זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

תולעת כותנה היא אחד המזיקים ההרסניים ביותר בעולם. עריכת גנום עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאפשרת מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים באורגניזם זה. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי יש לו ספציפיות גבוהה והוא כופר.

על מנת לבחור את מטרות sgRNA, עבור אל אתר האינטרנט המקוון CRISPR כדי לחפש אתרי מדריך אפשריים ואת exons קרוב חמשת האזורים העיקריים של הגן. הזן את רצף האקסון בתיבת הטקסט ובחר את גנום היעד לארמיגורה הליקוברפה. בחר באפשרות PAM עבור 20 BPNGG והשאר את ההגדרות האחרות בפרמטרי ברירת המחדל, בהתאם למדריכי המשתמש של אתר האינטרנט.

השווה את רצפי המדריכים החזויים מהתוכנה ובחר רצף מדריך של 20 זוגות בסיסים המכילים גואניס אחד או שניים ליד חמשת האזורים הלא מתווספים העיקריים עם היעילות החזויה הגבוהה ביותר והמעט ביותר אי-התאמות כדי לשפר את יעילות העריכה ולהפחית את העריכה מחוץ ליעד. להכנת עוברים, בחרו 50 אנשים בריאים מזכרים בני שלושה ימים ונקבות בנות יומיים, וערבבו אותם בכלוב רשת נקי. מניחים חתיכת כותנה לחה המכילה 10% תמיסת סוכר בכלוב.

לכסות את כלובי הרשת עם גזה ולתקן את הגזה עם גומייה. לרסס מים על הגזה כדי לשמור אותו לח. חותכים מטלית שחורה לגודל מתאים והחליפו את הגזה הלחה במטלית שחורה זו כדי לאפשר תנוחת ביציות חופשית למשך 30 דקות.

הדבק סרט דו-צדדי על שקופית מיקרוסקופ. בעזרת מלקחיים, הדבק את הטלאים בביצים בשורה על פני השטח של הסרט הדו-צדדי. הקש על השוליים של כל תיקון כדי לוודא שהם נדבקים בחוזקה לקלטת.

לאסוף 50 עד 100 ביצים לכל שקופית מיקרוסקופ. לפני המיקרו-הנדסה, שמור את החלקת המיקרוסקופ על הקרח כדי לעכב את התפתחות העוברים. הכן את המחט על ידי משיכת זכוכית נימית באמצעות משיכת מיקרו פיפטה כמתואר בכתב היד של הטקסט.

טוחנים את קצה המחט באמצעות מטחנת מיקרו לקצה חד. הכן פתרונות הזרקה על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של חלבון Cas9 ממוסחר ו- sgRNA למים נטולי RNace בצינור PCR כדי לקבל תערובת נפח של 10 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי צנרת ולשים אותו על קרח.

הגדר את הפרמטרים של המיקרו-מגרר האלקטרוני. טען שני microliters של התערובת לתוך מחט באמצעות קצה פיפטה microloader, מתיש כמה שיותר אוויר שיורית בקצה המחט ככל האפשר. חבר את מחט ההזרקה למיקרו-מניפולטור והבטח חיבור הדוק בין שני החלקים.

מניחים שקופית בצלחת פטרי ומניחים אותה על הבמה של המיקרוסקופ. הכנס בזהירות את קצה המחט לחצי הכדור העליון של עובר בזווית של 45 מעלות. לחץ על הדוושה כדי להעביר את התערובת לתוך העובר, מה שמוביל להתרחבות קלה של העובר.

מוציאים את המחט מיד מהעובר ומזיזים את צלחת הפטרי ביד אחת עד שהעובר הבא נמצא בסמיכות למחט. הזריקו לפחות 300 עוברים באמצעות אותו הליך כדי להבטיח כמות בקיעה מספקת. מכסים את המכסה של צלחות פטרי לאחר הזרקה.

כאשר צבע פני השטח של העוברים החשיך, לשים דיאטה מלאכותית בצלחת פטרי סביב שקופית המיקרוסקופ. הכינו צלחות תרבית של 24 בארות ומלאו כל באר עד שליש מקיבולת נפחיותה בתזונה מלאכותית. בחרו זחלים בוקעים באמצעות מברשת צבע קטנה והעבירו אותם לצלחת התרבות של 24 בארות, כך שלבאר אחת יש זחל אחד.

כאשר הזחלים גדלים לשלב האינסטאר השלישי, העבירו אותם לאתרה רקיע זכוכית חדש. העבירו את זכרי הג'י-זירו שזה עתה נסגרו ואת הנקבות המבוגרות הפראיות לכלוב רשת טרי ביחס שווה. ספק להם תמיסת סוכר של 10% שהושלכה בכדורי כותנה.

חרקים אחוריים באמצעות שיטות שגרתיות עד הגור של G-אחד. השתמש מלקחיים כדי להסיר בזהירות רגל אחורית ולשים כל רגל בצינור מטריקס Lysing. הומוגניזציה של הרגל האחורית באמצעות הומוגניזר רקמות.

לחלץ את ה- DNA הגנומי של המדגם הומוגני באמצעות ערכת מיצוי gDNA מסחרית על פי הוראות היצרן. הגבר את מקטע הגנים באמצעות פריימרים genotyping ותנאי תגובת PCR מכתב היד של הטקסט. אשר את הגנוטיפ באמצעות שירות רצף גנים.

שים G-אחד אנשים של אותו genotype בכלוב רשת אחד, עצמי לחצות את הצאצאים G-אחד ולהמשיך לסנן באמצעות אותן שיטות. אתר היעד של גן העניין היה ממוקם האקסון השני שלה. אתר זה נשמר מאוד ורסיס רצועת היעד של sgRNA מסונתז אושר באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose.

זיהוי המוטציה של יעד sgRNA יחיד בוצע על ידי ריצוף מוצרי PCR מיחידות הוריות G-אחד. האפקטיביות של שימוש בזוגות sgRNA שאינם חופפים על פני אקסונים שונים הודגמה כאשר המחיקה הגדולה של המוטנטים נבדלה בקלות מהמחבתות הפראיות. לאחר קבלת מספר מסוים של אנשים מוטנטיים, ניתן לבצע ניסויים אלקטרופיזיולוגיים או התנהגותיים כדי להבהיר את תפקוד הגנים ואת האינטראקציה בין גנים שונים.