Name: צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: למדו צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר. שיטה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית מדויקת של מבני הלב ושמירה על מורפולוגיית הרקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המלגות של סין (CSC, ל R. Xia), המרכז הגרמני למחקר לב וכלי דם (DZHK; 81X2600255 ל S. Clauss, 81Z0600206 ל S. Kääb), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל S. Clauss), SFB 914 (פרויקט Z01 ל H. Ishikawa-Ankerhold ו S. Massberg ופרויקט A10 ל C. Schulz), ERA-NET על מחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל S. Clauss) ואת קרן Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl (ל S. Clauss). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת מינכן, וכל ההליכים שבוצעו בעכברים אושרו על ידי ממשלת בוואריה, מינכן, גרמניה (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). עכברי C57BL6/J נרכשו ממעבדת ג'קסון.
הערה: איור 1 מראה את המכשירים הדרושים לניסוי. איור 2 מראה המחשה של אנטומיה של הלב הגס. איור 3 מראה את המיקום של SAN ו-AVN בלב עכבר בוגר. איור 4 מראה את הדגימה המוכנה שהוטענה במיקרוסקופ קונפוקלי.
1. הכנות
<ol><li>הכינו תמיסת פורמלדהיד 4% (4% PFA) על ידי דילול 10 מ"ל של תמיסת פורמלדהיד 16% ב-30 מ"ל PBS.</li>
	<li>הכינו תמיסת 15% סוכרוז ותמיסת 30% סוכרוז על ידי המסת 15 גרם ו-30 גרם אבקת סוכרוז ל-PBS של 100 מ"ל, בהתאמה. לאחר המסת אבקת הסוכרוז במלואה, יש לסנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים 0.2 מיקרומטר לפני האחסון בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>הכינו ג'ל אגרוז 3%-4%, הוסיפו 3 גרם או 4 גרם אבקת אגרוז ו-100 מ"ל של 1x TAE (מדולל מתמיסת מלאי TAE פי 50) לכוסית. מניחים את הכד על מערבל מגנטי ומרתיחים אותו עד שהאגרוז מומס לחלוטין.</li>
	<li>מכינים את צלחת הדיסקציה על ידי מזיגה עדינה של 30 מ"ל ג'ל אגרוז (3%-4%) בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. השאירו את צלחת הפטרי על הספסל בטמפרטורת החדר כדי להתקרר ולהתקשות.</li>
	<li>הכינו תמיסת חסימה ותמיסת כביסה בהתאם למתכונים המופיעים בטבלה 1. הכינו את כל הפתרונות שהוכנו ביום השימוש. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ.</li>
	<li>הכינו את תמיסות הנוגדנים על ידי דילול שלהן בקור (4°C) 1x PBS, הגנו על הדילול מפני אור (למשל, על ידי עטיפת רדיד אלומיניום מסביב) ושמרו דילול על קרח עד לשימוש. לדלל את הנוגדנים זמן קצר לפני הדגירה. הימנעו מהשארת הנוגדנים המדוללים בטמפרטורת החדר. הערה: יש לבדוק את דילול הנוגדנים המתאים עם דגימות רקמה דומות על ידי ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית קונבנציונלית. כאן בדקנו את הנוגדנים על ידי צביעת חלקים קפואים שנחתכו בעובי של 10 מיקרומטר.</li>
</ol>2. קצירת איברים והכנת רקמות
<ol><li>מרדימים את העכבר על ידי הכנסתו לתא דגירה המחובר למאדה איזופלורן. הגדר את הוופורייזר לספק 4-5% isoflurane (96-95% חמצן, בהתאמה). הערה: הרדמה מלאה מאושרת על ידי אובדן התגובה היציבתית ורפלקס התיקון על ידי גלגול עדין של החדר עד שהעכבר מונח על גבו.</li>
	<li>שים את העכבר במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. הכניסו את אף העכבר למסכת הרדמה המחוברת למעגל Bain שונה עם הצינור הפנימי שלו מחובר לוופורייזר איזופלורן. כדי לשמור על הרדמה, יש להשתמש באיזופלורן 1-2% בחמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה. יש לסלק אדי הרדמה עודפים מהעכבר דרך הצינור החיצוני של המסכה ולשאוב דרך מיכל של פחם פעיל, אשר סופג את גז ההרדמה העודף.</li>
	<li>כאשר מושגת הרדמה מלאה, יש להזריק פנטניל לשיכוך כאבים (0.1 μגרם / 25 גרם משקל גוף i.p).</li>
	<li>כאשר רפלקס צביטת הבוהן אינו ניתן לגילוי, בצע חתך ברור מהג'וגולום לסימפיזיס באמצעות מספריים של הקשתית כדי להסיר פרווה ועור. בצע חתך נוסף משמאל לימין מתחת לצלעות באמצעות מספריים הקשתית כדי לפתוח בזהירות את הבטן.</li>
	<li>לחיות את הקסיפואיד קצת באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לאפשר לחתוך את הסרעפת משמאל לימין מבלי לפגוע באיברים. חתכו את כלוב הצלעות בקו מדיאלי בבית השחי משני הצדדים באמצעות מספריים של הקשתית כדי להפוך אותו באופן גולגולתי ולאפשר גישה ללב.</li>
	<li>חותכים את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים החזי היורד בגובה הסרעפת באמצעות מספריים קשתית. נקב את הלב עם מחט 27 G באזור הקודקוד ולאחר מכן בזהירות לדחוף את המחט לתוך החדר השמאלי (LV). הזריקו בעדינות 5-10 מ"ל של PBS קר כקרח לתוך LV כדי לחורר את הלב. הערה: צבע הלב צריך להפוך מאדום לאפור המציין זילוח מוצלח עם PBS.</li>
	<li>בזהירות להרים את הקודקוד של הלב באמצעות פינצטה המאפשר לחתוך את כלי הדם הגדולים כדי להסיר את הלב.</li>
	<li>הבלו את הלב על ידי חיתוך העורקים והוורידים הגדולים רחוק ככל האפשר מהלב כדי למנוע נזק לווריד הנבוב העליון (SVC). שמור על SVC מכיוון שהוא ישמש ציון דרך חשוב במהלך עיבוד מאוחר יותר.</li>
	<li>לאחר הסרת הלב, כבו את מכשיר האידוי איזופלורן.</li>
	<li>הכניסו את הלב לצלחת דיסקציה מלאה ב-PBS קר כקרח מתחת למיקרוסקופ המנתחת. לאחר קביעת שמאל/ימין וחזית/גב הלב, סובבו את הלב כשקדמת הלב בתחתית הצלחת (כדי לחשוף את כלי הדם הגדולים הממוקמים מאחור).</li>
	<li>לשתק את הלב על-ידי הכנסת סיכה קטנה דרך הקודקוד ותוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) לתוך האגרוז בתחתית צלחת הדיסקציה (איור 2A). בעזרת פינצטה עדינה ומספריים, הסירו בזהירות רקמות שאינן לבביות סביב ה-SVC והווריד הנבוב התחתון (IVC) (למשל, ריאות, שומן, קרום הלב) כדי לחשוף את האזור הבין-קוואלי (איור 3A).</li>
	<li>הסר את רוב החדרים על ידי חיתוך מקביל את החריץ בין החדרים ואת אטריה עם מספריים מיקרו. שמרו חלק קטן מרקמת החדר לצורך העמסה מאוחרת יותר על טבעת הפרספקס.</li>
	<li>עבור קיבוע והתייבשות, לשים את הדגימה (המכילה את אטריה, SVC ו IVC) ב 4% PFA לילה ב 4 ° C.</li>
	<li>למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 15% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 30% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: עבור הקיבוע וההתייבשות בשלב 2.13, 2.14 ו-2.15, הדגימות נותרות בטמפרטורה של 4°C ללא ערבוב נוסף או נדנוד.</li>
</ol>3. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם
<ol><li>יש לשטוף את הלב ב-1% Triton X-100 מדולל ב-PBS ולחסום ולחדור בתמיסת חסימה (טבלה 1) למשך הלילה ב-4°C.</li>
	<li>מניחים את הלב בצינור של 1.5 מ"ל ודגורים עם ארנב נגד עכבר connexin-43 (דילול של 1:200) ונוגדנים נגד עכבר HCN4 (דילול של 1:200) מדוללים בתמיסת חסימה במשך 7 ימים ב 4 ° C. הערה: יש לבדוק את הריכוז האופטימלי של נוגדנים ראשוניים לפני השימוש בגיליונות הנתונים כהתמצאות. גם אנטיגנים אחרים בעלי עניין עלולים להיות מוכתמים בשלב זה, כל עוד המין המארח של האנטיגן הראשוני שונה מהאחרים. ריכוז גבוה יותר של Triton X-100 עשוי לסייע בהשגת צביעת נוגדנים יעילה יותר כפי שהודגם לפני10, אך הריכוז עשוי להיקבע בנפרד.</li>
	<li>לאחר 7 ימים, להסיר את התמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים באמצעות פיפטה ולשטוף את הלב עם 1% Triton X-100 פתרון 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית).</li>
	<li>לאחר השטיפה, לדגור על הלב = עם Alexa Fluor 488 עז נגד חולדה IgG (דילול של 1:200) ו Alexa Fluor 647 עז נגד ארנב IgG (דילול של 1:200) במשך 7 ימים ב 4 ° C.</li>
	<li>לאחר 7 ימים, להסיר את כל הפתרון המכיל נוגדנים משניים באמצעות פיפטה. לאחר מכן שטפו את הלב באמצעות תמיסת שטיפה (טבלה 1) 3 פעמים (כל פעם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על השייקר המסלולי).</li>
	<li>כדי להכתים גרעינים, יש לדגור על הלב בתמיסת DAPI (10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>למחרת, לשטוף את הלב עם פתרון כביסה 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי). הערה: עבור חסימה, חלחול, דגירה נוגדנים וצביעת DAPI בשלב 3.1, 3.2, 3.4 ו -3.6, להשאיר את הדגימות במצב יציב ב 4 ° C, אין צורך ערבוב. הרקמה המוכתמת יכולה להישמר מכוסה במלואה בתמיסת כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור למשך מספר ימים עד להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי.</li>
</ol>4. מיקרוסקופ קונפוקלי
<ol><li>הכינו טבעות פרספקס ומלאו בפלסטלינה (איור 1). במרכז הפלסטלינה נוצר חריץ קטן במרכז לטעינת הלב. צרו חריץ רדוד, מכיוון שיהיה קל יותר לרכוש מישור הדמיה שטוח, ולהתאים את החלל ולהימנע מבועות אוויר בין הדגימה לכיסויים בשלב 4.4.</li>
	<li>השתמש באותה דגימת לב להדמיה של SAN ו- AVN ברצף. עבור הדמיית SAN, טען ישירות את הלב ואילו עבור הדמיית AVN, בצע מיקרודיסקציה לפני.<ol><li>הדמיית SAN<ol><li>זהה את SAN לפי ציוני דרך אנטומיים: הוא ממוקם בצד הגבי של הלב בתוך האזור הבין-קוואלי (האזור שבין הווריד הנבוב העליון והנחות). קריסטה טרמינליס (באנגלית: crista terminalis, CT) הוא פס השרירים שבין ה-SAN ל-RAA.</li>
			<li>הכניסו את הלב לחריץ הפלסטלינה כשגב הלב פונה כלפי מעלה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).</li>
			<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, לחץ בעדינות את RAA, LAA ואת החלקים הנותרים של החדר השמאלי לתוך הפלסטלינה כדי לתקן את הלב. ודא כי כל האזור inter-caval ואת מסוף crista ניתן לראות בבירור (לא מכוסה על ידי פלסטלינה). האזור שיצולם מוצג באיור 3A.</li>
		</ol></li>
		<li>הדמיית AVN<ol><li>לאחר סיום ההדמיה של SAN, אסוף מחדש את אותה דגימה ולאחר מכן השתמש בה עבור הדמיית AVN. עבור מיקרודיסקציה AVN, הניחו את הלב = על צלחת דיסקציה מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.</li>
			<li>כיוון הלב כאשר צד ימין פונה כלפי מעלה (כולל החלקים הנותרים של החדר הימני). שימו פינים דרך החלק הנותר של הדופן החופשית של LV (שנמצא עכשיו בתחתית) כדי לשתק את הרקמה (איור 2B).</li>
			<li>חתכו את הדופן הפנויה הנותרת של RV כלפי מעלה דרך המסתם הטריקוספיד והווריד הנבוב העליון. לאחר מכן הפוך את RV ו- RA כדי לחשוף מחיצות בין-חדריות ובין פרוזדוריות. (איור 3B) הערה: שימו לב לא לפגוע בסינוס הכלילי (CS), שכן זהו ציון דרך אנטומי חשוב למצוא את המשולש של קוך אשר לאחר מכן מאפשר למקם את AVN. ה-CS עובר באופן רוחבי בחריץ האטריובנטריקולרי השמאלי בצד האחורי של הלב, ופתח ה-CS ממוקם בין IVC לבין המסתם הטריקוספיד בחלק התחתון של המחיצה הבין-פרוזדורית (איור 3A ו-B).</li>
			<li>זהה את המשולש של קוך שניתן למצוא על פני השטח האנדוקרדליים של האטריום הימני, הגובל קדמית בקו הציר של עלון המחיצה של המסתם הטריקוספיד (TV), ואחורית על ידי גיד טודרו. הבסיס נוצר על-ידי פתח הסינוס הכלילי (איור 3B). מכיוון שזהו אזור היעד להדמיית AVN, הוא צריך להיות גלוי בבירור.</li>
			<li>מעבירים את הלב לחריץ הפלסטלינה בתוך טבעת הפרספקס כאשר משולש קוך חשוף בבירור (כלומר לא מכוסה בפלסטלינה). לחץ בעדינות על הרקמה סביב משולש קוך לתוך הפלסטלינה כדי לקבע את הדגימה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>יש למרוח סיליקון על שולי טבעות הפרספקס כדי לאפשר כיסוי הלבבות הטעונים בתוך טבעות הפרספקס מלאות הפלסטלינה באמצעות החלקות כיסוי.</li>
	<li>לחץ בעדינות על הצד האחורי של הפלסטלינה כדי לסחוט חלקים של PBS ולחבר את הלב לכיסוי תוך הימנעות מבועות אוויר באזור ההדמיה. הערה: ודא שאזורי העניין אינם מקופלים ומכוסים במהלך לחיצה על הצד האחורי של הפלסטלינה. מישור הדמיה שטוח ללא דחיסת יתר של הדגימה נחוץ לשימור האנטומיה ולהדמיה קונפוקלית נכונה של הדגימות. עבור SAN, חשוב לוודא שהאזור הבין-קוואלי חשוף בבירור. עבור AVN, המשולש של קוך צריך להיות חשוף במלואו.</li>
	<li>הניחו את דגימות הצביעה בהרכבה שלמה הפוכה על פלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי. ה-SAN/AVN החשוף המחובר לחלקת הכיסוי נמצא כעת בתחתית פלטפורמת המיקרוסקופ (איור 4). הערה: כדי לצלם תמונות, אנו משתמשים ב- Carl Zeiss LSM800 עם Airyscan Unit ובתוכנה ZEN 2.3 SP1 שחור.</li>
	<li>בחר צלחת "BP420-480 + LP605" עבור עירור של Alexa Fluor 647 מצומד אנטי HCN4. לשנות את רווח המאסטר מ 650-750.</li>
	<li>צלם תמונת סקירה כללית של אזור SAN ו- AVN כולו באמצעות הפונקציה סריקת אריחים . לאחר מכן בחר את האזור החיובי HCN4 על ידי לחיצה והוספת ריבוע על תמונת הסקירה סביב אזור העניין שייסרק.</li>
	<li>בדוק את הפרמטרים, כולל לוחות ורווח מאסטר עבור שאר הערוצים (Alexa Fluor 488 ו- DAPI) של המיקרוסקופ הקונפוקלי והגדר כמתואר בשלב 4.6.</li>
	<li>כוונן באיטיות את המוקד מלמעלה למטה של הדגימה כדי להציג תצוגה מקדימה של הדגימה כולה ולהגדיר את הראשון והאחרון עבור טווח מחסנית Z. הגדר מרווח זמן אופטימלי עבור מחסנית Z בהתבסס על עובי הדגימה האופטית. אנו משתמשים במטרה של 20x, ו- 0.8-1 מיקרומטר כמרווח עבור Z-stack.</li>
	<li>לאחר שכל הפרמטרים מוגדרים כראוי, סרוק את כל האזור של SAN ו- AVN.</li>
	<li>בצע שחזור תלת ממדי של התמונות באמצעות תוכנה (למשל, Imaris גרסה 8.4.2).<ol><li>בחר עיבוד תמונות | חיסור קווי בסיס להסרת צביעת רקע.</li>
		<li>בחרו 'יצירת משטח ב'קביעה' לערוץ ולאזור העניין שנבחרו לעיבוד.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+arrhythmia%3A+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li>
<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).</li>
<li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li>
<li>Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradyarrhythmias+and+Conduction+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espa%C3%B1ola+de+Cardiolog%C3%ADa+%28English+Edition%22%5BJournal%5D)">Bradyarrhythmias and Conduction Blocks.</a> Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).</li>
<li>Wen, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+mouse+sinoatrial+node+and+its+expression+of+NF-160+and+HCN4%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).</li>
<li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).</li>
<li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node%3A+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry%3A+a+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node%3A+structure+and+expression+of+HCN+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).</li>
<li>Muller-Taubenberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+protein+tags+as+reporters+in+live-cell+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies.</a> Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).</li>
<li>Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%BCller-Taubenberger%2C+A+%22Dictyostelium+discoideum+Protocol%22">Dictyostelium discoideum Protocol</a>. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).</li>
<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+PJ+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).</li>
<li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Airyscan+detector+from+ZEISS%3A+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li>
<li>Rysevaite, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterization+of+the+intrinsic+cardiac+neural+plexus+in+whole-mount+mouse+heart+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations.</a> Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li>
<li>Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+distribution+of+voltage-gated+ion+channels+in+ferret+sinoatrial+node%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node.</a> Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).</li>
<li>Mesirca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia+induced+by+genetic+silencing+of+%27funny%27+%28f%29+channels+is+rescued+by+GIRK4+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation.</a> Nature Communication. 5, 4664(2014).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li>
<li>Verheule, S., Kaese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+diversity+in+the+heart%3A+insights+from+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).</li>
<li>van der Velden, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+gap+junctions+and+connexins%3A+their+role+in+atrial+fibrillation+and+potential+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets.</a> Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

אנטומיה של הלב נחקרה באופן מסורתי באמצעות חתכים היסטולוגיים דקים11. עם זאת, שיטות אלה אינן משמרות את המבנה התלת מימדי של מערכת ההולכה ולכן מספקות מידע דו-ממדי בלבד. פרוטוקול צביעת האימונופלואורסנציה המתואר כאן מאפשר להתגבר על מגבלות אלה וניתן להשתמש בו באופן שגרתי להדמיית SAN ו-AVN.
בהשוואה לשיטות סטנדרטיות כגון אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית הדורשות הטבעה של פרפין, חתך ושליפת אנטיגן, מתודולוגיית ההרכבה המלאה מועילה לטיפול בלוקליזציה התלת-ממדית המדויקת ובמורפולוגיה של SA...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

הפרעות קצב הן מחלות שכיחות הפוגעות במיליוני אנשים, והן גורמות לתחלואה ותמותה משמעותיות ברחבי העולם. למרות התקדמות עצומה בטיפול ובמניעה, כגון פיתוח קוצבי לב, הטיפול בהפרעות קצב נותר מאתגר, בעיקר בשל הידע המוגבל מאוד לגבי מנגנוני המחלה הבסיסיים 1,2,3. הבנה טובה יותר הן של האלקטרופיזיולוגיה הרגילה והן של הפתופיזיולוגיה של הפרעות קצב עשויה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשניות, חדשניות וסיבתיות בעתיד. בנוסף, כדי לחקור באופן מקיף הפרעות קצב, חשוב למקם ולדמיין את מערכת הולכת הלב הספציפית במודלים של בעלי חיים כגון עכבר, שכן עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר אלקטרופיזיולוגי.
החלקים העיקריים של מערכת ההולכה הלבבית הם הצומת הסינואפרוזדורי (SAN), שבו נוצר הדחף החשמלי בתאי קוצב מיוחדים, והצומת האטריובנטריקולרי (AVN), שהוא החיבור החשמלי היחיד בין האטריה לחדרים4. בכל פעם שהתכונות האלקטרופיזיולוגיות של SAN ו- AVN משתנות, הפרעות קצב כגון תסמונת סינוס חולה או בלוק אטריובנטריקולרי יכולות להתרחש אשר עלולות להוביל להידרדרות המודינמית, סינקופה ואפילו מוות, ובכך להדגיש את התפקיד החיוני של SAN ו- AVN הן באלקטרופיזיולוגיה והן בהפרעות קצב5.
מחקרים מקיפים על SAN או AVN דורשים לוקליזציה מדויקת והדמיה של שני המבנים, באופן אידיאלי בסביבה הפיזיולוגית שלהם. עם זאת, בשל גודלם הקטן ומיקומם בתוך שריר הלב העובד, מבלי לקבוע מבנה ברור הנראה לעין מבחינה מקרוסקופית, חקר האנטומיה והאלקטרופיזיולוגיה של SAN ו- AVN הוא מאתגר. ניתן להשתמש בציוני דרך אנטומיים כדי לזהות בערך את האזור המכיל SAN ו- AVN 6,7,8. בקצרה, SAN ממוקם באזור הבין-קוואלי של האטריום הימני הסמוך למסוף הקריסטה השרירי (CT), AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך שהוקם על ידי המסתם הטריקוספיד, האוסטיום של הסינוס הכלילי והגיד של טודרו. עד כה, ציוני דרך אנטומיים אלה שימשו בעיקר כדי למקם, להסיר ולאחר מכן לחקור SAN ו- AVN כמבנים בודדים (למשל, על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית). עם זאת, כדי להבין טוב יותר את האלקטרופיזיולוגיה המורכבת של SAN ו-AVN (למשל, השפעות רגולטוריות של תאים סמוכים של שריר הלב העובד), יש צורך לחקור את מערכות ההולכה בסביבה הפיזיולוגית התלת-ממדית.
צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה היא שיטה המשמשת לחקר מבנים אנטומיים באתרם תוך שמירה על שלמות הרקמה שמסביב9. באמצעות שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ובתוכנה לניתוח תמונה, ניתן להמחיש SAN ו-AVN באמצעות נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי המכוונים לתעלות יונים המבוטאות באופן ספציפי באזורים אלה.
פרוטוקול זה להלן מסביר את השלבים הדרושים לביצוע שיטת צביעה מבוססת היטב להרכבה מלאה עבור לוקליזציה והדמיה של מיקרוסקופ SAN ו- AVN. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) למקם SAN ו- AVN לפי ציוני דרך אנטומיים כדי להכין דגימות אלה לצביעה ולניתוח מיקרוסקופיה (2) לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה של סמני הייחוס HCN4 ו- Cx43 (3) להכין דגימות SAN ו- AVN למיקרוסקופ קונפוקלי (4) לביצוע הדמיה קונפוקלית של SAN ו- AVN. אנו גם מתארים כיצד ניתן לשנות פרוטוקול זה כך שיכלול צביעה נוספת של שריר הלב העובד שמסביב או תאים שאינם מיוציטים כגון סיבי עצב אוטונומיים המאפשרים חקירה יסודית של מערכת הולכת הלב בתוך הלב.

<table><tbody><מערכת אידוי <tr><td>חזקה>הרדמה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן&nbsp;</td><td>הוגו זקס אלקטרוניק</td><td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td><td>כולל תא אינדוקציה, יחידת פינוי גז ומסנני פחם</td></tr><tr><td>מעגל ביין שונה</td><td>הוגו סאקס אלקטרוניק</td><td>73-4860</td><td>כולל מסכת הרדמה לעכברים</td></tr><tr><td>פלטפורמה כירורגית</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>SURGI-M</td><td></td></tr><tr><td>In vivo מכשור</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>מספריים אביביים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לרקמות</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>סיכות רקמות</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26007-01</td><td>יכול להשתמש במחטי 27G כתחליף</td></tr><tr><td><מכשירי מעבדה חזקים>כלליים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>Sunlab</td><td>D-8040</td><td></td></tr><tr><td>בוחש מגנטי</td><td>IKA&nbsp;</td><td>פיפטה בסיסית</td><td></td>RH</tr><tr><td>, נפח 10 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה סטריאו-זום מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10836-004</td><td></td></tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.2</td><td>מכשירי</td><td></td><td></td>אוקספורד</tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 שחור</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כללי חומר מעבדה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 ומיקרו; m מסנן מזרק</td><td>Sartorius</td><td>17597</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת פטרי</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>27 גרם מחט</td><td>BD מיקרולנס 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן</td><td>פלקון</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>בראון</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מחליק</td><td>תרמו מדעי</td><td>7632160</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td></td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td><חזקים>כימיקלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ' EDTA</td><td>Sigma</td><td>20-158</td><td>רכיבים של תמיסת פורמלדהיד TEA</td></tr><tr><td>16%</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>28908</td><td>השתמש כפתרון של 4%&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>רכיבים של TEA</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>850070</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1X) פוספט מבודד של Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Sigma</td><td>NS02L</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S1888-1kg</td><td></td></tr><tr><td>רכיבי Tris-base</td><td>Roche</td><td>TRIS-RO</td><td>של TEA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ml</td><td>מדולל ל-1% ב-PBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ml</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תרופות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פנטניל 0.5&nbsp; מ"ג/10&nbsp; mL</td><td>Braun Melsungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1 מ"ל/מ"ל</td><td>Cp-pharma</td><td>31303</td><td></td></tr><tr><td>חמצן 5 ליטר</td><td>לינדה</td><td>2020175</td><td>כולל ווסת לחץ</td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG Alexa Fluor&nbsp; 488&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> <td>#4412</td><td>מדולל ל-1:200</td></tr><tr><td>עיזים נגד חולדות IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>#A-21247</td><td>מדולל ל-1:200</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידראט (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>מדולל ל-1:1000</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-קונקסין-43</td><td>סיגמה</td><td>C6219</td><td>מדולל ל-1:200</td></tr><tr><td>חולדה אנטי-HCN4 (SHG 1E5)</td><td>Invitrogen</td><td>MA3-903</td><td>מדולל ל<1:200</td></tr> <tr><td>חזק>אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טבעת</td><td></td><td></td> פרספקס <td>בעיצוב עצמי ומודפס בתלת מימד</td></tr><tr><td>פלסטלינה</td><td>Cernit</td><td>49655005</td><td></td></tr><tr><td>Silikonpasten, Baysilone</td><td>VWR</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td><חזק>בעלי חיים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר, C57BL/6</td> מעבדת <td></td><td></td><td>ג'קסון</td></tr></tbody></table>

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

האות החשמלי שנוצר פיזיולוגית על ידי תאי קוצב לב בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מתבצע דרך מערכת ההולכה, הכוללת את הצומת האטריובנטריקולרי (AVN), כדי לאפשר עירור והתכווצות של הלב כולו. כל תפקוד לקוי של SAN או AVN גורם להפרעות קצב, דבר המצביע על תפקידן הבסיסי באלקטרופיזיולוגיה והפרעות קצב. מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר הפרעות קצב, אך החקירה הספציפית של SAN ו- AVN נותרה מאתגרת.
ה- SAN ממוקם בצומת של מסוף הקריסטה עם הווריד הנבוב העליון ו- AVN ממוקם בקודקוד המשולש של קוך, שנוצר על ידי פתח הסינוס הכלילי, הטבעת הטריקוספידית והגיד של טודרו. עם זאת, בשל הגודל הקטן, הדמיה על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית נותרה מאתגרת והיא אינה מאפשרת את המחקר של SAN ו- AVN בסביבת התלת-ממד שלהם.
כאן אנו מתארים גישה אימונופלואורסצנטית של הר שלם המאפשרת הדמיה מקומית של SAN ו- AVN של עכבר מתויג. צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה מיועדת למקטעים קטנים יותר של רקמה ללא צורך בחתך ידני. לשם כך, לב העכבר מנותח, עם רקמות לא רצויות הוסרו, ואחריו קיבוע, חדירה וחסימה. תאים של מערכת ההולכה בתוך SAN ו-AVN מוכתמים בנוגדן אנטי-HCN4. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ועיבוד תמונה מאפשרים התמיינות בין תאי קשרית לבין קרדיומיוציטים עובדים, ולמקם בבירור SAN ו- AVN. יתר על כן, ניתן לשלב נוגדנים נוספים כדי לסמן גם סוגי תאים אחרים, כגון סיבי עצב.
בהשוואה לאימונוהיסטולוגיה קונבנציונלית, צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה שומרת על השלמות האנטומית של מערכת הולכת הלב, ובכך מאפשרת חקירה של AVN; במיוחד כך לתוך האנטומיה שלהם ואת האינטראקציות עם שריר הלב עובד שמסביב תאים שאינם מיוציטים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, ניתן לבצע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית הן של SAN והן של AVN. צביעה ספציפית של מערכת ההולכה באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-HCN4 וצביעה של שריר הלב העובד באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-Cx43 מאפשרת זיהוי ברור של SAN (איור 5, וידאו 1) ו-AVN (איור 6, וידאו 2) בתוך האנטומיה השלמה.
<img alt="Fi...

אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לצביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של הצומת הסינואפרוזדורי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) בלבבות מורין.

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

פרוטוקול זה מסביר את השלבים הדרושים לביצוע מיקרו-דיסקציה, צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה ומיקרוסקופיה במיוחד עבור צומת הסינוס וצומת ה-AV בעכבר. המתודולוגיה השלמה מועילה להתייחסות ללוקליזציה ולמורפולוגיה התלת-ממדית המדויקת של הסינוס וצומת ה-AV ולבחינת הקשר עם הרקמה שמסביב. מורפולוגיה של הרקמות נשמרת במידה ניכרת עם התייבשות מינימלית של רקמות וקרע פיזי בלבד.כדי להתחיל, נקבו את הלב עם מחט בקוטר 27 באזור הקודקוד על ידי דחיפה זהירה של המחט לחדר השמאלי והזרקה עדינה של חמישה עד 10 מיליליטר PBS קר כקרח כדי להגדיל את הלב. מרימים בזהירות את הלב בעזרת פינצטה וחותכים את כלי הדם הגדולים כדי להסיר את הלב. הכניסו את הלב לצלחת חיתוך מלאה ב-PBS קר כקרח מתחת למיקרוסקופ הניתוח.לאחר קביעת כיוון הלב, סובב את הלב כך שקדמת הלב תהיה בתחתית המנה. שתק את הלב על ידי הכנסת סיכות קטנות דרך הקודקוד והנספח הפרוזדורי לתוך האגרוז בתחתית צלחת הדיסקציה. בעזרת פינצטה עדינה ומספריים הסר בזהירות רקמה שאינה לבבית סביב הווריד הנבוב העליון והתחתון.כדי לחשוף את האזור הבין-קאבלי, הסר את רוב החדרים על ידי חיתוך במקביל לחריץ שבין החדרים לפרוזדורים בעזרת מספריים מיקרו. לקיבוע והתייבשות הכניסו את הדגימה ל-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הלב לתמיסת סוכרוז של 15% ודגרו אותו למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה העבירו את הלב לתמיסת סוכרוז 30% למשך 24 שעות נוספות בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את הלב ב-1% Triton X-100 מדולל ב-PBS. לאחר מכן חסום וחלחל אותו בתמיסת חסימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.הניחו את הלב בצינור של 1.5 מיליליטר ודגרו עליו עם נוגדנים נגד עכברים של ארנב Connexin 43 ונוגדנים נגד עכברים HTN4 של חולדות מדוללים בתמיסה חוסמת במשך שבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שבעה ימים, הסר את התמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים באמצעות פיפטה. שטפו את הלב עם תמיסת 1% Triton X-100 שלוש פעמים למשך שעה אחת בכל שטיפה בשייקר המסלול.חזור על שלבי הכביסה לאחר הדגירה עם נוגדנים משניים ו-DAPI. לאחר הכנת טבעות פלסטיק ומילוין בפלסטלינה, הכניסו את הלב לחריץ הפלסטלינה כשגב הלב פונה כלפי מעלה. זהה את ה-SAN, הממוקם בצד הגבי של הלב עם האזור הבין-קבלי.הוסף PBS ללב כדי להוציא את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו ב-PBS. מרחו סיליקון על שולי טבעת הפלסטיק. לחץ בעדינות על החלק שמסביב של הדגימה לתוך הפלסטלינה כדי לתקן את הלב ולכסות את הלב בתלוש כיסוי.לאחר מכן לחץ בעדינות על הצד האחורי של הפלסטלינה כדי לסחוט חלק מה-PBS ולחבר את הלב להחלקת הכיסוי תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר באזור ההדמיה. מקם את דגימות הצביעה הפוכות על פלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי והמשך בהדמיה כמתואר בכתב היד הטקסט. הפרמטרים עבור כל ערוץ של המיקרוסקופ הקונפוקלי נקבעים באמצעות התוכנה המתאימה.פרוטוקול זה שימש לביצוע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית הן של הצומת הסינו-פרוזדורי והן של הצומת האטריו-חדרי בלבבות עכברים. צביעה ספציפית של מערכת ההולכה ושריר הלב העובד עם נוגדנים פלואורסצנטיים, המכוונים ל-HCN4 ו-Connexin 43 בהתאמה מאפשרים לזהות את הצומת הסינו-פרוזדורי ואת הצומת האטריו-חדרי בתוך האנטומיה השלמה. פרוטוקול צביעה שלם זה מאפשר לחקור את האינטראקציה בין סוגי תאים שונים באמצעות נוגדנים שונים.

whole-mount-immunofluorescence-staining-confocal-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון וידאו זה מדגים את ההליך לבידוד צומת סינופרוזדורי או SAN מלב העכבר. ה-SAN מאכלס את התאים הסינואפרוזדוריים שיוזמים את פעימות הלב על ידי יצירת פוטנציאלי פעולה ספונטניים.

בידוד צומת סינופרוזדורי ממודל עכבר: הליך לקצירת צומת SA מלב מורין

באמצעות סריקות MRI (אנושיות), תוכנת הדמיה תלת-ממדית וניתוח אימונוהיסטולוגי, אנו מתעדים שינויים בחדרים הצדדיים של המוח. מיפוי תלת מימד אורכי של שינויים בנפח החדר הצדדי ואפיון של שינויים תאיים סביב החדר המתרחשים במוח האנושי עקב הזדקנות או מחלה מודלים לאחר מכן בעכברים.

3D דוגמנות של רוחב החדרים והיסטולוגית אפיון רקמות סביב חדרי מוח בבני אדם ועכבר

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיפוי אופטי של פעילות חשמלית מן אטריום ימין בעכבר במיוחד צומת סין-פרוזדורים, ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן.

מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

פרוטוקול זה נועד לתאר מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי באמצעות הקלטת מערך microelectrode של כל רקמת הצומת sinoatrial כדי לזהות פגמים בקצב בעכברים. סוכנים פרמקולוגיים יכולים גם להיות הציג בשיטה זו כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על קצב מהותי.

הקלטה של מערך Microelectrode של קצב הירי של צמת Sinoatrial כדי לזהות פגמים מהותיים בקצב הלב בעכברים

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

פרוטוקול זה מדגים בידוד מונחה מיקרוסקופיה וצביעה אימונופלואורסצנטית של ורידים ריאתיים מורינים. אנו מכינים דגימות רקמה המכילות את אטריום שמאל, ורידים ריאתיים, ואת הריאות המתאימות ומכתימים אותם עבור טרופונין T לב ו Connexin 43.

מיקרודיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של שרוולי שריר הלב בוורידי ריאה מורין

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

למדו צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר. שיטה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית מדויקת של מבני הלב ושמירה על מורפולוגיית הרקמה.

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

גלה סרטונים נוספים