Name: זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: למדו לזהות מוטציות נוקאאוט ב-CRISPR/Cas9 בזחלי Helicoverpa armigera באמצעות מיקרו-חדיר. פרוטוקול זה מאפשר חקר פונקציית גנים ואינטראקציות גנטיות בחסרון חקלאי מרכזי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31725023, 31861133019 ל- GW, 31171912 ל- CY).

1. עיצוב פריימרים ספציפיים לגן והכנת sgRNA
<ol><li>אמת אזור גנומי שמור בגן העניין באמצעות הגברת PCR וניתוחי רצף. הגבר את גן המטרה מהדנ"א הגנומי של H. armigera והבדיל בין האקסונים והאינטרונים. הערה: הספציפיות של הרצף של אתר המדריך נחוצה כדי למנוע עריכת גנים מחוץ למטרה. חיפוש אתרי מדריך אפשריים אקסונים קרובים 5 ' UTR של הגן. לאחר מכן, חשוב לוודא כי הגן הוא לגמרי לא פונקציונלי. סיכום נתיב הזרימה להכנת sgRNA מומחש באיור 1.</li>
	<li>בחר את מטרות sgRNA. השתמש באתר האינטרנט המקוון CRISPR CRISPOR (גרסה 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) כדי לחפש אתרי מדריך אפשריים באקסונים קרוב ל- 5' UTR של הגן. הזן את רצף האקסון בתיבת הטקסט ובחר את הגנום המשמש כיעד להליקוברפה ארמיגרה (Harm_1.0). בחר את האפשרות המוטיב הסמוך protospacer (PAM) של "20 bp-NGG" ולהשאיר את ההגדרות האחרות על הפרמטרים ברירת המחדל על פי מדריכים המשתמש של אתרי האינטרנט.</li>
	<li>השווה את רצפי המדריך החזויים מהתוכנה ובחר את רצף המדריכים עם היעילות החזויה הגבוהה ביותר והפחות אי-התאמות כדי לשפר את יעילות העריכה ולהפחית את העריכה מחוץ ליעד. מומלץ רצף מדריך של 20 bp המכיל G אחד או שניים ב- UTR 5' מכיוון שהוא יכול להגביר את יעילות החיתוך. הערה: זוג gRNAs על פני אזורי אקסון מומלץ גם לקבל מחיקת מקטע גדולה, אשר מפשטת זיהוי מוטציות בשלבים מאוחרים יותר. ודא שמרחק המרווח בין שני רצפי קו היישור שנבחרו הוא לפחות 100 bp. בפרוטוקול זה, אנו בוחרים את חלבון SpCas9 הנפוץ, המזהה את מוטיב NGG. על פי הוראת היצרן, רצף המדריך חסר G מקובל גם בעת בחירת מקדם T7 כי האמרגן מוסיף G ל 5 ' UTR של הרצף.</li>
	<li>עצבו קדימה והפוך אוליגונוקלאוטידים. הגדר את סדר הרצף לרצף מדריך 5'-20 bp-NGG-3' והפוך להשלים את רצף המדריך. הוסף את רצף מקדם T7 לרצף מדריך גדיל קדימה והפוך, בהתאמה על פי מדריך המשתמש של ערכת סינתזת gRNA. הערה: יש לא לכלול את רצף PAM NGG ברצף האוליגונוקלאוטיד.</li>
	<li>צור את sgRNA באמצעות ערכת סינתזת gRNA. תהליך זה כולל שלושה שלבים: הרכבת תבנית DNA, תמלול הפריה חוץ גופית וטיהור של sgRNA (איור 2). בצע כל שלב בהתאם להוראות המשתמש.</li>
</ol>2. הכנה ואיסוף עוברים
<ol><li>הפרד בין גולם זכר לנקבה כפי שתואר על ידי Hongtao et al.34 ולהפריד אותם לשני כלובי רשת שונים. לאחר עיקול, להאכיל אותם ~ 30 מ"ל של 10% (w / v) פתרון סוכר לבן כותנה סופגת בצלחת פטרי. הערה: 3 גרם של סוכר לבן הומס ב 30 מ"ל של מים סטריליים כדי להכין את 10% (w / v) פתרון סוכר לבן.</li>
	<li>בחרו 50 אנשים בריאים מזכרים בני 3 ימים ונקבות בנות יומיים, בהתאמה, וערבבו אותם בכלוב רשת נקי. מניחים חתיכת כותנה המכילה 10% (w / v) פתרון סוכר בכלוב ולשמור על הכותנה לחה. לכסות את כלובי הרשת עם גזה ולתקן את הגזה עם גומייה. לרסס מים על הגזה כדי לשמור על לחות.</li>
	<li>אפשר לעשים זכריים ונקביים נבחרים בשלב 2 להזדווג לחלוטין ולהתבונן בכמות הטלת הביצים. הערה: שיא ההוויה של H. armigera מופיע לאחר 21:00.m. לכן, יש לשקול את זמן ההזדווגות כדי להבטיח מספר מספיק של ביצים בשלבים הבאים. בשיאה של oviposition, להחליף את הגזה עם בד שחור ולאפשר oviposition חינם במשך 30 דקות. החליפו את הבד השחור כל 30 דקות לאיסוף ביצים טריות (איור 3A).</li>
	<li>חותכים את הבד השחור לכתמים בצורה לא סדירה בגודל של 3 מ"מ בערך. ודא ביצים נוספות על כל תיקון. הערה: הימנעו מבחירת ביצים מקומטות מכיוון שהן בדרך כלל לא מופרות.</li>
	<li>הדבק סרט דו-צדדי על שקופית מיקרוסקופ (25 מ"מ x 75 מ"מ) (איור 3B). בעזרת מלקחיים, הדבק את הטלאים בביצים בשורה על פני השטח של הסרט הדו-צדדי. הקש על השוליים של כל תיקון כדי לוודא שהם נדבקים בחוזקה לקלטת. אסוף 50-100 ביצים לכל שקופית מיקרוסקופ (איור 3C). הערה: הטלאים צריכים לכסות את המשטח המלא של הסרט הדו-צדדי, אחרת הזחל הבוקע יתקשה לזחול החוצה.</li>
	<li>לפני המיקרו-הנדסה, שמור את החלקת המיקרוסקופ על הקרח כדי לעכב את התפתחות העוברים.</li>
</ol>3. מיקרו-חדירה של עוברים
<ol><li>הכינו את המחט על ידי משיכת זכוכית נימית באמצעות משיכת מיקרופיפט (איור 4A). הגדר חום ל 540, למשוך ל 80, Vel ל 75, זמן ל 170 , ולחץ ל 450. טחון קצה המחט באמצעות מטחנת מיקרו. המחט האידיאלית מציגה קצה חד (איור 4B).</li>
	<li>הכנת פתרונות הזרקה. הוסף 2 μL של חלבון Cas9 ממוסחר (1 מ"ג / מ"ל) ו sgRNA (300-500-500 ng / μL ריכוז סופי) למים ללא RNase בצינור PCR כדי לקבל תערובת נפח 10 μL. נפח ה- sgRNA תלוי בריכוז שלו. מערבבים היטב על ידי צנרת ולשים אותו על קרח. הערה: כל הטיפים לפיפטה וצינורות PCR המשמשים בשלב זה הם ללא RNase.</li>
	<li>הגדר את הפרמטרים של המיקרו-מגרר האלקטרוני. הגדר את לחץ ההזרקה (pi) ל 1,500 hPa, זמן ההזרקה (ti) ל 0.1 s, ואת לחץ הפיצוי (pc) ל 30 hPa.</li>
	<li>טען 2 μL של התערובת לתוך מחט באמצעות קצה פיפטה מעמיס מיקרו. האוויר השיורי בקצה המחט צריך להיות מותש ככל האפשר.</li>
	<li>חבר את מחט ההזרקה למיקרו-מניפולטור והבטח חיבור הדוק בין שני החלקים.</li>
	<li>מניחים שקופית בצלחת פטרי (100 מ"מ) ומניחים אותה על הבמה של המיקרוסקופ (איור 5A).</li>
	<li>התאימו את מיקום קצה המחט מתחת למיקרוסקופ אור עד שגם קצה המחט וגם העוברים יהיו גלויים מתחת למיקרוסקופ (איור 5B).</li>
	<li>כוונן את עוצמת הקול של הטיפה. לחץ על הדוושה וצפה טיפת הנוזל בקצה המחט. התאם את לחץ ההזרקה של המיקרו-גנרטור עד שהנפח של ירידה נוזלית הוא כעשירית מנפח העוברים. הערה: איכות מחט ההזרקה חיונית לשיעור ההישרדות של עוברים.</li>
	<li>הכנס בזהירות את קצה המחט לחצי הכדור העליון של עובר בזווית של 45 מעלות (איור 5C). לחץ על הדוושה כדי להעביר את התערובת לתוך העובר. הזריקה מובילה להתרחבות קלה של העובר. משכו את המחט מיד מהעובר והזיזו את צלחת הפטרי ביד אחת עד שהעובר הבא נמצא בסמיכות למחט והזריקו לעובר הבא את אותו הליך. הערה: היציאה הציטופלסמית בחור הסיכה מקובלת. אם הדליפה הציטופלסמית היא יותר מדי, התאם את זווית המחט לזווית חמורה יותר עד שזרימת הנוזלים נשלטת.</li>
	<li>הזריקו לפחות 300 עוברים כדי להבטיח כמות בקיעה מספקת. מכסים את המכסה של צלחת פטרי (es) לאחר ההזרקה. הערה: הזמן מ oviposition להזרקה של 50-100 עוברים מוגבל ל 2 שעות. רוב העוברים עדיין נמצאים בשלב של תא אחד במסגרת זמן זו. באופן כללי, כדאי לחזור על הליך oviposition במהלך הזרקת עובר כדי לקדם את היעילות.</li>
</ol>4. גידול חרקים לאחר הזרקה
<ol><li>הפצת עוברים G0.<ol>
<li>לדגור על העוברים ב 60% לחות יחסית ו 28°C בתיבת אקלים מלאכותית עם 14 שעות אור / 10 שעות כהה.</li>
		<li>בדוק את התפתחות העוברים מדי יום לאחר ההזרקה. כאשר צבע פני השטח של העוברים החשיך, לשים דיאטה מלאכותית בצלחת פטרי סביב שקופית מיקרוסקופ, ולבדוק את התפתחות העוברים כל 12 שעות. הערה: הדיאטה המלאכותית מוכנה כמתואר על ידי Wu et al.35 ו Jha et al.36.</li>
		<li>הכינו צלחות תרבית של 24 בארות ומלאו כל באר עד שליש מקיבולת הנפח שלה בתזונה מלאכותית.</li>
		<li>בחרו זחלים בוקעים (איור 5D) בעזרת מברשת צבע קטנה והעבירו אותם לצלחת התרבותית בת 24 הבארות. הכנס זחל אחד לבאר כדי להבטיח שלכל זחל יש מספיק מזון כדי לשרוד. הערה: הזחלים של H. armigera גדלו בנפרד בכל באר מאז הם בדרך כלל קניבלים זה את זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>גידול זחלי G0<ol>
<li>עורף את הזחלים באותם תנאים כמו העוברים.</li>
		<li>תבדוק את הזחלים שבקעו כל יום. כאשר הזחלים גדלים לשלב האינסטאר השלישי, מעבירים כל זחל לדקטילטרה זכוכית חדשה, וממלאים חמישית מהנפח בתזונה מלאכותית.</li>
		<li>כ 12 d לאחר הדגירה, הזחלים הבוגרים צריכים להתחיל גור.</li>
		<li>הגולם הבוגר G0 נבדלים על בסיס מין ומונחים בכלובים נפרדים לפני עיקול. כמו כן מכינים את הגלמים בני הגיל הרך מסוג בר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>G0 מבוגרים גדלים<ol>
<li>בדוק את העיקול של סוג פראי וגולם מוטנטי מדי יום.</li>
		<li>העבר את זכרי G0 שזה עתה עיקלו ונקבות בוגרות מסוג בר לכלוב רשת טרי והפוך את היחס בין G0 לסוג הפראי בערך 1:1. לספק להם עם 10% (w / v) פתרון סוכר ירד כדורי כותנה.</li>
		<li>חרקים אחוריים בשיטה השגרתית לעיל עד הגור של דור אחד (G1).</li>
		<li>בעזרת dactylethrae, העבירו את הזוג הבודד החדש של בוגרי G1 לצנצנת פלסטיק (13 ס"מ x 12 ס"מ על 12 ס"מ על 12 ס"מ) המסופקת עם תמיסת סוכר של 10% (w/v). מכסים כל צנצנת בגאזה. קח בערך 50 זוגות של מבוגרים G1 בסך הכל. הערה: עיקול של עשים נקביים קדם לזה של עש זכר. באופן כללי, גבר בן 3 ימים ונקבה בת יומיים בוגרים מינית ומוכנים להזדווג. המבוגרים שזה עתה עיקלו לא יזדווגו בתקופת האור הראשונה שלהם ללא האכלה.</li>
		<li>לאסוף את המבוגרים G1 בצנצנת פלסטיק לאחר שהטילו ביצים. שים כל עש מבוגר בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. זיהוי מוטציות נוק-אאוט
<ol><li>עצב זוג פריימרים המשתרעים על פני האתר החתוך החזוי. יש להגדיר את הפריימרים במרחק של לפחות 50 bp משני הצדדים (במעלה הזרם ובמורד הזרם) מאתר היעד. הערה: הפריימרים לזיהוי רצף היעד מכסים לעתים קרובות טווחים גדולים כדי להגביר ביעילות.</li>
	<li>בצע את תגובת PCR באמצעות פריימרים genotyping עם DNA הגנום שחולצו בסעיף 1. בצע רכיבה על אופניים PCR ב 95 °C (50 °F) עבור 20 s; 35 מחזורים של 95 °C עבור 20 s, 55 °C (55 °F) עבור 20 s, 72 °C (72 °F) במשך 1 דקות; 72 °C (7 °F) במשך 5 דקות, ו 4 °C (60 °F) בהמתנה. לאמת את מוצר התגובה באמצעות 1% (w / v) ג'ל agarose. הזוג הנבחר של פריימרים לזיהוי אושר על ידי האיכות של מוצר PCR. אם הרצועות ברורות וספציפיות, הפריימרים יכולים לשמש לגילוי מוטציות נוסף בהתבסס על גודל האמפליקונים.</li>
	<li>מסך עבור אנשים ערוכים פוטנציאליים. הסר רגל אחורית בזהירות באמצעות מלקחיים ולשים כל רגל בצינור מטריצה lysing, בהתאמה. סמן את צינור מטריצת הליסינג בהתאם למספר על דקטילטרה הזכוכית.</li>
	<li>הומוגניזציה של הרגל האחורית באמצעות הומוגניזר רקמות. הגדר את המהירות ל-6.0 מ'/ש' ואת השעה ל-60 שניות. לחלץ את ה- DNA הגנומי של המדגם הומוגני באמצעות ערכת מיצוי gDNA מסחרית על פי הוראות היצרן.</li>
	<li>הגבר את מקטע הגנים באמצעות פריימרים genotyping עם אותם תנאי תגובת PCR כמתואר בשלב 2. אשר את הגנוטיפ על-ידי שירות ריצוף גנים. לאחר שזוהו גנוטיפים מוטנטיים G1 (היעד לאותו אתר) הכלולים באותה צנצנת, שמור על צאצאי G1 ושנה את שמו לדור השני (G2).</li>
	<li>שים G1 אנשים מאותו גנוטיפ בכלוב רשת אחד. חוצים את צאצאי ה-G1 וממשיכים לסנן באותן שיטות.</li>
	<li>הגבר את מקטע הגנים ואשר את הגנוטיפ באותו הליך כפי שמתואר בשלב 2. להשיג קווי הומוזיגוס G2 ולשמור על קו מוטציה נוק-אאוט.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edited+course+of+biomedical+research%3A+leaping+forward+with+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li>
<li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li>
<li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy%3A+pre-clinical+progress+in+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li>
<li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+genome+editing+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li>
<li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22World+Patent+Information%22%5BJournal%5D)">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944(2020).</li>
<li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science%3A+Current+status%2C+future+perspectives%2C+and+associated+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li>
<li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586(2018).</li>
<li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+platforms+for+genome+editing+in+plants%3A+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li>
<li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+multifaceted+CRISPR%2FCas+gene+editing+tool+for+plant+research%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li>
<li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li>
<li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology%3A+from+prokaryotes+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li>
<li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+insects%3A+Applications%2C+best+practices+and+biosafety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li>
<li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+genome+editing+with+CRISPR%2FCas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620(2016).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li>
<li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+%28H%C3%BCbner%29%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%3A+implications+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cloning%2C+prokaryotic+expression%2C+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H%C3%BCbner+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22(2018).</li>
<li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li>
<li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666(2016).</li>
<li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+%28Spodoptera+frugiperda%2C+Noctuidae%29+with+different+host-plant+ranges%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li>
<li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147(2017).</li>
<li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427(2020).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li>
<li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Tobacco+Sciene+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li>
<li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li>
<li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+%28H%C3%BCbner%29+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+Based+on+Life+Table+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30(2012).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Zheng, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae%2C+or+puparia%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Applied+Entomology%22%5BJournal%5D)">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21(2018).</li>
<li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+The+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li>
<li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth%2C+Helicoverpa+assulta%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li>
<li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators%3A+ii.+Halisidota+argentata+pack.+%28arctiidae%29%2C+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+%28GEOMETRIDAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים.

היישום של מערכת CRISPR/Cas9 סיפק תמיכה טכנית רבת עוצמה לניתוח תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים. הפרוטוקול המפורט שאנו מציגים כאן מדגים את הדור של מוטציה הומוזיגוטה ב H. armigera באמצעות עריכת גנום CRISPR / Cas9. הליך אמין זה מספק דרך פשוטה עבור mutagenesis גנים מכוונים ב H. armigera.
הבחירה באתרי היעד של CRISPR עשויה להשפיע על יעילות המוטגנזה37. בפרוטוקול זה, השווינו וניתחנו תוצאות מרובות מאתר האינטרנט המקוון CRISPOR כדי להשיג אתר יעד מתאים. בסיל...

היישום של טכנולוגיית עריכת הגנום מספק כלי יעיל להשגת מוטציות גן יעד במינים מגוונים. הופעתה של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצות באופן קבוע (CRISPR)/חלבון קשור 9 (Cas9) מספקת שיטה חדשנית לתפעול הגנום1. מערכת CRISPR/Cas9 מורכבת מ-RNA מדריך (gRNA) ו-Cas9 endonuclease2,3, בעוד שניתן לחלק עוד יותר את ה-gRNA לשני חלקים, RNA CRISPR משלים מטרה (crRNA) וקרנ"א טרנס-הפעלה (tracrRNA). ה- gRNA משתלב עם אנדונוקלאז Cas9 ויוצר ריבונוקלאופרוטאין (RNP). עם gRNA, ניתן להפנות אנדונוקלאז Cas9 לאתר מסוים של הגנום באמצעות השלמת בסיס. תחומי RuvC ו- HNH של ה- Cas9 מבקעים את אתר היעד של הגנום שלושה בסיסים לפני רצף המוטיב הסמוך לפרוטו-חלל (PAM) ויוצרים הפסקה כפולת גדילים (DSB). לאחר מכן ניתן לתקן את מחשוף ה- DNA באמצעות שני מנגנונים, צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)4. תיקון של DSB מציג הוספות או מחיקות כדרך להשבית את הגן הממוקד, שעלול לגרום לאובדן מוחלט של תפקוד הגנים. לפיכך, הגילוי והספציפיות של מערכת CRISPR/Cas9 הופכים אותה לשיטה חזקה לאפיון פונקציות גנים ב- vivo ולניתוח אינטראקציות גנים5.
עם יתרונות רבים, מערכת CRISPR/Cas9 יושמה בתחומים שונים, כולל ביו-רפואה6,7, טיפול גנטי8,9 וחקלאות10,11,12, ושימשה למערכות ביולוגיות שונות כולל מיקרואורגניזמים13, צמחים14,15, נמטודות16 , ויונקים17 . אצל חסרי חוליות, מינים רבים של חרקים נחשפו לעריכת גנום CRISPR/Cas9, כגון זבוב הפירות Drosophila melanogaster ומעבר ל-18,19,20,20,21,22.
ארמיגרה הליקוברפה הוא אחד המזיקים ההרסניים ביותר ברחבי העולם23, ופוגע ביבולים רבים, כולל כותנה, פולי סויה וסורגום24,25. עם התפתחות טכנולוגיית הרצף, הגנום של H. armigera, כמו גם של מגוון של מיני חרקים לפידופטרה, כבר רצף לחלוטין 26,27,28,29. מספר רב של גנים של התנגדות קולטן חוש הריח זוהו ואופיינו מחרקים אלה בשנים האחרונות19,27,28,29. כמה גנים הקשורים להתנגדות זוהו H. armigera, כגון קידוד הגנים עבור cadherin30, טרנספורטר קלטות מחייב ATP31,32, כמו גם HaTSPAN133. נוקאאוט של גנים אלה באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9 גורם לרמה גבוהה של עמידות לרעלן Bacillus thuringiensis (BT) בזנים רגישים. כמו כן, צ'אנג ואח ' (2017) דפק את קולטן פרומון, אשר אימת את תפקידו המשמעותי ברגולציה זמן ההזדווגות19. דיווחים אלה מצביעים על כך ש-CRISPR/Cas9 יכול לשמש ככלי יעיל לחקר תפקוד הגנים במערכות חרקים. עם זאת, הליך מפורט לשינוי CRISPR/Cas9 במערכות החרקים נותר לא שלם, מה שמגביל את טווח היישום שלו בגנומיקה תפקודית של חרקים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפלת גן פונקציונלי ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. פרוטוקול מפורט מפורט שלב אחר שלב מסופק, כולל תכנון והכנה של פריימרים ספציפיים לגן לייצור gRNA, איסוף עוברים, מיקרו-חדירה, גידול חרקים וזיהוי מוטציות. פרוטוקול זה משמש התייחסות בעלת ערך למניפולציה של כל הגנים התפקודיים ב - H. armigera וניתן להרחיבו למינים אחרים של לפידופטרה.

<table><tbody><tr><td>סולם DNA 2kb</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM101</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית נימית</td><td>עולם הוראות דיוק</td><td>504949</td><td>המכונה "זכוכית נימית" בפרוטוקול</td></tr><tr><td>סרט דו צדדי</td><td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf InjectMan 4 מיקרומניפולטור</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>5192000051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>G2835241</td><td></td></tr><tr><td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A29377</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>מפרש מותג</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס תאגיד</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premix)</td><td>Takara Biomedical Technology</td><td>R040</td><td>המשמש לזיהוי מוטציות</td></tr><tr><td>Sutter Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>TIANamp Genomic DNA Kit</td><td>TIANGEN Corporate</td><td>DP304-03</td><td></td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 חלבון v2</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>A36499</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של crispr/cas9 גנום ערוך helicoverpa armigera (hübner)

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

תולעת הכותנה, הליקוברפה ארמיגרה, היא אחד המזיקים ההרסניים ביותר בעולם. שילוב של גנטיקה מולקולרית, פיזיולוגיה, גנומיקה תפקודית ומחקרים התנהגותיים הפך את H. armigera למין מודל ב- Lepidoptera Noctuidae. כדי לחקור את הפונקציות in vivo של ואינטראקציות בין גנים שונים, מקובצים באופן קבוע interspaceed חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)/ הקשורים חלבון 9 (Cas9) טכנולוגיית עריכת גנום היא שיטה נוחה ויעילה המשמשת לביצוע מחקרים גנומיים פונקציונליים. במחקר זה, אנו מספקים שיטה שיטתית שלב אחר שלב כדי להשלים נוקאאוט גנים ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. העיצוב והסינתזה של מדריך RNA (gRNA) מתוארים בפירוט. לאחר מכן, השלבים הבאים המורכבים מתכנון פריימר ספציפי לגנים ליצירת RNA מדריך (gRNA), איסוף עוברים, מיקרו-גירוי, גידול חרקים וזיהוי מוטציות מסוכמים. לבסוף, עצות והערות לפתרון בעיות מסופקות כדי לשפר את היעילות של עריכת גנים. השיטה שלנו תשמש התייחסות ליישום של עריכת גנום CRISPR / Cas9 ב H. armigera , כמו גם עשים אחרים Lepidopteran.

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים להשגת קווי נוק-אאוט גנטיים של H. armigera באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9. התוצאות הייצוגיות שהושגו על ידי פרוטוקול זה מסוכמות עבור בחירת gDNA, איסוף עוברים והזרקה, גידול חרקים וזיהוי מוטציות.
במחקר זה, אתר היעד של גן העניין שלנו היה ממוקם באקסון השני שלו (איור 2A). אתר זה נשמר מאוד, ורסיס רצועת היעד של sgRNA מסונתז אושר באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose (<strong...

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

תולעת כותנה היא אחד המזיקים ההרסניים ביותר בעולם. עריכת גנום עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאפשרת מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים באורגניזם זה. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי יש לו ספציפיות גבוהה והוא כופר.על מנת לבחור את מטרות sgRNA, עבור אל אתר האינטרנט המקוון CRISPR כדי לחפש אתרי מדריך אפשריים ואת exons קרוב חמשת האזורים העיקריים של הגן. הזן את רצף האקסון בתיבת הטקסט ובחר את גנום היעד לארמיגורה הליקוברפה. בחר באפשרות PAM עבור 20 BPNGG והשאר את ההגדרות האחרות בפרמטרי ברירת המחדל, בהתאם למדריכי המשתמש של אתר האינטרנט.השווה את רצפי המדריכים החזויים מהתוכנה ובחר רצף מדריך של 20 זוגות בסיסים המכילים גואניס אחד או שניים ליד חמשת האזורים הלא מתווספים העיקריים עם היעילות החזויה הגבוהה ביותר והמעט ביותר אי-התאמות כדי לשפר את יעילות העריכה ולהפחית את העריכה מחוץ ליעד. להכנת עוברים, בחרו 50 אנשים בריאים מזכרים בני שלושה ימים ונקבות בנות יומיים, וערבבו אותם בכלוב רשת נקי. מניחים חתיכת כותנה לחה המכילה 10% תמיסת סוכר בכלוב.לכסות את כלובי הרשת עם גזה ולתקן את הגזה עם גומייה. לרסס מים על הגזה כדי לשמור אותו לח. חותכים מטלית שחורה לגודל מתאים והחליפו את הגזה הלחה במטלית שחורה זו כדי לאפשר תנוחת ביציות חופשית למשך 30 דקות.הדבק סרט דו-צדדי על שקופית מיקרוסקופ. בעזרת מלקחיים, הדבק את הטלאים בביצים בשורה על פני השטח של הסרט הדו-צדדי. הקש על השוליים של כל תיקון כדי לוודא שהם נדבקים בחוזקה לקלטת.לאסוף 50 עד 100 ביצים לכל שקופית מיקרוסקופ. לפני המיקרו-הנדסה, שמור את החלקת המיקרוסקופ על הקרח כדי לעכב את התפתחות העוברים. הכן את המחט על ידי משיכת זכוכית נימית באמצעות משיכת מיקרו פיפטה כמתואר בכתב היד של הטקסט.טוחנים את קצה המחט באמצעות מטחנת מיקרו לקצה חד. הכן פתרונות הזרקה על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של חלבון Cas9 ממוסחר ו- sgRNA למים נטולי RNace בצינור PCR כדי לקבל תערובת נפח של 10 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי צנרת ולשים אותו על קרח.הגדר את הפרמטרים של המיקרו-מגרר האלקטרוני. טען שני microliters של התערובת לתוך מחט באמצעות קצה פיפטה microloader, מתיש כמה שיותר אוויר שיורית בקצה המחט ככל האפשר. חבר את מחט ההזרקה למיקרו-מניפולטור והבטח חיבור הדוק בין שני החלקים.מניחים שקופית בצלחת פטרי ומניחים אותה על הבמה של המיקרוסקופ. הכנס בזהירות את קצה המחט לחצי הכדור העליון של עובר בזווית של 45 מעלות. לחץ על הדוושה כדי להעביר את התערובת לתוך העובר, מה שמוביל להתרחבות קלה של העובר.מוציאים את המחט מיד מהעובר ומזיזים את צלחת הפטרי ביד אחת עד שהעובר הבא נמצא בסמיכות למחט. הזריקו לפחות 300 עוברים באמצעות אותו הליך כדי להבטיח כמות בקיעה מספקת. מכסים את המכסה של צלחות פטרי לאחר הזרקה.כאשר צבע פני השטח של העוברים החשיך, לשים דיאטה מלאכותית בצלחת פטרי סביב שקופית המיקרוסקופ. הכינו צלחות תרבית של 24 בארות ומלאו כל באר עד שליש מקיבולת נפחיותה בתזונה מלאכותית. בחרו זחלים בוקעים באמצעות מברשת צבע קטנה והעבירו אותם לצלחת התרבות של 24 בארות, כך שלבאר אחת יש זחל אחד.כאשר הזחלים גדלים לשלב האינסטאר השלישי, העבירו אותם לאתרה רקיע זכוכית חדש. העבירו את זכרי הג'י-זירו שזה עתה נסגרו ואת הנקבות המבוגרות הפראיות לכלוב רשת טרי ביחס שווה. ספק להם תמיסת סוכר של 10% שהושלכה בכדורי כותנה.חרקים אחוריים באמצעות שיטות שגרתיות עד הגור של G-אחד. השתמש מלקחיים כדי להסיר בזהירות רגל אחורית ולשים כל רגל בצינור מטריקס Lysing. הומוגניזציה של הרגל האחורית באמצעות הומוגניזר רקמות.לחלץ את ה- DNA הגנומי של המדגם הומוגני באמצעות ערכת מיצוי gDNA מסחרית על פי הוראות היצרן. הגבר את מקטע הגנים באמצעות פריימרים genotyping ותנאי תגובת PCR מכתב היד של הטקסט. אשר את הגנוטיפ באמצעות שירות רצף גנים.שים G-אחד אנשים של אותו genotype בכלוב רשת אחד, עצמי לחצות את הצאצאים G-אחד ולהמשיך לסנן באמצעות אותן שיטות. אתר היעד של גן העניין היה ממוקם האקסון השני שלה. אתר זה נשמר מאוד ורסיס רצועת היעד של sgRNA מסונתז אושר באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose.זיהוי המוטציה של יעד sgRNA יחיד בוצע על ידי ריצוף מוצרי PCR מיחידות הוריות G-אחד. האפקטיביות של שימוש בזוגות sgRNA שאינם חופפים על פני אקסונים שונים הודגמה כאשר המחיקה הגדולה של המוטנטים נבדלה בקלות מהמחבתות הפראיות. לאחר קבלת מספר מסוים של אנשים מוטנטיים, ניתן לבצע ניסויים אלקטרופיזיולוגיים או התנהגותיים כדי להבהיר את תפקוד הגנים ואת האינטראקציה בין גנים שונים.

embryo-microinjection-knockout-mutant-identification-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

מחקר זה מספק הליך מותאם באופן שיטתי של בנייה מבוססת ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כמו גם שיטה מפורטת לשימור בהקפאה והחייאת ביצי ארבה.

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים שלב אחר שלב עבור מוטגנזה של CRISPR/Cas9 של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis. צעדים מפורטים המסופקים על ידי פרוטוקול סטנדרטי זה ישמשו כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטים למחקרי גנים פונקציונליים ב - B. dorsalis.

פרוטוקולים עבור CRISPR/Cas9 Mutagenesis של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

למדו לזהות מוטציות נוקאאוט ב-CRISPR/Cas9 בזחלי Helicoverpa armigera באמצעות מיקרו-חדיר. פרוטוקול זה מאפשר חקר פונקציית גנים ואינטראקציות גנטיות בחסרון חקלאי מרכזי.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

גלה סרטונים נוספים