הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ
23 בדצמבר 2020
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המשלבת פלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (RNA-FISH) עם כשל חיסוני כדי לדמיין תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) RNA. פרוטוקול זה עשוי להגביר את ההבנה של המאפיינים המולקולריים של אינטראקציות מארח SARS-CoV-2 RNA ברמת תא יחיד.
פרוטוקול זה איפשר לדמיין RNA של SARS-CoV-2 בשורות תאים ובתרביות אפיתל תלת תלת מימדיות של דרכי הנשימה האנושיות, ומספק כלי להבנה טובה יותר של פתוגנזה ושכפול ויראלי ברמת התא הבודד. בשל הספציפיות, הרגישות והרזולוציה הגבוהה שלה, שיטה זו שימושית לא רק למחקרים מדעיים בסיסיים של SARS-COVID-2 אלא גם לפרויקטים יישומיים, כגון אבחון. מי שתדגים את ההליך תהיה אגניישקה סודר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.
לאחר קיבוע וחדירה של התאים כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, הסר את תמיסת ה-PBS 1X מהבארות, והוסף לפחות 300 מיקרוליטר של מאגר הגברה לכל באר. דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הכן כל סיכת ראש HCR על ידי קירור מהיר של הנפח הרצוי בצינורות נפרדים.
להכנת 300 מיקרוליטר של תמיסת הגברה, השתמש ב -18 פיקומולים מכל סיכת ראש. העבירו את תמיסת סיכת הראש לשפופרות, ודגרו אותן בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר מכן מצננים לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
הכינו תערובת סיכות ראש על ידי הוספת סיכות השיער H1 ו-H2 שהתקררו במהירות למאגר ההגברה. יש להניח טיפות של 30 עד 50 מיקרוליטר של תערובת סיכות ראש על Parafilm. הניחו את הכיסויים עם התאים על טיפות תערובת סיכת השיער, ודגרו את הדגימות למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר.
כדי להרכיב את השקופיות, הנח שתי טיפות של 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על מגלשה, וודא שהטיפות מופרדות מספיק כדי לאפשר להניח שתי החלקות כיסוי על שקופית אחת. הסר עודפי נוזלים על ידי הקשה על הכיסויים על מגבת נקייה. לאחר מכן הנח אותם במדיום הרכבה נגד דהייה כשהתאים פונים כלפי מטה.
הניחו את הדגימות המותקנות על משטח יבש ושטוח בחושך, ותנו להן להתרפא. לאחר קיבוע וחדירה של תאי האנגיואדמה התורשתית כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, הגבירו מראש את הדגימות על ידי דגירה עם מאגר הגברה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש ב -30 פיקומולים מכל סיכת ראש להכנת 500 מיקרוליטר של תמיסת הגברה.
העבירו את תמיסת סיכת הראש לצינורות, ודגרו אותם בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר מכן מצננים אותם לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. הכן את תמיסת סיכת הראש על ידי הוספת כל סיכות השיער המקוררות בהצמדה ל-500 מיקרוליטר של מאגר הגברה בטמפרטורת החדר.
הסר את תמיסת ההגברה המוקדמת, והוסף את תמיסת סיכת הראש המלאה. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך. הנח את הממברנה החתוכה מתוספות Transwell על 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה כשהתאים פונים כלפי מעלה, והוסף אמצעי הרכבה נוסף לממברנה.
ואז מכסים את הממברנות בכיסויים. פרוטוקול אימונו-RNA-FISH זה בוצע בשתי מערכות תאיות, קו תאי Vero ותרבית אפיתל תלת תלת מימדית של דרכי הנשימה האנושיות. לוקליזציה של RNA תת-גנומי של SARS-coronavirus-2 בתאי Vero נגועים ומחוסנים מוצגת כאן.
ניתן לראות RNA ויראלי באדום. לוקליזציה של RNA תת-גנומי של SARS-coronavirus-2 בתאי אפיתל של דרכי הנשימה האנושיות הנגועות והמחוסנות מוצגת כאן. פרוטוקול החדירות עבר אופטימיזציה בתאי Vero.
חדירה עם חומר ניקוי מביאה לאות ברור וספציפי ל-RNA תת-גנומי של SARS-coronavirus-2, בעוד ששימוש באתנול מביא לתמונה מטושטשת ולא ממוקדת. בעת הרכבת השקופיות עם תאי Vero, חשוב למקם כיסוי כשהתאים פונים כלפי מטה. בעת הרכבת שקופיות האנגיואדמה התורשתית, יש למקם את הממברנה כשהתאים פונים כלפי מעלה.
ניתן לשנות טכניקה זו בקלות כדי לאפשר זיהוי של כל RNA, כולל RNA לא מקודד ווירוסי RNA שעלולים להופיע בעתיד. בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את האינטראקציות בין חלבון ל-RNA ברמת התא הבודד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה המשלבת פלואורסצנציה של RNA in situ hybridization (RNA-FISH) עם אימונופלואורסצנציה לדמיית RNA של SARS-CoV-2. גישה זו משפרת את ההבנה של אינטראקציות RNA-מטרה של SARS-CoV-2 ברמת התא הבודד.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- וירולוגיה
- ביולוגיה תאית
רקע
- הבנת הפתוגנזה הנגיפית היא חיונית לפיתוח אבחונים וטיפולים יעילים.
- ל-SARS-CoV-2 יש השלכות משמעותיות על בריאות הציבור.
- דמיית RNA ברמת התא הבודד יכולה לספק תובנות על שכפול נגיפי.
- שילוב RNA-FISH עם אימונופלואורסצנציה מציעה ספציפיות ורגישות גבוהות.
מטרת המחקר
- לדמות RNA של SARS-CoV-2 במודלי תא שונים.
- לשפר את ההבנה של אינטראקציות נגיפיות בתוך תאי המארח.
- לספק כלי למחקר בסיסי ויישומי בוירולוגיה.
שיטות ששימשו
- קיבוע והחדירה של תאים.
- יישום מאגר הגברה לדמיית RNA.
- שימוש בסיכות HCR לגילוי RNA ספציפי.
- טכניקות אימונופלואורסצנציה להשלמת RNA-FISH.
תוצאות עיקריות
- RNA של SARS-CoV-2 הוצג בהצלחה בקווי תאים ובתרביות אפיתל דרכי נשימה אנושיות.
- השיטה הפגינה ספציפיות ורגישות גבוהות.
- התוצאות תורמות להבנה טובה יותר של הפתוגנזה הנגיפית.
- פרוטוקול זה יכול לשמש למטרות מחקר ואבחון כאחד.
מסקנות
- השיטה המשולבת יעילה לחקר SARS-CoV-2 ברמת התא הבודד.
- היא מספקת תובנות חשובות על אינטראקציות RNA-מטרה.
- גישה זו יכולה לסייע בפיתוח כלי אבחון.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
