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לתורמים הנדיבים של רקמות עיניים ולצוות מבנק העיניים הלאומי של ניו זילנד על תמיכתם. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענקי פרויקטים מקרן מוריס ופיליס פיקל וקרן המחקר הרפואי של אוקלנד (1117015). הדירקטוריון של IDR נתמך על ידי קרן הצדקה ביוקנן. המלגה של CK ניתנת על ידי האגודה הניו זילנדית לחינוך ומחקר של האופטומטריסטים (CC36812) והמלגה של HHL ניתנת על ידי קרן הצדקה ביוקנן.

כוסות עיניים של תורמים אנושיים התקבלו מבנק העיניים הלאומי של ניו זילנד לאחר כריתת קרנית להשתלה וכפי שאושר על ידי ועדת האתיקה לבריאות ונכות צפון B (NTX/06/19/CPD/AM07).
הערה: התרבות צריכה להיעשות בארון בטיחות ביולוגית Class II כדי להבטיח תנאי תרבית רקמות סטריליים. הרקמות חייבות להיות בתרבית בתוך 24 שעות לאחר המוות כדי למנוע אובדן שלמות רשתית משמעותי.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig02.jpg"> איור 2: תמונות המציגות את הליך איסוף רשתית הכריכים. להכנת explant, השתמש במספריים לנתח עם קצה חד אחד וקצה קהה אחד, עם הקצה הקהה מול החלק הפנימי של כדור הארץ כדי להפחית את הנזק לרקמות במהלך החתירה. גם להשתמש במלקחיים עם קצוות קהים כדי למנוע גירוד הרקמות התוך עיניות במהלך הטיפול. באמצעות מספריים כירורגיים, עם הקצה הקהה פונה פנימה, לחתוך לאורך הלימבוס כדי להסיר את הקשתית ואת העדשה (A-C). ניתן לאתר את ה- ONH אם מסתכלים ישר לתוך העין הפתוחה(D). באמצעות מלקחיים עם קצות קהים, להחזיק את הסקלרה כדי לייצב את כדור הארץ (E). חלק את כדור הארץ אנכית לשני חצאים על ידי ביצוע שני חתכים עמוקים לכיוון ONH אבל לא לחתוך דרך ONH. חזור על זה לאורך מרידיאן האופקי (G). החל מלקחיים קהים על הסקלרה ופתח בעדינות את כדור הארץ לצורת תלתן (H-K). השתמש במלקחיים כדי לתפעל בזהירות את הזגג כדי להחליק את הרשתית המקופלת, כמו הזגג מושך על הרשתית, אבל לא לגעת הרשתית ישירות(אני). הסר את הזגג אם הוא גורם לניתוק רשתית או קיפול (לא מוצג באיור 2 מכיוון שהמצח זג זג;לא נלכד היטב בתמונות). אתר אזורים שבהם הרשתית שטוחה ולחלץ explants רשתית באמצעות טרפין כירורגי (L). החלת מלקחיים על sclera, בזהירות להעביר את explants הרשתית לתוך מדיום התרבות מוכן מראש (M,N). כל מסלק הכריך צריך לשקוע לתחתית הבאר בשל משקלו, ולכן כל explant שקוע במדיום(O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. מיצוי של סנדוויץ ' רשתית explants מן העין
<ol><li>הסר את הקשתית והעדשה.<ol>
<li>מניחים את העין בתוך צלחת פטרי, עם הקשתית והעדשה הפונה כלפי מעלה וראש עצב הראייה (ONH) יוצר קשר עם צלחת הפטרי(איור 2A).</li>
		<li>החזק את העין יציבה בלימבוס באמצעות מלקחיים(איור 2B).</li>
		<li>נתק את הקשתית והעדשה על-ידי ביצוע חתכים קטנים בהיקף לאורך הקצה החיצוני של הלימבוס(איור 2A).</li>
		<li>הסר את הקשתית ואת העדשה בזהירות. הימנעו מלהפריע ל רשתית במהלך מניפולציה (איור 2C). הערה: העדשה לא תיפול לתוך העין כפי שהוא מחובר, באמצעות סיבי zonule, לגוף ciliary.</li>
	</ol></li>
	<li>תשטח את העין.<ol>
<li>עם העין עדיין יושב זקוף, לזהות את ONH. זה קל יותר עם מקור אור לבן בהיר(איור 2D).</li>
		<li>יש להסית בארבעת הרביעים לכיוון ה-ONH (איור 2E). ניתן לסובב את צלחת הפטרי לטיפול קל יותר. אל תחתוך את ה- ONH.</li>
		<li>מורחים ומשטחים את העין בזהירות(איור 2E).</li>
		<li>החל את המלקחיים על sclera במקום הרשתית כדי למנוע שיבוש שלמות הרשתית. הערה: ניתוק רשתית היקפית וקיפול הוא בלתי נמנע, כמו המשקל של הזגזלת עולה על גדותיו ימשוך על הרשתית. באזורים אלה, להסיר את הזע על הגחלת כדי למנוע קיפול רשתית נוסף. זכור להשאיר זג זג כדי לייצב את הרשתית על גבי RPE-choroid ו sclera.</li>
	</ol></li>
	<li>לאסוף explants רשתית כריך.<ol>
<li>הניחו טרפין כירורגי על הרשתית באזור ללא קפלי רשתית(איור 2F).</li>
		<li>לחץ חזק כדי לחדור את sclera, אשר אמור ליצור צליל פיצוח.</li>
		<li>סובבו את הטרפין ב-180° כדי להבטיח שהסקלרה תיחדר במלואה, כך שזרוע הרשתית יופרד כעת מהרקמה הנותרת.</li>
		<li>החל את המלקחיים בסקלרה והעביר את רשתית הכריך למדיום התרבותי(איור 2G-I).</li>
		<li>להשיג 2-3 סנדוויץ 'explal explants מהרשתית ההיקפית של כל רבע. הערה: לעתים ניתן ללכוד את מגרש רשתית הכריכים בפתיחת הטרפין. בעזרת מלקחיים, מתגרה בעדינות בחלק קטן מבסיס הסקלרה. מצב זה מתרחש לעתים קרובות יותר כאשר הלהב קהה ועלולה לגרום לאובדן הרשתית(איור 3A-C).</li>
		<li>השתמש בטרפין חדש לאחר חיתוך 1-2 explants רשתית כמו הלהב הופך בוטה בקלות (איור 3C<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig03.jpg"> איור 3: פתרון בעיות. במהלך תהליך החילוץ, המסלק ברשתית עשוי להיות לכוד בפתיחת הטרפין הכירורגי (A). להקניט בעדינות את הרקמה מבסיס הסקלרה מבלי לגעת ברשתית (B). זה יכול לקרות לעתים קרובות יותר אם טרפין כירורגי משמש לחילוץ יותר משני explants רשתית, כמו הלהב יכול בקלות להיות בוטה (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
</li>
	</ol></li>
	<li>תרבות, מגרשי הרשתית.<ol>
<li>הכן את המדיום התרבותי המכיל את תערובת החומרים המזינים הבינוניים של Dulbecco F-12 (DMEM-F12) ותערובת אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה פי 1 (AA, מלאי 100x).</li>
		<li>לפני מיצוי explant, למקם 500 μL של בינוני בבארות של צלחת 24-well וישקול באינקובטור. זה חשוב כמו הוספת המדיום לאחר מכן יכול להפיץ את הרשתית.</li>
		<li>תרבות רשתית הכריך explants ב 37 °C (72 שעות) בחממה 5% CO2 לח בינוני מוכן בשלב 1.4.2.</li>
		<li>כדי לגרום לשינויים דמויי DR, רשתית תרבות explants בינוני המכיל DMEM-F12 עם שילוב של 32.5 מ"מ HG עם Cyt, TNF-α (10 ng/ mL) ו IL-1β (10 ננוגרם / מ"ל).</li>
	</ol></li>
</ol>2. הטמעת פרפין של תוחמי רשתית הכריך
<ol><li>תקן את מגרשי רשתית הכריכים.<ol>
<li>לטבול את explants רשתית כריך ב 10% פורמלין לפחות 24 שעות.</li>
		<li>מוציאים את תמיסת הפורמלין ומעבירים בעדינות את רשתית הכריך לרפידות רקמות וקלטות.</li>
		<li>משרים את רשתית הכריך ב-70% אתנול לפחות 24 שעות.</li>
		<li>מסלקי רשתית הטמעת פרפין לתוך בלוקים.</li>
		<li>חותכים רקמות רשתית מוטבעות פרפין לחלקים בעובי 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום ומורכבים על מגלשות זכוכית. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד להדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תפענח מקטעים.<ol>
<li>לטבול את החלקים ב 70% קסילן במשך 5 דקות.</li>
		<li>לטבול את המקטעים ב 100% קסילן במשך 5 דקות.</li>
		<li>Rehydrate את החלקים ב 70% אתנול במשך 5 דקות.</li>
		<li>Rehydrate את החלקים ב 100% אתנול במשך 5 דקות.</li>
		<li>לשטוף את החלקים תחת מי ברז זורמים במשך 10 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אפיון באמצעות H&amp;E, IHC ובוחן לומינקס מגנטי
<ol><li>פרוטוקול הכתמת H&amp;E<ol>
<li>להפוך את המקטעים לפיגומים באמצעות שלב 2.2.</li>
		<li>לחות את החלקים במי ברז במשך 5 דקות.</li>
		<li>כתים את החלקים בפתרון המטוקסילין 2 של גיל במשך 5 דקות.</li>
		<li>לשטוף את החלקים ביסודיות תחת מי ברז זורמים כדי להסיר כתם עודף.</li>
		<li>להבדיל על ידי טבילת החלקים פעמיים ב 1% אלכוהול חומצה.</li>
		<li>לשטוף את החלקים במהירות תחת מי ברז זורמים.</li>
		<li>מכתים את החלקים בכחול על ידי טבילה שש פעמים ב-1% ליתיום קרבונט (10 מ"ג/מ"ל).</li>
		<li>לשטוף את החלקים ביסודיות תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות כדי להסיר כתם כחול עודף.</li>
		<li>טובלים את המקטעים ב-1% אאוזין 10 פעמים.</li>
		<li>לשטוף את החלקים במהירות תחת מי ברז כדי להסיר כתם עודף.</li>
		<li>לייבש את החלקים על ידי טבילת אותם 10 פעמים ב 100% אתנול. תעשה את זה פעמיים.</li>
		<li>טובלים את החלקים ב-70% קסילן 10 פעמים.</li>
		<li>טובלים את המקטעים ב-100% קסילן 10 פעמים.</li>
		<li>הר עם כיסוי באמצעות דיבוטילפתלט פוליסטירן קסילן (DPX) הרכבה בינונית.</li>
		<li>צמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פרוטוקול תיוג IHC'<ol>
<li>להפוך את המקטעים לפיגומים באמצעות שלב 2.2.</li>
		<li>מניחים את השקופיות לתוך פתרון המכיל 10 mM נתרן סיטראט חוצץ עם 0.05% Tween 20 ב pH 6.0 ולהפעיל אחזור אנטיגן בסיר לחץ אוטומטי ב 121 °C (2 דקות).</li>
		<li>לשטוף חלקים מלוחים חוצץ פוספט (PBS) במשך 5 דקות. תעשה את זה 3 פעמים.</li>
		<li>חסמו את המקטעים עם PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 10% סרום עזים רגיל במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מקטעי דגירה בלילה ב 4 °C (55 °F) עם נוגדנים ראשוניים מצומדים נוגדנים משניים (טבלה של חומרים).</li>
		<li>לשטוף קטעים PBS במשך 5 דקות. תעשה את זה 3 פעמים.</li>
		<li>גרעיני כתמים באמצעות 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 2 דקות.</li>
		<li>יש לשטוף ולהרכיב מקטעים באמצעות ריאגנט נגד עמעום.</li>
		<li>חותם מכסה עם לק.</li>
		<li>צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מאמץ מגנטי של לומינקס<ol>
<li>העבר 75 μL של מדיה מכל באר ללוח 96-טוב u-התחתון ב 24 ו 72 שעות.</li>
		<li>נתחו את חומר-העל של התא עבור IL-18, IL-6, IL-8 ומקדם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) לאחר 24 ו-72 שעות באמצעות לבדיקת ציטוקינים של Luminex. בצע את הוראות היצרן כדי לבצע את ה- assay16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Webvision-The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22%5BJournal%5D)">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).</li>
<li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+serous+chorioretinopathy%3A+an+update+on+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li>
<li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+related+macular+degeneration+and+drusen%3A+neuroinflammation+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li>
<li>Chen, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li>
<li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li>
<li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+%28HORFC%29+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li>
<li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li>
<li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+human+organotypic+retinal+cultures+%28HORCs%29+to+study+retinal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).</li>
<li>Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organotypic+retinal+cultures+%28HORCs%29+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li>
<li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li>
<li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).</li>
<li>Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pigmented+epithelium+sustains+cell+growth+and+tissue+differentiation+of+chicken+retinal+explants+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro.</a> Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).</li>
<li>Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetologica%22%5BJournal%5D)">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li>
<li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li>
<li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice%3A+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156(2018).</li>
<li>R&D Systems, I. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020).</li>
<li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li>
<li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li>
<li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+explant+culture%3A+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li>
<li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta%2C+IL-6%2C+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Medica+%28Plovdiv%29%22%5BJournal%5D)">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li>
<li>Lee, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+type+2+diabetes+mellitus+patients+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).</li>
<li>Chorostowska-Wynimko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiomodulatory+activity+of+sera+from+type+2+diabetic+patients+with+background+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%3A+An+Official+Journal+of+the+Polish+Physiological+Society%22%5BJournal%5D)">In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy.</a> Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).</li>
<li>Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+interleukin+12+%28IL-12%29%2C+interferon-inducible+protein+10+%28IP-10%29+and+Interleukin+18+%28IL-18%29+in+the+angiogenic+activity+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Journal+of+Medicine+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy.</a> Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Wang, S., Xia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intravitreal+inflammatory+cytokines+and+angiogenic+factors+in+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy.</a> Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intravitreous+interleukin-18+correlated+to+vascular+endothelial+growth+factor+in+patients+with+active+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).</li>
<li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

HORC הוא כיום המודל הניתן לתרגום קליני ביותר במחקר רשתית פרה-קלינית. בהשוואה למודלים של תרבית תאי הפריה, HORC יכול לייצג טוב יותר את האנטומיה של הרשתית האנושית במקום, באמצעות שמירה על סוגי תאי הרשתית הדינמיים והקשרים שלהם עם נוירונים, כלי דם והסביבה החוץ תאית19. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, HORC הם יתרון גדול יותר בחקר הפתופיזיולוגיה של ועיצוב טיפולים תרופתיים למחלות רשתית אנושית בשל וריאציות בין מינים, כגון סוגי תאים ברשתית שונים, כמו גם צפיפות פוטורצפטור שונים ופרופורציות, אשר יכול לתרום לניסוי...

הרשתית היא מבנה עיני מיוחד מאוד האחראי על הפיכת אנרגיית אור נכנסת לאותות חשמליים, אשר מעובדים לאחר מכן על ידי המוח לתפיסה חזותית. הרשתית האנושית מכילה מגוון דינמי של סוגי תאים, מאורגן מאוד במבנה lamellar ייחודי המורכב משתישכבות סינפטיות ושלוש גרעינים 1 (איור 1). הומאוסטזיס ברשתית מתקיים על ידי הקשרים המורכבים בין תאים עצביים, כלי דם, עצבים, רקמות חיבור ו RPE1. בשל האנטומיה והפיזיולוגיה המתוחכמות של הרשתית, מנגנונים של מחלות רשתית רבות עדיין נשארים מובנים היטב2,3,4,5. כדי לחקור טוב יותר מחלות רשתית, מודלים HORC פותחו6,7,8,9. בהשוואה למחקרים בבעלי חיים ותרבויות במבחנה, מודלים HORC הם יתרון כי הם שומרים על הסביבה התאית הדינמית ואינטראקציות נוירווסקולריות מורכבות במקום, מתן מודל טוב לתרגום קליני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> איור 1: מבנים עיניים אחוריים של העין האנושית. שכבות הרשתית הקדמיות הקדמיות הן: שכבת סיבי עצב (NFL), שכבת תא גנגליון (GCL), שכבת plexiform פנימית (IPL), שכבה גרעינית פנימית (INL), שכבת plexiform חיצונית (OPL), שכבה גרעינית חיצונית (ONL), קטע פנימי של קולטן פוטו (IS) ושכבה חיצונית פוטורצפטור (OS). תאים בתוך הרשתית כוללים תאי גנגליון (כחול), תאי אמקרין (צהוב), תאים דו קוטביים (אדום), תאים אופקיים (סגול), קולטני מוט (ורוד) ופוטרצפטורים חרוט (ירוק). הזגית ממוקמת כמטרית לרשית. RPE, הממברנה של ברוך, choroid ו sclera ממוקמים אחוריים הרשתית. שים לב שהתמונה המוצגת היא רק ייצוג סכמטי של הרשתית והיחס בין התאים/קישוריות הרשתית בתוך כל שכבה עשוי שלא להעיד על ההגדרה in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בעבר אפיינו פרוטוקולי HORC6,7,8,9 מעורבים בהפרדת הרשתית מן RPE-choroid הבסיסי ו sclera באמצעות טרפין כירורגי. עם זאת, ללא התמיכה שמספקים מבנים בסיסיים אלה, הרשתית השקוף הופכת דקיקה, קשה לטיפול וכלים כגון מלקחיים יכולים בקלות לשבש את שלמותה. יתר על כן, בידוד רשתית בתרבות ללא RPE הוכח לגרום אפופטוזיס תא גנגליון ניוון פוטורצפטור10,11,12. לכן, פרוטוקול HORC חלופי שממזער את אובדן שלמות הרשתית ומחקה טוב יותר את סביבת in vivo יהיה שימושי. זה חשוב במיוחד כאשר לומדים מנגנוני מחלת הרשתית, כמו פגיעה גופנית במהלך טיפול explant יכול להציג חפצים. לכן, מטרת המחקר הזה הייתה לפתח מודל HORC חדשני הכולל את RPE-choroid ו sclera על מנת להגן על שלמות הרשתית במהלך טיפול explant ותרבות.
על מנת להשיג מטרה זו, explants רשתית "סנדוויץ'" בין הזגוזית שיורית ואת הבסיסי RPE-choroid ו sclera חולצו. בגולשי הכריך, הזגוכית מכבידה על הרשתית כדי למנוע ניתוק רשתית וקיפול, ואילו הסקלרה הקשוחה והסיבית משמשת גם כפיגומים לתמיכה מבנית וגם כנקודת מגע למלקחיים. יתר על כן, מודלים בעלי חיים הראו כי שמירה על RPE בתרבות יכול למנוע ניוון רשתית והתפשטות גליה, תגובה של תאי מולר לאותות סכנה כגון היפוקסיה ודלקת10,11,12.
כדי לאפיין את המודל, בוצעו explants רשתית כריך עם תיוג קצה ניק dematoxylin ו- Eosin (H&amp;E) כדי להעריך מבנים אנטומיים וחיסון חיסוני (IHC), תיוג explants עם מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP ניק סוף תיוג (TUNEL, סמן תא אפופוטוטי), חלבון חומצי סיביה (GFAP, דלקת רשתית וסמן הפעלת תא מולר), ו vimentin, סמן של שלמות התא מולר. כדי לקבוע אם מודל זה יכול להיות מושרה לפתח סימני מחלה מולקולרית, explants נחשפו גלוקוז גבוה (HG) עם ציטוקינים פרו דלקתיים (Cyt), אינטרלוקין-1β (IL-1β) וגורם נמק הגידול α (TNF-α), סביבת פולחן שהוכח לחקות רטינופתיה סוכרתית (DR) במודלים של מחלות תאים ובעלי חיים13,14,15. מבדקי Luminex שימשו במודל DR למדידת ציטוקינים ששוחררו למדיום התרבותי.

<table><tbody><tr><td>אגרופי ביופסיה חד פעמיים (5 מ"מ)</td> <td>Integra York PA Inc., ארה"</td>ב <td>21909-142</td><td>המכונה טרפינים כירורגיים במאמר זה</td></tr><tr><td>Human Recombinant IL-1&beta;</td><td>פפרוטק, ארה"ב</td><td>200-01B</td><td>ריכוז עבודה: 10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>רקומביננט אנושי&nbsp; TNF-a</td><td>Peprotech, ארה"ב</td><td>300-01A</td><td>ריכוז עבודה: 10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>DAPI (1 ומיקרו; g/mL)</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>#D9542</td><td>כתם גרעיני. דילול עבודה 1:1000</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., ארה"ב</td><td>10565018</td><td>Dulbecco' s תערובת תזונתית בינונית של נשר שונה F-12 המכילה 1 ופעמים; תערובת אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה (AA, 100 ופעמים; מלאי)</td></tr> <tr><td>מספריים עדינים - כלים מדעיים עדינים חדים-קהים</td><td>(FST)</td> <td>14028-10</td><td>טיפים: חד-בוטה, קצה חיתוך: 27 מ"מ, אורך: 10 ס"מ, סגסוגת / חומר: נירוסטה, משונן: לא, צורת קצה: מלקחיים ישרים</td></tr><tr><td>Graefe</td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>11050-10</td><td>אורך: 10 ס"מ, צורת קצה: ישר, טיפים: משונן, רוחב קצה: 0.8 מ"מ, מידות קצה: 0.8 x 0.7 מ"מ, סגסוגת/חומרים:</td></tr><tr><td>עכבר נירוסטה מונוקלונלי GFAP-Cy3</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>#C9205</td><td>נוגדן ראשוני מצומד ל-Cy3. דילול עבודה 1:1000.</td></tr><tr><td>עכבר חד-שבטי Vimentin-Cy3</td><td>Sigma Aldrich, גרמניה#C9080</td><td></td> <td>נוגדן ראשוני מצומד ל-Cy3. דילול עבודה 1:50.</td></tr><tr><td>TUNEL רב-שבטי של ארנב (ערכת זיהוי מוות של תאים באתר, פלואורסצאין)</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td> <td>#11684795910</td><td>נוגדן ראשוני מצומד ל-Fluorescein-dUTP. דילול עבודה 1:10 עם תמיסת חיץ אנזים.</td></tr></tbody></table>

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

דגמי תרבות הרשתית האורגנוטיפית האנושית הקודמת (HORC) השתמשו ברשתיות מנותקות; עם זאת, ללא התמיכה המבנית המוענקת על ידי אפיתל פיגמנט רשתית-choroid (RPE-choroid) ו sclera, השלמות של הרשתית שבירה יכול בקלות להיות בסכנה. מטרת המחקר הזה הייתה לפתח מודל HORC חדשני המכיל את הרשתית, RPE-choroid ו sclera כדי לשמור על שלמות הרשתית בעת פולחן explants רשתית.
לאחר חיתוך היקפי לאורך הלימבוס כדי להסיר קשתית ועדשה, ארבעה חתכים עמוקים נעשו כדי לשטח את העין. בניגוד לפרוטוקולים קודמים של HORC, נעשה שימוש בטרפין כדי לחתוך לא רק את הרשתית אלא גם את RPE-choroid ו sclera. המהדורות המשולשות שהתקבלו היו בתרבית במשך 72 שעות. ההמטוקסילין והכתמת אאוזין (H&E) שימשו להערכת מבנים אנטומיים ו explants ברשתית התאפיינו עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) עבור אפופטוזיס, שלמות התא מולר ודלקת ברשתית. כדי לאשר את האפשרות של אינדוקציה המחלה, explants נחשפו גלוקוז גבוה (HG) וציטוקינים פרו דלקתיים (Cyt), כדי לחקות רטינופתיה סוכרתית (DR). חרוזים מגנטיים Luminex שימש למדידת ציטוקינים הקשורים DR שוחרר לתוך המדיום התרבותי.
כתמי H&E חשפו לאמלי רשתית ברורה וגרפיעים קומפקטיים בגרשי רשתית עם RPE-choroid ו sclera הבסיסיים, בעוד רשתיות ללא המבנים הבסיסיים הציגו עובי מופחת ואובדן גרעינים חמור. תוצאות IHC הצביעו על היעדר אפופטוזיס ודלקת ברשתית, כמו גם על שלמות תאי מולר שנשמרה. בדיקות Luminex הראו הפרשה מוגברת באופן משמעותי של ציטוקינים פרו דלקתיים הקשורים DR ב explants ברשתית שנחשפו HG + Cyt ביחס לרמות הבסיס ב 24 שעות.
פיתחנו ואיפיינו בהצלחה פרוטוקול HORC חדשני שבו שלמות הרשתית נשמרה ללא אפופטוזיס או דלקת ברשתית. יתר על כן, הפרשה המושרה של סמנים ביולוגיים פרו דלקתיים הקשורים DR בעת חשיפת explants רשתית HG + Cyt מציע כי מודל זה יכול לשמש למחקרי מחלות רשתית לתרגום קליני.

שלמות הרשתית נשמרה במודל HORC זה. שלמות הרשתית נשמרה ברשתית הכריכים התרבותית אך אבדה ברשתית בתרבית ללא מבנים סמוכים. H&amp;E נערך כדי לבחון את השלמות המבנית של explants רשתית כריך חתך לאחר 72 שעות בתרבות. מגרשי רשתית הכריכים הראו שלמות משומרת ומבנה lamellae מובחן מ- GCL ל- ONL עם גרעינים קומפקטיים ב- INL ו- ONL (איור 4A). עם זאת, שלמות הרשתית משובשת נמצאה בשולי אותה דגימה, שם הרשתית התנתקה מה- RPE-choroid והסקלרה הבסיסיים, והראתה עובי רשתית ...

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

טכניקה זו משמרת את כל שכבות הרשתית וסוגי התאים במקום, מה שהופך אותה לרלוונטית יותר מבחינה קלינית בהשוואה למודלים של בעלי חיים ומוחן. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא ממזער הפרעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול ברקמות, החיוניות בעת השוואת רשתית בריאה וחולים. מחלות רשתית ניתן להחיות על ידי פולחן הרקמה בתנאים ספציפיים.זה מאפשר בדיקה של טיפולים תרופתיים חדשים. הליכי הניתוח והאיסוף לדוגמה מורכבים. לכן, הדגמה חזותית היא קריטית כדי לעזור לקוראים להבין את הפרוטוקול הכתוב ולנהל את ההליך בהצלחה.מדגים את ההליך יהיה צ'ריס קו, סטודנט שנה שנייה לדוקטורט מהמעבדה שלי. הכן את המדיום התרבותי המכיל את תערובת הנשר הבינוני/מודין F-12 של Dulbecco ותערובת אנטיביוטיקה ותרופות אנטי-מיקוטיקה. ראשית, למקם 500 microliters של בינוני בצלחת 24-well וישית אותו בחממה לחה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.הכנת התקשורת לפני החילוץ המסביר נמנעת מהתנתקות מהרשתית עם התוספת הבאה. לחילוץ פסולת רשתית, התחילו בהנחת העיית על צלחת פטרי עם הקשתית והעדשה הפונה כלפי מעלה וה- ONH יוצר קשר עם צלחת הפטרי. החזק את העין יציבה בלימבוס באמצעות מלקחיים וניתק את הקשתית והעדשה על ידי ביצוע חתכים קטנים בהיקף לאורך הקצה החיצוני של הלימבוס.הסר את הקשתית ואת העדשה בזהירות, הקפדה להימנע הפרעה הרשתית. זהה את ה- ONH באמצעות מקור אור לבן בוהק וסיתע בארבעת הרבעים לכיוון ה- ONH המסובב את צלחת הפטרי לטיפול קל יותר. מורחים ומשטחים את העית בזהירות.החל את המלקחיים על הסקלרה במקום הרשתית כדי למנוע שיבוש שלמות הרשתית. הסר את הצלחת המכילה את המדיה המוכנה מן האינקובטור. מניחים טרפין כירורגי על הרשתית באזור ללא קפלי רשתית ולוחצים חזק כדי לחדור את הסקלרה, אשר אמור ליצור צליל פיצוח כפי שאתה לשבור את צלחת פטרי.סובב את הטרפין כדי להבטיח שהסקלרה חדרה במלואה כך שגירוש הרשתית מופרד כעת משאר המדגם. החל את המלקחיים על sclera ולהעביר את explant רשתית כריך למדיום התרבות. תרבות רשתית הכריכים שנאספו ב-37 מעלות צלזיוס עד 72 שעות בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני.כתמי המטוקסילין ואוסין הראו כי רשתות הכריך שמרו על שלמות ומבנה lamellae מובחן מה- GCL ועד ה- ONL עם גרעינים קומפקטיים בשכבות הגרעיניות הפנימיות והחיצוניות. שלמות רשתית משובשת נמצאה בשולי אותה מדגם שבו הרשתית התנתקה מהכורואיד והסקלרה הבסיסיים המציגים עובי רשתית מופחת ואובדן גרעינים ב- INL וב- ONL. לא נמצאו גרעיני תאים חיוביים TUNEL, המסמן אפופטוזיס תאי, נמצאו explants רשתית תרבית בתנאים בסיסיים, להפגין חיוניות תאית מתמשכת גם לאחר 72 שעות.תיוג GFAP הוגבל ל- GCL ול- IPL ללא פיברוזיס גליה, סימן לפתולוגיה אשר יזוהה כביטוי מורחב של GFAP לתוך ONL. Vimentin התבטא מאוד משכיית תא הגנגליון לשכבה הגרעינית החיצונית, מראה שלמות תא מולר השתמר כפי שניתן לראות ברקמות רשתית נורמליות. בדיקת מג'ייז מגנטית Luminex הראתה כי IL-18, VEGF, IL-6 ו- IL-8 גדלו באופן משמעותי מעל קו הבסיס בתרביות explant רשתית כריך גלוקוז גבוה וציטוקינים פרו דלקתיים לאחר 24 שעות.לאחר 72 שעות, רמות IL-18 ו-VEGF נותרו גבוהות משמעותית, אך לא נמצא הבדל משמעותי ברמות IL-6 ו-IL-8. בעת ביצוע הליך זה, להשאיר מספיק שרץ שיורית, אשר ישקול את הרשתית למטה, כך שהוא לא להתנתק choroid RP לצוף בתקשורת התרבות. הרשתית התרבותית יכולה להיות מאופיינת עוד יותר באמצעות אימונוהיסטוכימיה והיסטולוגיה, בעוד שניתן למדוד את הציטוקינים הדלקתיים המשתחררים למדיום התרבותי באמצעות בדיקה מגנטית של Luminex.מודל זה ניתן לתרגום קליני יותר בהשוואה למודלים של בעלי חיים ומבחנה, מה שהופך מתאים יותר לבדיקת היעילות של תרופות טיפוליות חדשניות למחלות רשתית.

characterization-novel-human-organotypic-retinal-culture

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מדגים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות...

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי הבוגרת במשך שבעה ימים. בקצרה, נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן הרשתית ואת photoreceptor מקום על הצד להוסיף שהעלו לעמוד מחוייט.

תרבות Organotypic של הרשתית מלא עובי למבוגרים חזירי

הפרוטוקול מתאר explants organotypic שלרשתית נוירוהעכבר , מעובד יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE), במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע, זולה יותר וגוזלת זמן בהשוואה לניסויי vivo, וניתן להתאים אותה ליישומים ניסיוניים רבים.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים ומשתמשים בהם בבדיקת רעילות קולטני אור כדי לזהות מועמדים תרופתיים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).

מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

פרוטוקול זה משלב ניקוי אופטי ותיוג חיסוני להדמיה קונפוקלית בנפח מלא של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא משמר מבנה תלת מימדי, מאפשר הדמיה מפורטת של מסלולים עצביים מרכזיים, משפר את חקר הבשלת הרשתית, ארגון מרחבי ויישומיו הפוטנציאליים במודלים של מחלות ורפואה מותאמת אישית.

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

חקור פרוטוקול חדשני לתרבית רשתית אורגניוטיפית אנושית המשמר את כל שכבות הרשתית, RPE-כורואיד וסקלרה. שיטה זו מאפשרת מחקר מחלות רשתית ובדיקת תרופות טיפוליות חדשות בצורה קלינית רלוונטית.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

גלה סרטונים נוספים