Name: הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצין עם מיקרוסקופיית הרחבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: למד הדמיית חלבונים גלומרולריים ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית הרחבה. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של nephrin, actin ו-podocin בדיוק של 70 ננומטר במיקרוסקופ רגיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לבלנקה דובנג'אק וניקולה קוהר על הסיוע הטכני המצוין שלהם.

1. פיצול וזריעת תאים
<ol><li>לחמם את מדיום הנשר שונה של Dulbecco סטרילי (DMEM) כולל 10% סרום עגל עוברי (FCS), מלוחים סטריליים פוספט אגירה (PBS) ו טריפסין סטרילי ל 37 °C (69 °F). הפעל את הספסל הנקי.</li>
	<li>הכינו צלחת של 6 בארות על ידי הוספת כיסוי זכוכית סטרילי אחד (10 מ"מ) לכל באר באמצעות מלקחיים סטריליים.</li>
	<li>שים צלחת 10 ס"מ תרבות התא עם תאי Cos7 מתחת לספסל נקי. מתחת לספסל הנקי, שאף את מדיום התאים באמצעות מכשיר ואקום.</li>
	<li>החזק את צלחת תרבות התא angulated ביד אחת ולהוסיף 10 מ"ל של PBS סטרילי לצד של צלחת תרבות התא, כדי למנוע שטיפה את התאים. מניחים את צלחת תרבות התא למטה, כך PBS שוטף את צלחת תרבות התא המלא.</li>
	<li>הסר את PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין לאמצע צלחת תרבות התא דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לעצור את תגובת trypsinization על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM כולל 10% FCS ו pipette פתרון התא למעלה ולמטה עם pipettor להפריד באופן ידני את התאים.</li>
	<li>לנתח את מספר התא למיליליטר באמצעות תא ספירה.</li>
	<li>זרע 68,000 תאים ב 2 מ"ל בינוני לכל באר על כיסוי זכוכית מחליק בצלחת 6-well. פזרו את התאים בתוך הלוח של 6 בארות על ידי טלטול זהיר של הצלחת אופקית ואנכית. הערה: תאים צריכים לשכב מפוזרים.</li>
	<li>דגירה התאים לילה באינקובטור 37 °C (37 °F) עם 5% CO2.</li>
</ol>2. הדבקה של תאים
<ol><li>הכן שני צינורות סטריליים 1.5 מ"ל (אחד עבור DNA מדולל (A) ואחד עבור ריאגנט מדולל עבור transfection השומנים הקטיוניים (B)). פיפטה 0.75 מיקרוגרם של nephrin ו 0.75 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי cDNA podocin לכל באר לתוך צינור אחד 1.5 מ"ל לדלל אותו לתוך 100 μL של מדיום סרום מופחת לכל באר. הוסף 3 μL של ריאגנט transfection השומנים הקטיוניים לכל טוב לצינור השני 1.5 מ"ל לדלל עם 100 μL של מדיום סרום מופחת. דגירה שתי התגובות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שלבו את שתי התגובות (A ו-B) למתחם DNA-שומנים והדגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להוסיף 200 μL של קומפלקס DNA-שומנים לכל באר.</li>
	<li>דגירה התאים transfected ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2 עבור 48 שעות מבלי לשנות את המדיום.</li>
</ol>3. אימונולה של מבנים תאיים
<ol><li>הכן פתרון תיקון (4% (w / v) paraformaldehyde ב PBS, 1 מ"ל / טוב), פתרון פרמביליזציה (0.5% (w / v) טריטון X-100 ב PBS, 1 מ"ל / טוב), ופתרון חסימה (5% (v / v) סרום סרום אלבומין ב PBS, 1 mL / טוב).</li>
	<li>הסר את המדיום באמצעות התקן ואקום. הוסף 2 מ"ל של PBS לכל באר כדי להסיר מדיום נוסף. לשאוף את PBS לחלוטין. הערה: כדי להימנע משטיפת תאים עם PBS, הקפד pipette PBS לא על כיסוי זכוכית להחליק ישירות.</li>
	<li>לתקן תאים עם 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) מומס PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: לחלופין, לתקן תאים ב 3% (v / v) גליוקסל-אתנול18.</li>
	<li>השלך PFA ולשטוף תאים פעמיים PBS (2 מ"ל כל אחד) על ידי הימנעות צינור ישיר על תלושי כיסוי זכוכית. לחלחל את התאים הקבועים עם טריטון X-100 0.5% (w / v) ב PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את פתרון permeabilization ולשטוף פעמיים עם PBS כפי שצוין בשלב 3.2.</li>
	<li>חסום את התאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של 5% (v/v) BSA ב- PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. דגירה התאים עם 200 μL של הנוגדן העיקרי (נוגדן אנטי podocin 1:200 ב 1% (v / v) BSA ב PBS) לילה ב 4 °C (69 °F). הערה: לחלופין, דגירה הנוגדן העיקרי עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את הנוגדן העיקרי ולשטוף שלוש פעמים עם PBS כמו בשלב 3.2. הוסף את הנוגדן המשני (עז נגד ארנב Alexa 488 1:1000 ב 1% (v / v) BSA ב PBS) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. השאר את התאים בחושך באמצעות תיבה.</li>
	<li>להשליך את הנוגדן המשני ולשטוף עם PBS שלוש פעמים.</li>
	<li>הסר PBS ולהדגיר את התאים עם 200 μL של נוגדן אנטינפרין 1:100 ב 1% (v / v) BSA ב PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. לשטוף עם PBS שלוש פעמים. השאר את התאים בחושך באמצעות תיבה.</li>
	<li>הסר PBS ודגר עם חמור הנוגדן המשני נגד שרקן 633, 1:200, במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף עם PBS שלוש פעמים. השאר את התאים בחושך באמצעות תיבה.</li>
</ol>4. מיקרוסקופיית הרחבה
<ol><li>הכנה
	<ol>
<li>כדי ליצור את המרווחים עבור תא הג'לציה, כיסוי זכוכית חתוך מחליק #1.0 ו- #1.5 לפסים 5 מ"מ (ארבעה כל שקופית זכוכית) באמצעות סכין יהלום. מקמו את פסי החלקת הכיסוי #1.5 מ"מ כך שייצרו ריבוע באורך 2.5 ס"מ על מגלשת זכוכית והניחו אותם בתא מכתים(איור 2A1-C1). פיפט טיפה של ddH2O לפינות הכיכר לדבוק פסים לכסות זכוכית להחליק אחד לשני אל מגלשת הזכוכית(איור 2A2-C2). הערה: הימנע ייבוש מלא של ddH2O כמו כוח הידבקות ילך לאיבוד. במידת הצורך, יש למרוח טיפות נוספות של ddH2O. המתן כ- 20 דקות כך שתעודות כיסוי #1.5 מ"מ מחוברות ביציבות לפני שתתחיל בשלב 4.1.2.</li>
		<li>מניחים ארבעה פסים #1.0 כיסוי זכוכית להחליק לכל כיסוי להחליק על #1.5 מ"מ לכסות תלושים. הדבק את הפסים על-ידי צנרת טיפה על כל פס החלקה #1.5 מ"מ(איור 2A3-C3). הערה: עובי הג'ל צריך להיות לפחות 0.15 מ"מ כדי להקל על הטיפול בהתקדמות הפרוטוקול. עם זאת, כדי למנוע ג'ל מוגזם על גבי התאים, לשמור על גובה מרווחים קרוב מצע התא. על ידי שימוש #1.5 ו פסים #1.0 לכסות להחליק כמו מרווחים, גובה המרווחים יהיה כ 0.3 מ"מ. התאים נצמדים לזכוכית הכיסוי (גובה 0.12 מ"מ). לכן, הג'ל יהיה עבה מספיק כדי להתמודד אבל ג'ל מוגזם על גבי התאים נמנע באמצעות #1.0 ו #1.5 לכסות פסים זכוכית כמו מרווחים.</li>
		<li>למכסה תא הג'לציה יש לעטוף כיסוי (#1.5) בסרט פרפין. הימנעו מקפלי או לכלוך על סרט הפרפין(איור 2A5-C5).</li>
	</ol></li>
	<li>עיגון ופולמור (ג'לציה)
	<ol>
<li>הכנת מאגר העיגון (ראה טבלה 1). לטיפול בעיגון, יש להחליף את PBS ב-250 μL של חיץ עיגון לבאר ישירות על כיסוי הזכוכית ולדגירה למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. שמור על המצע בחושך באמצעות תיבה. הערה: לחלופין, דגירה לילה בטמפרטורת החדר. מכינים מאגר עיגון טרי לכל ניסוי ומחכים 10-15 דקות עד שהוא מומס כראוי. 6-(אקרילויל)אמינו)חומצה הקסנואית, succinimidyl אסתר (AcX) צריך להיות מוחלף כל 4-5 חודשים כדי להבטיח עיגון נאות.</li>
		<li>הסר את מאגר העיגון ושטוף פעם אחת עם PBS של 1.5 מ"ל לבאר.</li>
		<li>כדי להכתים סיבי אקטין, להפשיר פתרון פאלודין תואם ExM ולהדגיר את הפאלואידין (5 μL של פאלודין מדולל ב 195 μL של 1% (v / v) BSA ב PBS / טוב) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שמור דגימות בחושך באמצעות תיבה.</li>
		<li>בינתיים, להמיס אקרילט נתרן ב ddH2O באמצעות מכשיר ערבוב. על הקרח, הכינו את פתרון המונומר (ראו טבלה 1). הערה: אקרילט נתרן מומס צריך להיות פתרון ברור וחסר צבע. אם הפתרון הוא צהוב, להחליף עם אקרילט נתרן חדש.</li>
		<li>הכינו את תמיסת הג'לינג על הקרח (ראו טבלה 1). פיפט אמוניוםפרוקסידסולפט (APS) לתוך פתרון gelling ממש לפני פתרון gelling מוחל על תא הג'לציה.</li>
		<li>הסר phalloidin מן התאים לשטוף עם 1.5 מ"ל של PBS פעמיים בטמפרטורת החדר. השאר 1.5 מ"ל PBS בתוך הבאר כדי להקל על הסרת המדגם על תלוש כיסוי זכוכית.</li>
		<li>מניחים את התאים על זכוכית הכיסוי לתוך תא gelling באמצעות מלקחיים קנולה להרים את החלקת זכוכית כיסוי מצלחת 6-well. הערה: התאים צריכים להיות בחלק העליון של תלוש כיסוי הזכוכית. כיסוי הזכוכית לא צריך לגעת במרווחים.</li>
		<li>הוסף APS לתמיסת gelling ומערבולת בקרוב. פיפט 200 μL של פתרון gelling על המדגם (איור 2A4-C4). סגור בזהירות את תא הג'לציה על ידי הימנעות מבועות אוויר בתוך הג'ל(איור 2A5-C5).</li>
		<li>דגירה תא gelling לפחות 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס כדי polymerize את הג'ל בתא הכתם הרטוב.</li>
	</ol></li>
	<li>הומוגניזציה (עיכול)
	<ol>
<li>תוציא את תא ההכתמה מהחממה. כדי לפתוח את מכסה תא הג'לציה, הציגו סכין גילוח בין המכסה למרווח. הסר את המכסה בזהירות. הסר את המרווחים עם סכין הגילוח ולחסל את כל הג'ל הנוסף על ידי חיתוך אותו עם סכין הגילוח.</li>
		<li>שים את השקופית עם הג'ל לכסות זכוכית לתוך צלחת מלאה PBS. על ידי טלטול עדין, להסיר את כיסוי מנותק מן הג'ל. כדי להסיר את הג'ל מהצלחת בקלות, לשים את השקופית מתחת לג'ל לצרף את הג'ל למגלשה.</li>
		<li>עם הג'ל על המגלשה, מחלקים את הג'ל לחתיכות קטנות (רבע מהג'ל מחולק לשניים עד שלושה חלקים) באמצעות סכין הגילוח. בעדינות לדחוף חתיכה אחת של ג'ל לתוך באר של צלחת 6-well עם תחתית זכוכית להקיף אותו על ידי מברשת צבע. שמור על ג'ל לחות עם כמות קטנה של PBS באמצעות מברשת צבע, כדי למנוע התייבשות של הג'ל. הערה: התאים פונים כלפי מטה.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופ הפוך, צלם תמונות מבט כולל עם צמצם מספרי נמוך כדי לקבוע את גורם ההתפשטות לאחר ההתפשטות.</li>
		<li>הכן את מאגר העיכול (ראה טבלה 1). לדלל Proteinase K ל 4 U / mL במאגר העיכול כדי לקבל את פתרון העיכול. הערה: ניתן לאחסן מאגר עיכול ללא Proteinase K ב-4°C למשך שבוע-שבועיים.</li>
		<li>הוסף 500 μL של פתרון העיכול לכל באר לטבול את הג'ל בתוך הפתרון. תן לו לעכל לילה בטמפרטורת החדר ולסגור את המכסה שמירה על הדגימות בחושך. הערה: לחלופין, תן לו לעכל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>הרחבה
	<ol>
<li>הסר את פתרון העיכול עם פיפטה והשליך אותו. הוסיפו 1 מ"ל של ddH2O. דגירו את הג'ל השקוע במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את המים ולהוסיף 1 מ"ל של ddH טרי2O. לחכות 10 דקות ולהמשיך להחליף מים כל 10 דקות עד רמה של הרחבה הוא הגיע. הערה: הרחבה לדוגמה עד פי 4.5 ניתנת להשגה. הג'ל נעשה ברור אופטית.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה
	<ol>
<li>מוציאים את המים מהג'ל ומתחילים ישירות מיקרוסקופיה. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, השתמש בעיקר במטרת אוויר (הגדלה נמוכה) כדי למצוא תאים בתמונה במצב שלפני ההתפשטות (שלב 4.3.4).</li>
		<li>עבור ליעד 40x (שמן/מים) ו- 63x לרזולוציה טובה יותר. לרגש עם אורך הגל של עניין ולקחת את התמונה דרך המצלמה.</li>
	</ol></li>
	<li>אימות
	<ol>
<li>צלם תמונת מבט כוללת של הדוגמה. חפש והתאם לאותם מבנים בתוך המדגם שצולמו בשלב 4.3.4. השתמשו בערוץ עם יחס האות לרעש הטוב ביותר לאימות (איור 3 A-B). הערה: התאם את פרמטרי ההדמיה כדי להשיג בהירות דומה לזו של התמונה שנרכשה במצב שאינו מורחב (שלב 4.3.4).</li>
		<li>שכבת-על של תמונות לפני ואחרי ההרחבה על-ידי סיבובן והסטתן באמצעות ImageJ. השתמש בכלי מדידת המרחק ב- ImageJ כדי למדוד את המרחקים בין מבנים הניתנים לזיהוי ברור. למדוד לפחות 10 מבנים שונים. הערה: לחלופין, השתמש בתסריט פייתון כדי למדוד מרחקים כמתוארב- 14.</li>
		<li>חשב את פקטור ההרחבה על-ידי חלוקת מדידות לאחר/קדם-הרחבה.</li>
		<li>לקביעת עיוותים, צלם תמונות עם פתח מספרי גבוה יותר (איור 4A-B). שכב על תמונות אלה ולנתח אותם עם ImageJ או כמתואר ב15. הערה: קביעת עיוותים צריכה להתבצע באופן שגרתי אך לא בהכרח על כל מדגם.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts%3A+a+collaborative+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li>
<li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+up%3A+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+nephrin%2C+podocin%2C+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li>
<li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li>
<li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8(2003).</li>
<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHS2%2C+encoding+the+glomerular+protein+podocin%2C+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li>
<li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+principles+and+uses+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396(2018).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li>
<li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המוצגת מאפשרת לחוקר לדמיין חלבונים תאיים, למשל, רכיבים פודוצין, נפרין וציטוסלטל, למשל, F-actin. בתוך פרוטוקול זה, תאי cos7 מוחצים משמשים כמודל לחקר האינטראקציה של חלבוני דיאפרגמה חתוכים עם F-actin. למרבה הצער, קווי תא podocyte מונצחים אינם מבטאים כמויות אנדוגניות מספיקות של חלבוני דיאפרגמה חתוכים19.
בשיטה זו, ניתן לדמיין חלבונים תאיים ברזולוציה ננומטרית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם: 1) עיגון מספיק של קבוצות חלבון אמ...

אלבומינוריה הוא פרמטר פונדקאי של סיכון קרדיווסקולרי ותוצאות שיבוש של מסנן גלומרולרי1. המסנן הגלומרולרי מורכב מאנדותל fenestrated, קרום המרתף גלומרולרי ואת הסרעפת חתך שנוצר על ידי podocytes. תהליכי כף רגל ראשוניים ומשניים של podocytes לעטוף סביב הקיר נימי של גלומרולום2. המבנה העדין של תהליכי כף הרגל נשמר על ידי חבילות actin קליפת המוח אשר משמשים גם עוגנים עבור חלבוני דיאפרגמה חריץ מרובים וחלבונים מתאם אחרים2. חלבון עמוד השדרה של הסרעפת נקרא נפרין ומתקשר באופן הומופילי עם מולקולות נפרין של פודוציטים מנוגדים. באמצעות חלבונים מתאם מגוונים, נפרין מקושר אקטין ציטוסקלטון2,3. מוטציות בגן קידוד הנפרין NPHS1 מובילות לתסמונת נפרוטית מהסוג הפיני4.
אחד החלבונים המקיימים אינטראקציה של nephrin הוא podocin, חלבון דמוי סיכת ראש של משפחת סטומטין3. פודוצ'ין מגייס את נפרין לרפסודות השומנים ומקשר אותה לציטוטוסלקטון5. Podocin מקודד על ידי הגן NPHS2. מוטציות NPHS2 להוביל לתסמונת נפרוטית עמידה בפני סטרואידים6.
כדי לדמיין ולמקם במשותף חלבונים מתאם actin, ניתן להשתמש בטכניקות כשל חיסוני. למרבה הצער, מחסום עקיפה של האור מגביל את הרזולוציה של מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונבנציונליים ל 200-350 ננומטר7. טכניקות מיקרוסקופיה חדשניות, למשל, דלדול פליטה מגורה (STED)8, מיקרוסקופיה לוקליזציה המופעלת על ידי צילום (PALM)9, מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי (STORM או dSTORM) או מיקרוסקופיית מחיקת מצב קרקע ואחריה החזרת מולקולה בודדת (GSDIM)9,10,11, לאפשר רזולוציה של עד כ 10 ננומטר. עם זאת, טכניקות אלה רזולוציה סופר דורשים מיקרוסקופים יקרים מאוד, כוח אדם מאומן היטב ולכן אינם זמינים במעבדות רבות.
מיקרוסקופיה הרחבה (ExM) היא טכניקה חדשנית ופשוטה המאפשרת הדמיה ברזולוציית על עם מיקרוסקופים קונבנציונליים והיא זמינה לקהילת מחקר גדולה12. במיקרוסקופיית הרחבת שימור חלבונים (proExM), מדגם העניין (תאים או רקמה) קבוע ומוכתם בפלואורופורים13. חלבונים בתוך המדגם מעוגנים אז בקובאליות על ידי מולקולה קטנה (6-(אקרילויל)חומצה הקסאנואית, succinimidyl אסתר, AcX) לתוך הידרוג'ל מתנפח13. באמצעות עיכול אנזימטי עם פרוטאינאז K (ProK), חלבונים ופלואורופורים שומרים על מיקומם היחסי בתוך הג'ל לאחר התרחבות13. לאחר נפיחות של הג'ל, המדגם מתרחב עד פי 4.5 (הרחבה נפחית פי 90) המוביל לרזולוציה רוחבית יעילה של כ 60-70 ננומטר (300 ננומטר / 4.5). שינויים בטכניקה זו יכולים אפילו לאפשר הרחבה של פי 10 (הרחבה נפחית של פי 1,000), מה שמגדיל את הרזולוציה של 20-30 ננומטר במיקרוסקופים קונבנציונליים14,15,16.
מבנים גלומרולריים של עכבר וכליות אדם כבר דמיינו באמצעות ExM17. בתוך נייר זה, אנו מציגים פרוטוקול proExM מפורט כדי לדמיין תמונות ברזולוציה סופר של F-actin ואת podocin חלבון מתאם actin בתוך תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי.

<table><tbody><tr><td>אקרילאמיד >99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3553-100G</td><td></td></tr><tr><td>6-((אקרילויל)אמינו)חומצה הקסאנואית, אסתר סוקסינימידיל, אקרילויל-X, SE</td><td>invitrogen</td><td>A-20770</td><td>חנות עד 4 חודשים</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Deckgl&auml; סר (משקפי כיסוי)</td><td>Engelbrecht</td><td>K12432</td><td>24x32 מ"מ #1.0</td></tr><tr><td>חותך דיאמונט</td><td>VWR</td><td>201-0392</td><td>לחיתוך החלקות הכיסוי</td></tr><tr><td>Guanidine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272-100G</td><td>8M ניתן לשמור מלאי ב-RT</td></tr><tr><td>Marten מברשת שיער</td><td>לאון הארדי</td><td>3 (770)</td><td></td></tr><tr><td>"Menzel" Deckgl&auml; סר (משקפי כיסוי)</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td><td>15654786</td><td>24x24 מ"מ #1.5</td></tr><tr><td>N,N'-Methylenbisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Objekttr&auml; ger UniMark</td><td>Marienfeld</td><td>703010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אקרילט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>408220</td><td>בדיקת טוהר&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td> צביעה <td>המיוצר בסדנת האוניברסיטה</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>ROTH</td><td>2367.1</td><td></td></tr><tr><td>לוחות תחתונים מזכוכית 6 בארות</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin-ExM 546&nbsp;</td><td>chrometra</td><td>לא זמין</td><td>1:40</td></tr><tr><td>אנטי פודוצין מיוצר בארנב</td><td>סיגמא</td><td>P-0372-200UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>חמור אנטי חזיר CF633</td><td>סיגמא</td><td>SAB4600129-50UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>עז אנטי ארנב 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11034</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>שרקן ניסיונות אנטי נפרין</td><td>Origene</td><td>BP5030</td><td>1:100</td></tr><tr><td><חזק>תוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>מיקרוסקופ</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AXIO Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>לא זמין</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

שיבוש המסנן הגלומרולרי המורכב מאנדותל גלומרולרי, קרום מרתף גלומרולרי ופודוציטים, גורם לאלבומינוריה. תהליכי כף הרגל Podocyte מכילים חבילות actin להיקשר חלבונים מתאם cytoskeletal כגון podocin. חלבוני מתאם אלה, כגון podocin, לקשר את עמוד השדרה של הסרעפת חריץ גלומרולרי, כגון nephrin, כדי cytoskeleton actin. לימוד הלוקליזציה והתפקוד של חלבונים פודוציטיים אלה ואחרים חיוני להבנת תפקידו של המסנן הגלומרולרי בבריאות ובמחלות. הפרוטוקול המוצג מאפשר למשתמש לדמיין אקטין, פודוצין ונפרין בתאים עם הדמיה ברזולוציית-על במיקרוסקופ קונבנציונלי. ראשית, תאים מוכתמים בטכניקת כשל חיסוני קונבנציונלית. כל החלבונים בתוך המדגם מעוגנים בקובאליות להידרוגל מתנפח. באמצעות עיכול עם חלבון K, חלבונים מבניים הםבקעו המאפשר נפיחות isotropical של הג'ל בשלב האחרון. דיאליזה של המדגם במים גורמת להרחבה של המדגם פי 4-4.5 וניתן לדמיין את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי, מה שמפחית רזולוציה פוטנציאלית של 70 ננומטר.

הרעיון והתזמון של פרוטוקול ProExM זה מתואר באיור 1. ביום החמישי, תאים חוצה קבועים ומוכתמים בנוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים לחלבון המעניין(איור 1A,B). ביום השישי, הטיפול ב-AcX מוביל להיווצרות קבוצות אמינים בכל החלבונים (כולל פלואורופורים)(איור 1A,B)12. לאחר פולמור של הידרוג'ל, קבוצות אמין אלה להיקשר covalently כדי הידרוג'ל (יום 6). לאחר פולמור ...

השיטה המוצגת מאפשרת הדמיה של חלבונים תאיים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרוסקופיית הרחבה המובילה לרזולוציה של 70 ננומטר על מיקרוסקופ קונבנציונלי.

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

פרוטוקול מיקרוסקופי הרחבה זה מאפשר לחוקר לדמיין חלבונים גלומרולריים ברזולוציה ננומטרית במיקרוסקופ קונבנציונלי. היתרון העיקרי של מיקרוסקופיית התרחבות הוא שהוא נגיש לקהילת מחקר גדולה. התחל על ידי ביצוע מרווחים לתא הג'לציה.חתוך מספר אחד ומספר 1.5 כיסוי זכוכית מחליק לתוך חמישה פסים מילימטר, באמצעות סכין יהלום. הנח שקופית זכוכית לתוך תא מכתים ומקם את פס החלקת הכיסוי מספר 1.5 על שקופית הזכוכית, כך שהם יוצרים ריבוע של 2.5 ס"מ. פיפט טיפה של מים מזוקקים כפולים לפינות הכיכר לדבוק פסים לכסות זכוכית להחליק אחד לשני אל מגלשת הזכוכית.המתן כ- 20 דקות כך שתעודות הכיסוי של המספר 1.5 מחוברות ביציבות. פיפטה טיפת מים על כל פס כיסוי מספר 1.5. מניחים ארבעה פסים כיסוי זכוכית מספר אחת להחליק על מספר 1.5 תגיות כיסוי.למכסה תא הג'לציה יש לעטוף כיסוי בסרט פרפין, תוך הימנעות מקפלי או לכלוך על הסרט. לטיפול בעיגון, הסירו את PBS מהתאים הויטראז' החיסוניים והוסיפו 250 מיקרוליטרים של חיץ עיגון לבאר ישירות על גבי כיסוי הזכוכית. דגירה את הצלחת במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.השאר את המצע בחושך באמצעות תיבה. לאחר הדגירה, להסיר את חיץ עיגון ולשטוף את החלקת הכיסוי פעם אחת עם 1.5 מיליליטר של PBS לכל באר. כדי להכתים סיבי אקטין, להפשיר פתרון פאלודין תואם EXM ולהדגיר אותו במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.בינתיים, להמיס אקרילט נתרן

imaging-podocytic-proteins-nephrin-actin-podocin-with-expansion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה אנו מתארים שיטה הנקראת פתולוגיית התפשטות, גרסה של מיקרוסקופ התפשטות, שבה דגימות הרקמה הקלינית מורחבות כימית באמצעות רשת פולימרים לבדיקה מיקרוסקופית של מבנים ננומטריים.

פתולוגיית הרחבה: שיטה להדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה של דגימות רקמה קליניות

שינויים ברמות הסידן התוך-תאיות בפודוציטים הם אחד האמצעים החשובים ביותר לשליטה בתפקוד הסינון של גלומרולים. כאן אנו מסבירים גישה בעלת תפוקה גבוהה המאפשרת זיהוי של טיפול בסידן בזמן אמת ופעילות תעלות יונים בודדות בפודוציטים של הגלומרולים הטריים שבודדו.

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

ננו הדמיה של דגימות רקמה קלינית יכול לשפר את ההבנה של פתוגנזה מחלה. הרחבת פתולוגיה (ExPath) היא גרסה של התפשטות מיקרוסקופ (Expath), שונה עבור תאימות עם דגימות רקמה קלינית סטנדרטית, כדי לחקור את תצורת הננו-סקאלה של biomolecules באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי עקיפה מוגבלת.

הדמיה nanoscopic של מקטעים רקמות האדם באמצעות הרחבה גופנית איזוטרופית

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

מוצגת כאן גרסה חדשה של מיקרוסקופ הרחבה (ExM), Magnify, המותאמת להרחבה של עד פי 11, תוך שימור מערך מקיף של מחלקות ביומולקולות, ותואמת למגוון רחב של סוגי רקמות. הוא מאפשר לחקור את התצורה הננומטרית של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלי עקיפה.

שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11

כתב יד זה מתאר פרוטוקול דו-שלבי ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מפיברובלסטים עוריים באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) ולאחר מכן התמיינות לפודוציטים.

יצירת פודוציטים שמקורם במטופל מביופסיות עור

מחקר זה מראה פרוטוקול מפורט לביצוע מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה בשלושה שלבי מחזור חיים במבחנה של טריפנוזומה קרוזי, הפתוגן האחראי למחלת צ'אגאס. אנו כוללים את הטכניקה האופטימלית עבור חלבונים ציטו-שלד ותיוג פאן-פרוטאום.

מיקרוסקופ הרחבה אולטרה-סטרוקטורלי בשלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופי של טריפנוזומה קרוזי

הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

למד הדמיית חלבונים גלומרולריים ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית הרחבה. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של nephrin, actin ו-podocin בדיוק של 70 ננומטר במיקרוסקופ רגיל.

הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה

גלה סרטונים נוספים